现代分子生物学技术在中国白酒研究与生产的应用研究

1、现代分子生物学技术在中国白酒研究与生产的应用摘 要传统白酒的发酵方式是作坊式的，其标志是固态或半固态方式有氧发酵并且辅以地缸或埋地式的发酵环境，因为发酵环境主要靠天然调控，因此在发酵初期的酒醅温度在萌芽时期的温度主要是依靠入窖时的初始室温决定，在发酵开始后再通过微生物在酒醅中繁殖代谢所产生的生物热有所调整，因此白酒酿造过程中国，从制曲到糖化再至发酵和贮存，整个过程中微生物的群落表现出极其复杂且动态的组合，从发酵初期到中期再到后期，发酵过程的微生物菌落的种类和数量不断地发生改变，这个动态的变化决定了白酒的产量和风味口感，在原料品质差异不大的前提下，微生物对风味起决定的作用。改革开放后，国家对白酒

2、酿造行业的现代化极为重视，为之建立了很多研究白酒的专科院校和大批的酿造专业研究人员和技术人员，随着科学对酿造微生物研究的深入以及传统白酒酿造主体微生物被科研人员深入分析，人们对于酿造的微生物从初期的复杂动态形式开始走向更为清晰的脉络，近几年随着生物科技的深度发展，利用分子生物学技术里进行菌种鉴别已经有取代培养皿染色鉴定和显微镜目视并通过菌种形态和生理生化特性个进行的鉴别模式。这标志着从传统发酵体系分离菌种培养并判定的方式已经向分子生物方向进行转变，虽然这个转变实施一个研究酿造微生物的重要转变方向，但同时在深入研究中，科研人员也发现了这些分子生物学研究途径的各种不足和问题，并且在不同研究方法间如

3、何搭配和组合从而实现应用效能的最大化，这点还需要更多的技术尝试和科学探讨，因此本论文尝试就当前用于中国白酒研究和生产的分子生物学的技术进行比较和探讨，并尝试就其应用问题和组合困难提出合理化的建议，这对于加强对分子生物学技术在酿造微生物中应用的研究的有效性，对于其良好实践效果的取得有着比较广泛的参考意义。关键词：分子生物学技术，微生物群落，白酒研究第1章 研究目的和意义世界酿酒界将蒸馏酒的品种分为六大类，分别是俄罗斯的伏特加、古巴的朗姆酒、荷兰的白兰地、英国的威士忌和金酒以及中国的白酒。中国白酒是我国特有的一种白酒，其酿造工艺与其他的五大类完全不同，而且有比其他五大类更为悠久的酿造历史。中国白酒

4、有六种特别标志的香型，目前市面上的白酒类型主要以浓香型白酒为主，占据全国将近70%的市场份额，而清香型白酒的归属类别只有10%，但无论是哪种香型的白酒，其核心工艺都比较相似，均是采用含有淀粉或者碳糖的原料，以酒曲中的微生物提供酿酒所需要的产糖、产酒精以及其他风味物质的各种酶类，经过蒸熟、糖化、发酵、蒸馏、贮存和勾兑共六个工序组合完成。在酿造细节上，因为不同酒型有当地不同的酿造风格，比如清香型白酒采用地缸和固体发酵，所以在发酵方面比浓香型白酒的发酵更受限制，而且固体发酵相对于半固体发酵和液体发酵对于粮食的消耗量更大，但同时清香型白酒其独特清爽无杂味的风味口感也是深受消费者喜爱的。传统白酒的发酵方

5、式是作坊式的，其标志是固态或半固态方式有氧发酵并且辅助地缸或埋地时的发酵环境，因为发酵环境主要靠天然调控，因此在发酵初期的酒醅温度在萌芽时期的温度主要是依靠入窖时的初始室温决定，在发酵开始后再通过微生物在酒醅中繁殖代谢所产生的生物热有所调整，因此白酒酿造过程中国，从制曲到糖化再至发酵和贮存，整个过程中微生物的群落表现出极其复杂且动态的组合，从发酵初期到中期再到后期，发酵过程的微生物菌落的种类和数量不断地发生改变，这个动态的变化决定了白酒的产量和风味口感，在原料品质差异不大的前提下，微生物对风味起决定的作用。改革开放后，国家对白酒酿造行业的现代化极为重视，为之建立了很多研究白酒的专科院校和大批的

6、酿造专业研究人员和技术人员，随着科学对酿造微生物研究的深入以及传统白酒酿造主体微生物被科研人员深入分析，人们对于酿造的微生物从初期的复杂动态形式开始走向更为清晰的脉络，近几年随着生物科技的深度发展，利用分子生物学技术里进行菌种鉴别已经有取代培养皿染色鉴定和显微镜目视并通过菌种形态和生理生化特性进行的鉴别模式。这标志着从传统发酵体系分离菌种培养并判定的方式已经向分子生物方向进行转变，虽然这个转变实施一个研究酿造微生物的重要转变方向，但同时在深入研究中，科研人员也发现了这些分子生物学研究途径的各种不足和问题，并且在不同研究方法间如何搭配和组合从而实现应用效能的最大化，这点还需要更多的技术尝试和科学

7、探讨，因此本论文尝试就当前用于中国白酒研究和生产的分子生物学的技术进行比较和探讨，并尝试就其应用问题和组合困难提出合理化的建议，这对于加强对分子生物学技术在酿造微生物中应用的研究的有效性，对于其良好实践效果的取得有着比较广泛的参考意义。第2章 研究方法与研究近况2.1研究方法本课题以白酒微生物的应用为研究主体，结合国内外学者的相关研究，重点分析现代分子生物学技术在白酒研究和生产中的应用。首先，分析分子生物学技术在微生物研究中的重要性。其次，详细分析各种分子生物学技术的应用。最后，总结分子生物学技术在白酒微生物研究中的重要意义。通过掌握酿酒过程中微生物发酵的全部过程，并且以所归纳的各种现代分子生

8、物学技术原理，详细总结分子生物学技术在白酒微生物应用中的国内外研究动态及发展趋势，以其具备足够条件对不同分子生物学技术在白酒研究与生产中的应用进行详细的阐述。2.2研究近况在白酒酿造方面的微生物研究数量上不少，在2018年相关的学术论文有489篇，2019年相关的学术论文有289篇，但是在白酒酿造方面进行现代分子生物学方面的研究比较少，比较典型的相关论文有：刘效毅在2012年发表的论文中采用了分子生物学与传统菌种分离培养技术相结合的方法，以组合方案的形式对白酒酿造中的高温大曲中的微生物群落进行分离鉴定；张守印在2008年发表的论文中就16SrDNA克隆文库对微生物群落的种群分析的可靠性方面进行

9、了分析，通过研究论文发现这种技术手段是可以检测出复杂菌种群落中的大比例菌群的，其 手段是通过克隆文库获得对象菌群的准确基因序列数据；陈玲在2013年发表的论文中对发酵大曲中微生物群落的具体组成进行了分析，其采用的是高通量测序法和16S rDNA克隆文库法联合组成的新方案，通过这种新方案对于群落的多样性和丰度都可以有所体现；张会敏在2009年发表的论文中分析了高温大曲和中温大曲在古井贡酒这种品种中的微生物群落多样性，其同样采用16S rDNA克隆文库的方法进行分子生物学的鉴别，并成功确认了这两种大曲中其主体发酵微生物的具体占比，并通过其差异性进行深度分析两种大曲中微生物群落差异的发酵因素；除了酒

10、曲外，个别研究人员还对发酵时候的窖泥进行了研究，比如汤斌在2008年发表的论文中采用了PCR扩增、序列同源分析联合16S rDNA克隆文库的多方案联合方法，对古井贡酒的发酵容器窖泥进行微生物群落的菌种鉴别分析；张霞在2014年也同样采用16S rDNA克隆文库方案对贵州酱香型白酒中的微生物群落进行序列分析，并成功将高占比菌群分离并鉴定其为地衣芽孢杆菌；王海燕在2009年发表的论文中，也是通过传统模式与分子生物学相结合的方式进行集中分析，其将PCR-DGGE、QPCR、HS-SPME-GC-MS技术与传统的微生物提取扩培的方案相结合，分析发现了在清香型白酒酒醅发酵的后期，其微生物菌落中的优势菌种

11、为乳杆菌。综合上述，在最近十年基于分子生物学在菌种鉴别方面的高速发展，相当部分的酿造微生物研究人员采用这些新技术并在白酒传统工艺生产中的酒醅、酒曲和窖泥中通过分子生物技术进行菌种鉴别，并从中鉴别出复杂白酒发酵微生物体系内的特征微生物和主体微生物菌属，在白酒微生物中采取类似的鉴别手段已经相当成熟了，但同时从文献研究中亦发现，分子生物学技术在白酒中的研究主要是替代传统微生物鉴别手段，其获得的结果主要以主体微生物居多，对于整个微生物群落的整体勾画和所有微生物菌落的比例鉴定，研究成果尚少，处于初级阶段。第3章 现代分子生物学技术在白酒研究中的分类3.1 五种联合的PCR技术当前在现代分子生物技术上涉及

12、到以PCR作为基本的技术主要有五种，分别是PCR-SSCP、PCR+荧光定量、PCR-RFLP、PCR克隆文库和PCR-DGGE五种；PCR技术是一种放大特定DNA片段的技术，可以将之看作是将特定DNA在生物体外进行复制到原本极为微量的DNA指数扩增子可以进行有效检测的地步，其采用的方式是聚合酶链反应。而现代分子生物技术在这个PCR的基本上，形成了以下五种可以用于白酒酿造微生物鉴定的技术。PCR-SSCP技术，SSCP俗称为单链构想多态性技术，其原理是DNA构象存在差别，并以这些差别作为检测点突变的手段来获得同样长度的DNA单链下的鉴别，根据构象的不同，因此单链构象中存在多态性，其在凝胶电泳中

13、不同核酸序列所迁移的速度是不同，因此就能够形成互相分离的条带，最终通过分离条带来通过标记的引物以DNA测序进行分析就可以得到被检测微生物的特征并进行鉴别；PCR+荧光定量技术，PCR的扩增过程需要极为谨慎，否则容易出现污染而数据失真，而在PCR过程中因为DNA扩增会产生荧光能量，所以若是对PCR的产物进行荧光检测，不仅仅可以对微生物核酸片段提高灵敏度，还能够对其产物进行定量分析，这样有利于提高DNA片段检测的特异性，PCR荧光定量技术的特异性高，自动化程度强是一种PCR技术的有效扩充；PCR-RFLP技术，RFLP是指限制性片段长度多态想扩增技术，其本质是PCR扩增后容易出现对应DNA片段过长

14、而导致分析结果的特异性降低，因此在扩增的同时以限制性酶切片的方式将处理后的扩增产物再次进行切割，并得到了不同长度的多条DNA的片段，因为不同的等位基因其酶切的位点完全不同，所以所得到的多段片段会因为不同的核酸种类而得到完全不同的多组DNA片段，最后再通过这些拍你但进行多样性差异性的分析，这样就能够得到更为准确的微生物群落信息，提高特异性；PCR克隆文库技术，PCR克隆文库技术可用于得出微生物群落中的优势菌群，其原理是首先进行PCR扩增，将扩增后的DNA片段再次导入载体，在将载体导入细胞，比如埃希氏大肠杆菌，通过微生物培养扩增后形成克隆的模式，在将对应载体的DNA进行提取，用限制性内切酶再次切割

15、成多条DNA片段后再次进行凝胶电泳确认，并从获取的信息中进行测序，就可以实现目标微生物准确信息的提取；PCR-DGGE技术，该技术是当前分子生物学分析中应用最广泛的手段，其特点是当进行分析时可以将整个微生物群落的结构整体进行分析，该技术不同于其他的PCR技术，可以整体地反映整个微生物群落所有菌种的鉴定，其设计核心是每个独立DNA中GC含量的比例和对应的熔解值均不同，DGGE通过在聚丙烯酰胺中形成变性梯度，并将特定PCR扩增片段进行凝胶电泳，因为GC含量高的变性晚，含量低的变性早，所以变性后的迁移速度也会有较大差异，在迁移完成后，将切段回收的DNA条带回收并和DGGE指纹图谱进行对照后就可以获取

16、整体微生物群落的完整信息。3.2 核酸探针原位杂交技术（FISH）核酸探针杂交技术根据被检测微生物群落中不同级别种群所具有的特异性的DNA序列，使用荧光标记的寡聚核苷酸判断作为探针，与该被检测微生物菌落中的DNA分子进行杂交通过比较杂交所产生的光斑或者条带来获得对应光密度测定下的定量结果，得出的结果会反映出对应微生物群落中有这个特异性片段的种群是否存在以及对应的丰度。正因为这种技术可以跟样本微生物进行原位杂交，所以在种群定量分信息和鉴定上有更为灵敏和快速的检测结果。目前这种技术主要用于环境中微生物的整体观察和鉴别。3.2磷脂脂肪酸（PLFA）技术磷脂脂肪酸是光谱微生物细胞膜的重要组成部分，其作

17、用主要是细胞膜的主动运输，除了个别古生生物细胞外，其他活体微生物的细胞膜中都会存在磷脂脂肪酸，该技术的机理是首先使用Bligh和Dyer法将细胞膜上的磷脂脂肪酸抽出，然后将这些抽取物进行GC-MS分析，从而获得PLFA的谱图，在分析方面，主要磷脂脂肪酸谱图的变化来完成对于监控微生物群落结构上所发生的变化，从而达到快速检测的目的。第4章 现代分子生物学技术在白酒研究和生产的实践 4.1 不同技术在白酒研究和生产中的优劣现代分子生物学技术在白酒研究中的应用有过很多不同技术和方向的尝试，当前从文献中归纳可知应用得最多的依然是PCR的组合技术，比如PCR基因文库和PCR-DGGE技术，主要是因为从PC

18、R衍生出来的多种组合技术在应用模式上已经有很成熟的实践经验，在白酒领域外的其他微生物群落鉴别中，这类组合PCR技术已经有过很多参考和经验，当白酒微生物研究人员在应用PCR组合技术时，完全不需要重新摸索，可以沿用其他前人的经验直接套用其方案执行。因此在选择不同技术时，其优劣性更多是集中在不同研究对象的特性上，在白酒研究和生产中的多个阶段有微生物群落的变化，不同阶段的微生物群落组成以及其对白酒的品质影响都各有不同，在前人的研究中，主要集中在大曲、窖泥和酒醅这三个方面。大曲的微生物因为生产的自然性，导致其中复杂性较高，而且无论是菌种类别和各种酶类种类都较多，因此在对菌群的分析中主要集中在微生物群落的

19、结果分析，采用较多的手段是PCR克隆文库，主要是因为这种技术可以通过特异片段后载入克隆细胞后可以通过内切酶的处理获得多个DNA片段，通过文库中的对照从而实现对目标微生物更准确的鉴定，对于大曲这种多菌种且多酶类的环境，相对比较合适而且准确性更高；而在窖泥的环境中，其微生物种类相对于大曲而言更为复杂，而且有相当部分的微生物并不参与白酒发酵的生化过程，因此所采用的技术手段更为多样，个别研究人员继续采用PCR克隆文库的方法去检测窖泥微生物，以确定其主体微生物和对应的定量判定。同时也有研究人员利用PCR-DGGE技术来检测不同时期的窖泥中微生物，通过对比微生物的多样性、近似性和丰度来判断复杂菌群中的优势

20、微生物；在酒醅方面，因为酒醅已经处于发酵期，其中早已有优势菌种酵母菌和其他比如酒精等抑制个别微生物生长繁殖的因素，因此酒醅中的微生物相对于大曲和窖泥而言更为单一，但是酒醅微生物在传统微生物提取扩培中存在挑战，即挑出扩培的菌种难以在培养皿环境中按照原来的菌落状态进行扩培，当脱离了酒醅环境中，不少优势菌种就开始退化甚至无法检出。因此继续采用PCR基因文库或者PCR-DGGE技术的方法有利于对酒醅微生物的鉴别和分析，因为在酒醅中优势微生物是极其明显的，但是酒醅阶段也是风味物质生成的重要阶段，所以主要鉴别优势菌种的PCR基因文库技术反而不太适应，部分研究人员在PCR基因文库技术的同时继续用PCR-DG

21、GE技术对酒醅中的其余优势菌种，比如部分真菌进行鉴别，并在整个酒醅发酵阶段就其菌群的比例和变化趋势与风味物质的生成进行相关性的分析，通过这种多样化的与研究发现了酒醅中细菌和真菌的多样性随着发酵的持续是会逐渐降低的，这是因为此时发酵已经处于中后期，酒醅中积累了大量的代谢产物还会抑制微生物菌群的继续繁殖。4.2 不同技术在白酒研究和生产中的搭配如前述，在白酒研究中现代分子生物技术可以避免传统微生物鉴别技术的短板，发挥其高特异性和快速准确的特征，有力地推动白酒微生物的深度研究，但同时因为PCR联合技术以及其他分子生物学技术本质需要更多的资本投入，所以在实际生产中，特别是传统的作坊式企业中，基本没有应

22、用的可能，因此研究人员在实际试验中会尝试多种分子技术搭配使用，比如在窖泥的微生物分析中先通过PCR基因文库进行优势菌种的分析，再通过DGGE的联合手段再次确认优势菌种的丰度和比例以及相关的构成变化。同时因为分子生物学技术的门槛较高，除了专业的酿造学院具备开展类似研究的高素质人才和高端仪器设备外，广大的白酒工业领域缺乏类似的条件，因此在实际运作中，研究人员也尝试在传统微生物鉴别和分子生物学技术中架上“桥梁”，从而实现两者在研究和分析上的过渡，并将其相关的技术进一步向生产领域下沉推广。第5章 现代分子生物学技术在白酒研究和生产应用的建议从过往的研究中可知，现代分子生物学技术中的PCR联合技术在白酒微生物分析的应用中已经有很多比较成功的案例，但是因为白酒发酵的各个阶段微生物菌落的变化复杂，所以当前仅有的研究成果还不能将不同白酒品种发酵中微生物群落的具体菌种类别和构成随发酵时间的变化一一发掘，这些工作还需要白酒研究人员继续在现代分子生物学技术领域开拓，同时类似的