应用DNA微阵列技术研究三氧化二砷对RPMI 8226细胞的作用

1、应用DNA微阵列技能研究三氧化二砷对RPMI 8226细胞的作用王梦昌，刘陕西，刘兴隆【关键词】三氧化二砷摘要目的：应用DNA芯片技能研究三氧化二砷对多发性骨髓瘤细胞株RPI8226的作用。要领：接纳包罗4096小我私家类基因的DNA表达谱芯片，检测三氧化二砷作用于RPI8226细胞24h前后其基因表达的变革。结果：在RNA程度上，273个基因的表达产生了显着改变，此中121个基因表达上调，152个基因表达下调。结论：三氧化二砷可引起RPI8226细胞株一系列基因表达的改变。ZFYVE16、TXNIP及ALK1基因大概与RPI8226细胞的分化与凋亡严密相干。关键词三氧化二砷;DNA微阵列;多

2、发性骨髓瘤hangesfgeneexpressinprfilefultipleyelaelllineRPI8226treatedbyarsenitrixideKEYRDSarsenitrixide;DNAirarray;ultipleyela多发性骨髓瘤ultipleyela,是一种浆细胞恶性增殖性疾玻由于瘤细胞的增殖比例很低及多药耐药的形成，如今临床治疗该病仍非常困难，迄今为止尚无根治的要领。比来的临床资料表现，三氧化二砷对有必然的治疗结果，且无严峻的毒副作用1,2。为探寻三氧化二砷治疗的作用机制，本实行应用DNA微阵列技能研究三氧化二砷作用于细胞株后对其基因网络的调控作用。1质料与要领1.

3、1质料1三氧化二砷，购自中国药品公司，样品溶于RPI1640造就基美国Gib公司产物，灭菌分装备用，存储浓度为35g/L，利用时稀释为事情浓度2l/L。2RPI8226细胞，为人类细胞株，由西安交通大学第一病院血液中央提供。1.2细胞造就取RPI8226细胞按1105/l浓度别离接种于含及不含2l/L三氧化二砷的奇怪RPI1640造就基中内含10%小牛血清、1l/L谷氨酰胺、1l/L丙酮酸、100U/l青霉素、100U/l链霉素，于37、5%2造就箱中造就24h后网络细胞。1.3总RNA的提取根据TRIzlReagent美国Gib公司产物说明书举行操纵，提取RPI8226细胞总RNA，接纳li

4、gtexRNAidiKit荷兰QIAGEN公司产物纯化RNA，应用RNA电泳及分光光度仪测定光密度ptidensity,D值，盘算D260/D280值以断定RNA质量。1.4探针标识表记标帜按美国Bistar公司芯片杂交试剂盒说明书操纵。别离等量混淆未利用三氧化二砷干预的RPI8226细胞总RNA及已利用三氧化二砷干预24h后的RPI8226细胞总RNA，各提取50g逆转录合成DNA。接纳荧光染料y3dTP标识表记标帜未利用三氧化二砷干预的RPI8226细胞DNA，y5dTP标识表记标帜已利用三氧化二砷干预24h后的RPI8226细胞DNA，S200纯化柱纯化DNA。1.5DNA微阵列制备DN

5、A微阵列包罗4096个基因DNA上海博星基因芯片提供，型号BistarH40s，包罗癌基因、抑癌基因、细胞信号转导基因、凋亡相干基因及阴性比较等。接纳通用引物举行多聚酶链反响plyerasehainreatin,PR扩增。利用美国artesian公司的artesian点样仪及美国Telehe公司的硅烷化玻片举行点样。玻片经水合、枯燥、紫外线交联后，别离接纳2g/L十二烷基硫酸钠sdiuddeylsulfate,SDS、水和2g/L硼氢化钠溶液处置惩罚10in，晾干备用。1.6杂交及洗涤DNA微阵列在95水浴中变性2in，混淆探针在95水浴中变性30s，将混淆探针加于DNA微阵列上，42杂交16

6、18h，按挨次利用2氯化钠/柠檬酸钠sdiuhlride/sdiuitrate,SS缓冲液加2g/LSDS、0.1SS加2g/LSDS、0.1SS洗涤10in后，室温晾干。1.7基因表达谱检测与阐发接纳SanArray4000扫描仪美国GeneralSanning公司产物扫描DNA微阵列，GenePixPr3.0软件阐发y3和y5这两种荧光信号的强度和比值。经两种波长扫描得到的强度值别离代表y3和y5的数值，盘算每个点y3/y5的比值。2结果2.1DNA微阵列的质量尺度操纵BistarH40s表达谱DNA微阵列的质量尺度：有96个管家基因阳性比较和20个内参基因必需为阳性，16个植物基因阴性比

7、较和16个点样液空缺比较必需为阴性。本实行结果完全切合上述条件，说明实行无污染且检测体系正常。2.2差异表达基因先将全部数据的远景值与配景值相减，得出y3、y5标识表记标帜的强度值，将全部200的强度值用200代替。根据总数为n的有用基因selet值1，y3、y5标识表记标帜的强度值皆200，大概此中1项800y5/y3比值的天然对数值InRiIny5/y3，以Ri值在0.110的有用基因作为均一化根据，盘算这些基因y5/y3比值天然对数的均匀值，即均一化nralizatin系数。将全部数据项的y3标识表记标帜强度值乘均一化系数，得出调解后的y3。盘算全部基因y5/y3的比值，列出比值2或0.

8、5的数据，从中挑选出具有雷同GeneID的数据，在与两种探针杂交时皆表示出必然的差异，且上下调趋势同等。根据以上挑选尺度，RPI8226细胞在三氧化二砷处置惩罚前后y5/y3的比值2或0.5，且同一基因两个重复点表达均有雷同变革的共有273个，此中表达上调的基因有121个，表达下调的基因有152个。见表1、2，图1、2。表1三氧化二砷干预后RPI8226表达上调基因略Table1UpregulatedgenesinRPI8226ellsaplesafterarsenitrixideinterventin表2三氧化二砷干预后RPI8226表达下调基因略Table2Dnregulatedgenes

9、inRPI8226ellsaplesafterarsenitrixideinterventin图1y5、y3荧光标识表记标帜三氧化二砷干预和未干预RPI8226细胞样品叠加图略Figure1Superpsitinapsfy5andy3labeledRPI8226ellsaplestreatedithandithutarsenitrixide图2三氧化二砷干预与未干预RPI8226细胞样品y5/y3比值散点图略Figure2Satterdiagrafy5/y3ratisinRPI8226ellsaplestreatedithandithutarsenitrixide3讨论本研究应用DNA表达谱芯

10、片技能检测三氧化二砷未干预及干预24h后RPI8226细胞的基因表达差异，探寻三氧化二砷治疗的机制。实行结果表现，在4096个基因中差异表达基因273个，此中上调基因121个，下调基因152个，这些基因的成效涉及细胞生命运动的各个方面，如信号转导、卵白质合成、免疫、代谢、DNA合成及细胞周期等，此中有些基因的成效不详。由于基因的表达受网络式调控，各个基因之间的表达是互相影响的，因此三氧化二砷干预后各基因的表达既有上调，又有下调。本实行中，多个与信号转导相干基因的表达下调。如活化素受体样激酶ativinreeptrlikekinase1,ALK1基因是转化生长因子transfringgrthfa

11、tr,TGF受体家属成员，重要表达于内皮细胞，诱导Sad1/5磷酸化而使内皮细胞产生增殖和迁徙11，促进肿瘤生长。肿瘤血管天生时，ALK1表达增高。本研究结果表现，三氧化二砷干预24h后，ALK1基因表达显着下调，提示三氧化二砷可按捺肿瘤血管的增殖。YES1是一种肉瘤病毒基因，位于染色体18p11.32，编码与细胞膜相干的酪氨酸卵白激酶，在肿瘤细胞中过分表达12，经三氧化二砷作用后其表达程度低落。本实行中，TXNIPthiredxininteratingprtein基因表达的落落最为明显。TXNIP编码TXNIP卵白质，到场构成TXN通路，此通路存在于细胞的多个部位包罗细胞质和线粒体，TXNI

12、P可与TXN精细结合，按捺其通过尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸nitinaideadeninedinuletidephsphate,NADPH氧化作用淘汰巯基群的本领13。经三氧化二砷干预后，TXNIP基因表达的低落可导致巯基群淘汰，从而低落线粒体内跨膜电位并激活aspase3酶，开放线粒体膜通透性转运孔，开释线粒体内活性氧及细胞色素，激活半胱天冬氨酸酶，从而诱导细胞的凋亡14。总之，本实行中创造的差异基因，为进一步研究三氧化二砷治疗的分子机制提供了详细的线索，尤其是ZFYVE16、TXNIP及ALK1基因表达的改变大概在RPI8226细胞的分化及凋亡中起到非常紧张的作用，值得进一步研究。参考文献

13、1DaltnS.Targetingtheithndria:anexitingneapprahtyelatherapy.linanerRes,2002,8(12):36433645.2AadriS,FenauxP,LudigH,etal.Usefarsenitrixideinhaeatlgialalignanies:insightintthelinialdevelpentfanvelagent.urredRespin,2022,21(3):403411.3atsudaS,RuaultJ,agaudJ,etal.InsearhfafuntinfrtheTIS21/P3/BTG1/TBfaily.FEBSLett,2001,497(23):6772.7SeetLF,Hng.Endfin,anendsalFYVEdainprtein.JBilhe,2001,276(45):4244542454.10IabuhiK,LiB,assaHF,etal.Stiulatinfp53ediatedtransriptin