第15章 免疫细胞功能检测技术

1、第十五章第十五章 免疫细胞功能检测技术免疫细胞功能检测技术第一节第一节 淋巴细胞的功能检测淋巴细胞的功能检测 淋巴细胞功能测定可分为体内实验和体外淋巴细胞功能测定可分为体内实验和体外实验。体内实验主要是间接了解淋巴细胞对实验。体内实验主要是间接了解淋巴细胞对抗原、半抗原或有丝分裂原的应答反应；体抗原、半抗原或有丝分裂原的应答反应；体外实验主要包括淋巴细胞对抗原或有丝分裂外实验主要包括淋巴细胞对抗原或有丝分裂原刺激后的增殖反应、细胞毒性试验及淋巴原刺激后的增殖反应、细胞毒性试验及淋巴细胞分泌产物的测定细胞分泌产物的测定 淋巴细胞淋巴细胞T T细胞（负责细胞免疫功能）细胞（负责细胞免疫功能）B B

2、细胞（执行体液免疫功能）细胞（执行体液免疫功能）NKNK细胞（非特异性免疫作用）细胞（非特异性免疫作用） 一、一、T细胞功能的检测细胞功能的检测T T细胞增殖试验细胞增殖试验T T细胞分泌功能测定细胞分泌功能测定T T细胞介导的细胞毒试验细胞介导的细胞毒试验体内试验体内试验（一）（一）T T淋巴细胞增殖试验淋巴细胞增殖试验1. 1. 原理：原理：淋巴细胞淋巴细胞DNADNA合成合成分化分化母细胞母细胞刺激物刺激物细胞变大细胞变大细胞浆扩大细胞浆扩大空泡空泡核仁明显核仁明显核染色质疏松核染色质疏松 未转化和转化淋巴细胞的形态特征未转化和转化淋巴细胞的形态特征转化的淋巴细胞转化的淋巴细胞未转化的淋

3、巴细胞未转化的淋巴细胞淋巴母细胞淋巴母细胞 过渡型过渡型细胞大小细胞大小( (直径直径m)m) 12122020121216166 68 8核大小、染色质核大小、染色质增大、疏松增大、疏松增大、疏松增大、疏松不增大、密集不增大、密集核仁核仁清晰、清晰、1 14 4个个有或无有或无无无有丝分裂有丝分裂有或无有或无无无无无胞质、着色胞质、着色增多、嗜碱增多、嗜碱增多、嗜碱增多、嗜碱极少、天青色极少、天青色浆内空泡浆内空泡有或无有或无有或无有或无无无伪足伪足有或无有或无有或无有或无无无2. 2. 淋巴细胞转化的刺激物淋巴细胞转化的刺激物非特异性刺激物：非特异性刺激物： PHA -TPHA -T细胞细

4、胞 ConAConA -T -T细胞细胞 PWM -TPWM -T、 B B细细胞胞 LPS -BLPS -B细胞细胞特异性刺激物：特异性刺激物： 异种抗原异种抗原 同种组织抗原同种组织抗原 3. 3. 检测方法检测方法 形态法：刺激物形态法：刺激物 淋巴细胞（淋巴细胞（4-64-6天）天） 母细胞母细胞化化 同位素法：同位素法：PHA PHA 淋巴细胞（淋巴细胞（54h54h） DNADNA合成期合成期 + + 3 3HTdRHTdR掺入掺入 收集细胞收集细胞 检测检测射线射线 测定细胞内的测定细胞内的3H3HTdRTdR（1 1）形态学检查法）形态学检查法%100胞数转化和未转化的淋巴细转

5、化的淋巴细胞数转化率方法学评价：方法学评价：优点：形态学方法简便易行，普通光优点：形态学方法简便易行，普通光学显微镜便能观察结果，适于基层实验学显微镜便能观察结果，适于基层实验室应用。室应用。缺点：是依靠肉眼观察形态学变化，缺点：是依靠肉眼观察形态学变化，判断结果易受主观因素影响，重复性和判断结果易受主观因素影响，重复性和准确性较差。准确性较差。 培养液3H-TdRPHA淋巴细胞全血分层液离心过滤测量放射性（2 2）3H-TdR3H-TdR掺入法掺入法优点：优点：3H-TdR3H-TdR掺入法敏感性高，客观性掺入法敏感性高，客观性强，重复性好。强，重复性好。缺点：但需一定设备条件，同时还存在缺

6、点：但需一定设备条件，同时还存在放射性核素污染问题。放射性核素污染问题。均值对照孔A均值试验孔A570nm570nmSI 培养液3H-TdRPHA淋巴细胞全血分层液离心过滤测量放射性MTT测吸光度(3) MTT (3) MTT 比色法比色法( (二二) T) T细胞分泌功能测定细胞分泌功能测定 体外培养的体外培养的T T细胞经各种丝裂原或抗原刺细胞经各种丝裂原或抗原刺激后激后, ,分泌各种细胞因子分泌各种细胞因子, ,可借助免疫学、细胞可借助免疫学、细胞生物学及分子生物学技术分别检测细胞因子含生物学及分子生物学技术分别检测细胞因子含量、生物学活性或基因表达水平，以反映量、生物学活性或基因表达水

7、平，以反映T T细细胞功能。胞功能。 （三）（三）T T细胞介导的细胞毒试验细胞介导的细胞毒试验1.1.原理：原理：靶细胞抗原靶细胞抗原T T细胞细胞观察杀伤活力观察杀伤活力致敏致敏CTLCTL靶细胞靶细胞形态学方法：淋巴细胞形态学方法：淋巴细胞+ +肿瘤细胞肿瘤细胞 计数计数残留肿瘤细胞残留肿瘤细胞2.2.方法方法意义：意义： 肿瘤患者肿瘤患者CTLCTL杀伤肿瘤细胞的能力杀伤肿瘤细胞的能力 图图15-2 T15-2 T细胞细胞毒试验示意图细胞细胞毒试验示意图靶细胞51Cr洗涤去除游离的51Cr效应细胞测量上清液中释放的51Cr混合培养4-6小时5151CrCr释放法释放法( (四四) )

8、体内试验体内试验特异性抗原皮肤试验特异性抗原皮肤试验PHAPHA皮肤试验皮肤试验 二、二、B细胞功能检测细胞功能检测B B细胞增殖能力的试验细胞增殖能力的试验溶血空斑试验溶血空斑试验B B细胞抗体形成功能的检测细胞抗体形成功能的检测体内试验体内试验( (一一)B)B细胞增殖能力的试验细胞增殖能力的试验抗抗IgMIgM细菌脂多糖细菌脂多糖SACSAC的的SPASPAB B细胞增殖细胞增殖形态学形态学3 3H HTdRTdR掺入法掺入法( (二二) ) 溶血空斑试验溶血空斑试验1. 1. 原理：原理：2. 2. 方法学：方法学：经典溶血空斑形成试验经典溶血空斑形成试验被动溶血空斑试验被动溶血空斑试

9、验 3 3临床应用与评价临床应用与评价溶血空斑试验主要用于测定药物和溶血空斑试验主要用于测定药物和手术等因素对体液免疫功能的影响手术等因素对体液免疫功能的影响评价免疫治疗或免疫重建后机体产评价免疫治疗或免疫重建后机体产生抗体的能力。生抗体的能力。 ( (三三) ) B B细胞抗体形成功能的检测细胞抗体形成功能的检测 酶联免疫斑点法酶联免疫斑点法1.原理：原理：2 2应用与方法学评价：应用与方法学评价：该方法既可检测抗体分泌细胞，又可检该方法既可检测抗体分泌细胞，又可检测抗体分泌量。测抗体分泌量。优点：优点：稳定、特异、抗原用量少；稳定、特异、抗原用量少；可同时检测不同抗原诱导的不同抗体分泌，并

10、可定可同时检测不同抗原诱导的不同抗体分泌，并可定量；可检测组织切片中分泌抗体的单个细胞。量；可检测组织切片中分泌抗体的单个细胞。( (四四) )体内试验体内试验体内抗体产生的特异性抗原有白喉类毒素、体内抗体产生的特异性抗原有白喉类毒素、破伤风类毒素、多价肺炎链球菌菌苗等。破伤风类毒素、多价肺炎链球菌菌苗等。将适量抗原皮下或肌肉注射免疫，并于免疫将适量抗原皮下或肌肉注射免疫，并于免疫前及免疫后前及免疫后1 1周、周、2 2周、周、3 3周分别采血，分离血周分别采血，分离血清，测定受检者免疫前后相应抗体的效价，判清，测定受检者免疫前后相应抗体的效价，判断受检者体内断受检者体内B B细胞的功能。细胞

11、的功能。染色计数染色计数离心取上清离心取上清测测LDHLDH或或AKPAKP离心取沉淀离心取沉淀测活细胞荧光测活细胞荧光测发光强度测发光强度测测CPMCPM值值形态法形态法酶释法酶释法荧光法荧光法同位素法同位素法化学发光法化学发光法三、三、NK细胞活性测定细胞活性测定靶靶细细胞胞溶溶解解常用靶细胞常用靶细胞: : K562细胞株第二节第二节 吞噬细胞功能检测技术吞噬细胞功能检测技术 按其形态大小分为两类：按其形态大小分为两类：大吞噬细胞大吞噬细胞单核单核- -吞噬细胞系统吞噬细胞系统小吞噬细胞小吞噬细胞中性粒细胞中性粒细胞吞噬细胞的功能：吞噬细胞的功能： 趋化趋化 吞噬吞噬 胞内杀灭作用胞内杀

12、灭作用 一、中性粒细胞功能的检测一、中性粒细胞功能的检测 细胞趋化功能的检测细胞趋化功能的检测 吞噬和杀菌功能的检测吞噬和杀菌功能的检测( (一一) ) 细胞运动功能细胞运动功能趋化功能检趋化功能检测测1.1.原理：原理：2. 2. 方法学：方法学：琼脂糖平板法琼脂糖平板法 滤膜渗透法（滤膜渗透法（Boyden 小室法）小室法）( (二二) )吞噬和杀菌功能测定吞噬和杀菌功能测定 1 1显微镜检查法：显微镜检查法：100(%)计数的白细胞数吞噬细菌的白细胞数吞噬率100(%)计数的白细胞数数胞内含着染菌体的细胞杀菌率2. 2. 溶菌法溶菌法100min0min9060301(%)）菌落数菌落数

13、或、作用（杀菌率NBTNBT还原试验还原试验 原理：原理：N-N-C + H+N=N-R-N-NH2C N=NH四氮唑基（淡黄色）四氮唑基（淡黄色）甲甲chan（紫黑色）（紫黑色）3 3NBTNBT还原试验还原试验 中性粒细胞中性粒细胞NBTNBT甲撍颗粒沉积于胞质中甲撍颗粒沉积于胞质中二、巨噬细胞功能检测二、巨噬细胞功能检测( (一一) )炭粒廓清试验炭粒廓清试验 正常小鼠肝中枯否细胞可吞噬清除正常小鼠肝中枯否细胞可吞噬清除90%90%炭粒，脾巨噬细胞约吞噬清除炭粒，脾巨噬细胞约吞噬清除10%10%炭粒。据炭粒。据此给小鼠定量静脉注射印度墨汁此给小鼠定量静脉注射印度墨汁( (炭粒悬液炭粒悬液

14、) )，间隔一定时间反复取静脉血，测定血中炭粒间隔一定时间反复取静脉血，测定血中炭粒的浓度，根据血流中炭粒被廓清的速度，判的浓度，根据血流中炭粒被廓清的速度，判断巨噬细胞的功能。断巨噬细胞的功能。( (二二) )吞噬功能检测吞噬功能检测 巨噬细胞对颗粒性抗原物质具有很强的巨噬细胞对颗粒性抗原物质具有很强的吞噬功能，常用鸡红细胞吞噬功能，常用鸡红细胞(CRBC)(CRBC)、白色念珠、白色念珠菌、酵母细胞等作为吞噬颗粒，用斑蟊敷贴菌、酵母细胞等作为吞噬颗粒，用斑蟊敷贴法收集人巨噬细胞或从腹腔渗出液获得鼠巨法收集人巨噬细胞或从腹腔渗出液获得鼠巨噬细胞。噬细胞。 ( (三三) )巨噬细胞溶酶体酶的测

15、定巨噬细胞溶酶体酶的测定1 1酸性磷酸酶的测定酸性磷酸酶的测定 硝酸铅法硝酸铅法 偶氮法偶氮法2 2非特异性酯酶的测定非特异性酯酶的测定 常用常用-萘醋酸法萘醋酸法( (四四) ) 细胞毒作用测定细胞毒作用测定 用用IFN-IFN-激活小鼠巨噬细胞，观察其激活小鼠巨噬细胞，观察其对对125125I-UdRI-UdR标记的标记的DBA/2DBA/2小鼠肥大细胞瘤小鼠肥大细胞瘤P815P815的杀伤活性。的杀伤活性。( (五五) ) 巨噬细胞促凝血活性测定巨噬细胞促凝血活性测定 激活的巨噬细胞可产生一种与膜结合激活的巨噬细胞可产生一种与膜结合的凝血活性因子，加速正常血浆的凝固，的凝血活性因子，加速

16、正常血浆的凝固，为此取已经为此取已经3737预温的正常兔血浆和预温的正常兔血浆和CaClCaCl2 2混合液，加入经粘附有单层巨噬细胞的试混合液，加入经粘附有单层巨噬细胞的试管中，移置管中，移置3737，即时记录血浆凝固时间。，即时记录血浆凝固时间。反映机体免疫功能状态。反映机体免疫功能状态。肿瘤、免疫缺陷病等疾病的诊断和疾病预肿瘤、免疫缺陷病等疾病的诊断和疾病预后监测。后监测。组织器官移植后对受者的细胞免疫学功能组织器官移植后对受者的细胞免疫学功能监测则有利于排斥反应的早期发现，以便监测则有利于排斥反应的早期发现，以便及时采取有效措施。及时采取有效措施。第三节第三节 免疫细胞功能检测的临床应

17、用免疫细胞功能检测的临床应用思考题思考题1.1.T T细胞功能检测内容有哪些？细胞功能检测内容有哪些？2.2.什么是什么是T T细胞增殖试验的原理、刺激物及方法细胞增殖试验的原理、刺激物及方法学？学？3.3.何谓何谓T T细胞介导的细胞毒试验的原理和方法学？细胞介导的细胞毒试验的原理和方法学？4.4.何谓结核菌素皮肤试验？何谓结核菌素皮肤试验？5.5.B B细胞功能检测的方法学有哪些？细胞功能检测的方法学有哪些？6.6.何谓溶血空斑试验的原理和方法学？何谓溶血空斑试验的原理和方法学？7.7.NKNK细胞活性测定的方法学有哪些？细胞活性测定的方法学有哪些？8.8.中性粒细胞功能检测方法学及相应原理。中性粒细胞功能检测方法学及相应原理。9.9.巨