应用人类全基因组芯片检测多药耐药白血病细胞株HL60／VCR与敏感

1、应用人类全基因组芯片检测多药耐药白血病细胞株HL-60VCR与敏感董宝侠，陈协群，王哲，梁蓉，白庆咸，黄高昇，张伟平，高广勋，韩冬梅【摘要】本研究利用基因芯片技能检测白血病多药耐药细胞株HL-60VR及其亲本细胞株差异基因表达谱，探究急性白血病多药耐药机制。本试验提取白血病细胞株HL-60及其多药耐药细胞株HL-60/VR的RNA，在反转录及体外转录历程中别离用生物素举行标识表记标帜，与Affyetrix公司人类全基因组芯片U133A杂交，用Affyetrix专用芯片扫描仪G2500AGeneArraySanner及irarraySuite、irDBTGenehipLIS、GenehipDT阐

2、发软件体系处置惩罚杂交信号猎取效果。效果表白：白血病细胞株HL-60及其耐药株HL-60/VR差异表现基因5507条，此中耐药细胞株中上调表达基因3100条，下调表达基因2407条；差异极明显性基因1040条，表达上调435条，下调605条，涉及与细胞生长运动及信号转导相干的基因。结论：多基因到场白血病细胞株的多药耐药机制，基因芯片技能是并行阐发多个基因、探究白血病多药耐药机制的有用要领。【关键词】基因芯片DifferenefGeneExpressinPrfilesbeteenHL-60/VRandHL-60ellsDetetedbyHuanGeneGenehipKeyrdsgenehip;u

3、ltidrugresistane;leukeia;HL-60;HL-60/VR基因芯片技能是比年来盘算机技能与生物学技能交织的产物。它通过利用微加工、微电子技能及其他相干技能，在固体外貌合成大量探针，利用生物大分子DNA的布局及其碱基配对原那么，实现对核酸分子中基因片断的正确、快速、大信息量的检测。化疗是治疗急性白血病的重要本领，而白血病细胞对化疗药物的原发或继发耐药是导致化疗失败的根底缘故原由。白血病的多药耐药征象是导致白血病复发及化疗失败的重要缘故原由。如今创造的肿瘤多药耐药机制重要涉及P-gpRPLRPBRP、GSH/GSTPK、Tp、DNA修复、多种凋亡相干基因和肿瘤细胞生存的表里情况

4、如pH、缺氧、温度变革。但白血病DR的机制并非单一，它错综庞大，以网络的情势彼此作用并彼此制约，且在临床上根据现有的DR机制接纳的逆转耐药方法并不非常有用。基因芯片为我们提供了举行不雅察、阐发差异种类基因与白血病耐药彼此干系的平台，为进一步探究肿瘤耐药机制、临床寻求有用逆转耐药要领制造了条件。我们选用Affyetrix公司人类全基因组芯片U133A8，对急性白血病耐VR细胞株与其亲本细胞株差异表达基因举行挑选和阐发。质料和要领药品长春新碱VR购自美国Siga公司，柔红霉素、阿糖胞苷购自Pharaia-Upjhn公司，拓朴替康为贵州汉方制药厂产物，米托蒽醌为四川升和制药产物，羟基喜树碱为黄石飞云

5、制药厂产物，足叶乙甙为连云港制药厂产物。以上药物用无菌生理盐水稀释、过滤并分装，-20保存备用。PgP单克隆抗体为Iunteh公司产物，TrizL为Gib公司产物，基因芯片HU-133A购自Affyetrix公司，其上包罗18000个明了的转录本。细胞造就急性髓细胞白血病细胞系HL-60系AT细胞株为本校病理教研室保存株。HL-60耐长春新碱VR细胞株HL-60VR由美国纽约erialSlan-Kettering癌症研究所引进，造就于含10灭活小牛血清的RPI1640造就液含青霉素、链霉素各0.1U/L中，置于52、饱和湿度、37造就箱中悬浮造就。2-3天换液1次。HL-60VR细胞造就液中V

6、R浓度为250ng/l，实行所用细胞均为分开药物驯化2周后的对数生恒久细胞。HL-60VR上风克隆的有限稀释法选择调解HL-60VR细胞浓度至5103l，将此悬液经100倍稀释，即为50细胞毫升；再将50细胞毫升的细胞悬液经5倍稀释，即为10细胞毫升；末了将10细胞毫升的细胞悬液经2倍稀释，即为5细胞毫升。将3种稀释好的细胞悬液别离接种于96孔板中，每孔加液0.1l，然后放入造就箱内造就。HL-60VR细胞株的体外药物敏感试验接纳TT细胞毒实行法。比拟组为HL-60细胞，处置惩罚组为HL-60/VR，调解细胞浓度为2104l，按每孔100l，接种于96孔板，37、52孵育留宿，越日参加含差异浓

7、度药物的造就液100l。化疗药物别离以1ng/l、3.2ng/l、10ng/l、32ng/l、100ng/l、320ng/l、1000ng/l、3200ng/l、10000ng/l、32000ng/l浓度分为10组，每组设4个平行孔。加药后造就72小时，每个孔参加TT(5g/L)20l，继承孵育4小时，离心，去上清，每孔参加150l二甲亚砜DS，用平板振荡仪振荡10分钟，在酶联免疫检测仪测定A490n值，并盘算细胞存活率(处置惩罚组A490n/比拟组A490n100)，实行重复3次，绘制剂量效应曲线，求出半数按捺剂量(I50)。耐药指标接纳逆转倍数和相对逆转率。细胞周期的检测以2104/l密度

8、将对数生恒久细胞HL-60细胞及HL-60/VR(脱药2周后)接种于6孔板，别离于48小时后网络细胞细胞数约1106，用预冷的PBS洗2次，离心去上清后，参加1lPBS和2l无水乙醇结实留宿，参加DNA-Prepstain染液染色后，用ELITEESP流式细胞仪Fulter公司检测各组细胞的荧光强度，每份样品检测约5000细胞，用DNAultiyle软件Bekanulter举行统计学阐发，得到各个组细胞周期时相。P170卵白表达的esternblt检测按分子克隆要领，别离提取HL-60细胞及HL-60/VR细胞总卵白，经紫外分光光度法定量后，各组取等量总卵白举行8SDSPAGE电泳并转移到PV

9、DF膜上，膜用关闭液blkingbuffer(TBS+1%BSA+0.05%Teen20)关闭1小时，参加Pgp(1100稀释)单克隆抗体4留宿，越日37复温1小时，TBST洗膜，兔抗小鼠IgG-过氧化物酶二抗室温孵育1小时，TBS洗膜后DAB显色。细胞内柔红霉素浓度的测定实行分为2组:HL-60细胞组和HL-60/VR细胞组;调解各组细胞浓度为1106/l，同时参加DNR至终浓度为10g/L，60分钟后参加等体积预冷的PBS以停顿细胞代谢，用冷PBS洗涤2次，立即用流式细胞仪测定细胞内DNR被引发的相对荧光强度，引发波长为488n，发射波长为575n，以荧光恣意单元的对数值表现DNR浓度。H

10、L-60VR及其亲本细胞株差异基因表达谱基因芯片技能的研究用TrizL试剂别离提取HL-60及HL-60/VR细胞的总RNA，并检测其质量浓度及A260280值。根据Affyetrix公司要领举行反转录、体外转录同时举行生物素标识表记标帜合成RNA探针、基因芯片杂交、洗脱、染色和检测。芯片扫描所得数据用AffyetrixirarraySuitesftare5.0举行盘算和处置惩罚。统计学阐发组间比力接纳t查验。效果HL-60VR上风克隆的形成细胞造就1周摆布，96孔板孔中即形成较大克隆，待克隆长至孔中造就液体积的13后将细胞转种于24孔造就板扩大造就。细胞甩片并举行瑞氏-姬姆萨染色，可见挑选出

11、的HL-60VR细胞体积显着大于HL-60细胞，胞形不规矩，核仁更为显着图1，2。HL-60VR体外药物敏感试验HL-60/VR细胞对多种化疗药物的I50值显着大于HL-60细胞耐药倍数为7-251.2。逆转服从的凹凸与化疗药物种类有关，此中以DNR、TPT的耐药倍数较高附表。细胞周期的检测流式细胞仪检测表现，HL-60细胞重要聚拢于S+G2期，而其耐VR细胞重要聚拢于G1期图3、4。esternblt检测esternblt检测表现，HL-60/VR细胞株高表达P170糖卵白，而HL-60细胞株未见表达P170糖卵白图5。HL-60/VR细胞内DNR的积蓄HL-60细胞和HL-60/VR细胞内

12、DNR浓度差异很大，前者积蓄本领强，细胞内DNR均匀荧光强度为12.1，后者积蓄本领低，细胞内DNR均匀荧光强度为8.69P0.05)(图6，7)。基因芯片对HL-60VR及其亲本细胞株差异表达基因的生物信息学阐发利用基因芯片HU-133A对来自HL-60、HL-60/VR细胞株举行检测的效果是：在统共22283个探针池中，HL-60组检测到了10707个，占总数的48.1；HL-60/VR组检测到了11248个，占50.5。进一步运用Affyetrix公司提供的阐发软件AffyetrixirarraySuitesftare5.0对两个样品的芯片检测所得数据举行处置惩罚，效果创造：与HL-60

13、细胞株比，HL-60/VR细胞株检测到有3058个基因表达上调，此中上调倍数大于2倍的有435个；表达下调的基因共有696个，此中有605个基因的下调倍数大于2，它们别离是与细胞分化、凋亡等生长运动相干的调治因子及信号转导相干基因。基因表达谱的散点图见图8。图中的每一个点代表1个基因，X轴和Y轴别离代表基因在HL-60细胞中和在HL-60/VR细胞中表达的信号强度。没有差异表达的基因漫衍在以管家基因平衡后的歪线四周，阔别歪线的为差异表达上调或下调的基因及阳性比拟。在上述的差异表达基因中，芯片ID号为39729-atGenBank号为L19185的基因NKEFB，在HL-60/VR细胞株中表达程

14、度除dr1外其上调最为明显与HL-60细胞株比拟上调了335倍。白血病的多药耐药是一种庞大的多基因相干征象1-3，有关其分子机制仍旧不是很明晰。针对多药耐药相干基因如dr1所接纳的逆转耐药方法如今经临床证明仍不克不及有用办理耐药题目。探求新的耐药相干基因，展现耐药机理，进而生长新的逆转耐药要领，这无疑黑白常需要的。本实行诱导并维持HL-60/VR细胞系的耐药性，TT法测定其耐药倍数，esternblt法断定P170分子的存在，流式细胞仪断定P170分子泵的成效，比力白血病细胞HL-60和长春新碱耐药细胞HL-60VR二者在细胞周期上的差异，明白耐药细胞株的耐药特性。由于传统挑选差异成效基因的要领如消减杂交、差示PR等具有挑选基因有限、假阳性率高等缺点，以是我们选择了Affyetrix公司提供的人类全基因组芯片U133A，高通量、平行阐发了髓系白血病细胞株HL-60及其耐药细胞株HL-60/VR，并通过比对