荧光显微镜的使用与显微摄影

1、 七、荧光显微镜的使用七、荧光显微镜的使用1 1、原理：用人眼不可见的一定波长的紫外光作光、原理：用人眼不可见的一定波长的紫外光作光源照射被检物体，使之受激发后而产生人眼可见的源照射被检物体，使之受激发后而产生人眼可见的荧光，然后再经显微镜成象系统放大来进行检测。荧光，然后再经显微镜成象系统放大来进行检测。引起荧光最有效的光波区域为：引起荧光最有效的光波区域为：0.320.320.400.402 2、荧光显微镜的装置、荧光显微镜的装置A A、可以提供特定波长的光源装置，使被检物体得可以提供特定波长的光源装置，使被检物体得到理想的激发发出强的荧光。到理想的激发发出强的荧光。B B、可以吸收或反射

2、短波光的一系列滤光片。可以吸收或反射短波光的一系列滤光片。八、倒置显微镜八、倒置显微镜九、显微摄影九、显微摄影1 1、按不同类型显微镜的调节方式，对拍摄部位初、按不同类型显微镜的调节方式，对拍摄部位初步对焦。步对焦。2 2、视场光阑内切。、视场光阑内切。3 3、选择光路（包括显微镜的与取景器旁的）、选择光路（包括显微镜的与取景器旁的）4 4、安装胶卷、安装胶卷5 5、设置自动曝光装置、设置自动曝光装置6 6、彩色照像要调色温，调电压或用滤光片、彩色照像要调色温，调电压或用滤光片7 7、屈光度调节、屈光度调节8 8、按曝光按钮、按曝光按钮9 9、取出胶卷、取出胶卷生物电子显微镜技术生物电子显微镜

3、技术 第一节第一节 透射电子显微镜技术透射电子显微镜技术一、显微镜的分辨率与放大倍数一、显微镜的分辨率与放大倍数分辨率：分辨率： d = 0.61 / d = 0.61 / sin sin 电子的波长：电子的波长： = h / = h / mvmv h h 普朗常数普朗常数 , 6.62, 6.621010-27 -27 尔格尔格 / / 秒秒 m m 电子质量电子质量 , 9.1, 9.11010-28-28 克克 v v 电子运动速度电子运动速度根据能量守恒定理：根据能量守恒定理： 1/2mv1/2mv2 2 = = eUeU e e 电子电量电子电量 , 4.8, 4.81010-10-

4、10 静电单位静电单位 U U 电压电压 电子显微镜的电压电子显微镜的电压5050100100千伏。千伏。电子波长为电子波长为0.0530.0530.0070.007。最佳孔径角为最佳孔径角为1010-2-21010-3-3弧度。弧度。电镜的最高分辨率可达电镜的最高分辨率可达2 23 3。有效放大倍数可达有效放大倍数可达100100万倍。万倍。 12.2512.25 = ( = () ) U U 入射电子入射电子直接透射电子直接透射电子小角度弹性碰撞电子小角度弹性碰撞电子大角度弹性碰撞电子大角度弹性碰撞电子小角度非弹性碰撞电子小角度非弹性碰撞电子背散射电子背散射电子俄歇电子俄歇电子二次电子二次

5、电子阴极发光阴极发光X X射线射线扫描电镜扫描电镜透射电镜透射电镜 1 1、 电子与样品作用后产生的信息电子与样品作用后产生的信息X X射线能射线能谱分析谱分析二、电子成像原理二、电子成像原理样品样品2 2、样品的成像、样品的成像 样品中质量密度小的区域，电子直接透射，形样品中质量密度小的区域，电子直接透射，形成亮区。成亮区。 样品中质量密度大的区域，由于电子散射，形样品中质量密度大的区域，由于电子散射，形成暗区。成暗区。 3 3、电磁透镜的放大作用、电磁透镜的放大作用 电子显微镜的透镜：电子的外加磁场。电子显微镜的透镜：电子的外加磁场。磁透镜使电子会聚的原理磁透镜使电子会聚的原理O OOOz

6、 z电子在磁透镜中的运动轨迹电子在磁透镜中的运动轨迹A AC C 所有从所有从O O点出发的电子类似的轨迹运动，在点出发的电子类似的轨迹运动，在v v一定时，当轨一定时，当轨迹与轴的角度很小时，电子会聚在迹与轴的角度很小时，电子会聚在OO点（点（O O）的象。的象。O象物Oba平行光轴电子束经透镜成象平行光轴电子束经透镜成象a - b a - b 为磁场作用区域。为磁场作用区域。三、电镜的像差三、电镜的像差 1 1、球差、球差 球差是由于电子透镜的中心区域和边沿区域对电子的球差是由于电子透镜的中心区域和边沿区域对电子的会聚能力不同而造成的。远轴的电子通过透镜时折射得会聚能力不同而造成的。远轴的

7、电子通过透镜时折射得比近轴电子要厉害的多，以致两者不交在一点上，结果比近轴电子要厉害的多，以致两者不交在一点上，结果在象平面成了一个满散圆斑在象平面成了一个满散圆斑2 2、衍射差、衍射差 电子通过光阑发生衍射。增大孔径角可以减小衍电子通过光阑发生衍射。增大孔径角可以减小衍射差。射差。 最佳孔径角为最佳孔径角为1010-2-21010-3-3弧度。弧度。PP象象PP透镜透镜物物P P光轴光轴球差球差3 3、色差、色差 入射电子的速度不同，未能会聚于一点。入射电子的速度不同，未能会聚于一点。电子的电子的能量不同，从而波长不一造成的，电子透镜的焦距随着能量不同，从而波长不一造成的，电子透镜的焦距随着

8、电子能量而改变，因此，能量不同的电子束将沿不同的电子能量而改变，因此，能量不同的电子束将沿不同的轨迹运动。轨迹运动。能量为能量为E E的的电子轨迹电子轨迹象象1 1透镜透镜物物P P光轴光轴色差色差能量为能量为E- EE- E的的电子轨迹电子轨迹象象2 2AMAfMrAAfr Af4 4、象散、象散 磁场不对称时，就出现象散。磁场不对称时，就出现象散。 圆形物点的象就变成了椭圆形的漫散圆斑圆形物点的象就变成了椭圆形的漫散圆斑 消像散器可减弱。消像散器可减弱。平面平面B BP PA A透镜平面透镜平面物物P P光轴光轴P PB Bf fA A 平面平面A A象散象散 四、透射电子显微镜的结构四、

9、透射电子显微镜的结构电子光学系统、真空系统、供电系统电子光学系统、真空系统、供电系统电子光学系统电子光学系统照明系统照明系统成像系统成像系统观察记录系统观察记录系统电子枪电子枪聚光镜聚光镜 样品室样品室物镜物镜第一中间镜第一中间镜第二中间镜第二中间镜投影镜投影镜 观察室观察室照相舱照相舱 自动曝光装置自动曝光装置（一）电子光学系统（一）电子光学系统 1 1、照明系统、照明系统 a a、电子枪电子枪 阴极、阳极、栅极阴极、阳极、栅极阴极：阴极：0.1mm0.1mm粗的钨丝，粗的钨丝，v v型，型，2,2272,227C C时，产生电子发射。时，产生电子发射。 阳极：相对于阴极有阳极：相对于阴极有

10、5050100100千伏的正电位差，加速电子流。千伏的正电位差，加速电子流。 栅极：相对于阴极有栅极：相对于阴极有100 100 500 500伏的负电位。调节到达阳极伏的负电位。调节到达阳极的电子量，并使电子束会聚一点。的电子量，并使电子束会聚一点。 阴极阴极阳极阳极栅极栅极 b b、聚光镜聚光镜 两个电磁透镜两个电磁透镜 聚光镜的作用是将电子束会聚在样品上，控制照明束聚光镜的作用是将电子束会聚在样品上，控制照明束斑的大小及孔径角。斑的大小及孔径角。 2 2、成像与放大系统、成像与放大系统 a a、样品室样品室 插入支持铜网的样品臂。插入支持铜网的样品臂。b b、物镜物镜 短焦距的强磁透镜，

11、安装了光阑和消像散器，短焦距的强磁透镜，安装了光阑和消像散器，决定分辨率。首次成像，放大决定分辨率。首次成像，放大100100c c、中间镜及投影镜中间镜及投影镜中间镜：弱透镜，放大中间镜：弱透镜，放大20X20X，用用来调节放大倍数。中间镜越多放来调节放大倍数。中间镜越多放大倍数越大。大倍数越大。透射电镜成像的三级放大透射电镜成像的三级放大投影镜：高倍放大透镜，放大投影镜：高倍放大透镜，放大100X 100X ，越复杂的电镜投影镜，越复杂的电镜投影镜越多。越多。3 3 、观察记录系统、观察记录系统 a a、观察室观察室 观察室前方挡紫外线的铅玻璃，用于肉眼观察。观察室前方挡紫外线的铅玻璃，用

12、于肉眼观察。 底面是荧光屏，投射镜产生的最终放大像形成在底面是荧光屏，投射镜产生的最终放大像形成在荧光屏上。荧光屏上。 b b、照相舱照相舱 在观察室下面，装有底片。在观察室下面，装有底片。1 1、高压电线、高压电线2 2、电子枪室、电子枪室3 3、第一聚光镜、第一聚光镜4 4、第二聚光镜、第二聚光镜5 5、光阑、光阑6 6、样品臂、样品臂7 7、物镜、物镜8 8、第一中间镜、第一中间镜9 9、第二中间镜、第二中间镜1010、投影镜、投影镜1111、观察窗、观察窗1212、观察室、观察室1313、荧光板、荧光板1414、底片盒、底片盒照明系统照明系统放大系统放大系统观察记录系统观察记录系统(

13、(二二) )真空系统真空系统 真空泵（机械泵）真空泵（机械泵） 油扩散泵油扩散泵 真空系统真空系统 管道及自动伐门管道及自动伐门 预抽室、空气干燥器预抽室、空气干燥器 真空检测系统真空检测系统 ( (三三) )电源系统电源系统 高压电源高压电源 电源系统电源系统 透镜电源透镜电源 附属电源附属电源光源光源中间象中间象物镜物镜样品样品聚光镜聚光镜目镜目镜电子枪电子枪聚光镜聚光镜样品样品物镜物镜中间象中间象投影镜投影镜观察屏观察屏照相底板照相底板虚象虚象三、透射电镜的样品制作（一）超薄切片法主要步骤：主要步骤： 取材取材 固定固定 洗涤洗涤 脱水脱水 浸透浸透 包埋包埋 聚合聚合 修块修块 切片切

14、片 装网装网 电子染色电子染色 上镜观察上镜观察1 1、取材取材 1mm1mm3 3（或（或mmmm2 2） 活体取材，低温，活体取材，低温，4 4C C。 刀片锋利，动作轻巧迅速。刀片锋利，动作轻巧迅速。2 2、固定固定 电镜常用固定剂：电镜常用固定剂： 戊二醛、锇酸戊二醛、锇酸 固定方法：固定方法： 戊二醛戊二醛锇酸双固定锇酸双固定前固定前固定 2.5%2.5%戊二醛溶液，戊二醛溶液，4 4C C，1 14 4小时。小时。 洗涤洗涤 0.2M0.2M磷酸缓冲液，磷酸缓冲液，pH 7.4pH 7.4，5 5 6 6次，每次次，每次1010分钟。分钟。后固定后固定 1%1%的锇酸溶液，的锇酸溶

15、液， 4 4C C，1 1小时。小时。 洗涤洗涤 0.2M0.2M磷酸缓冲液，磷酸缓冲液，pH 7.4pH 7.4，3 3 4 4次，每次次，每次1010分钟。分钟。 c、注意事项注意事项 温度温度 在低温下进行，在低温下进行，4C。时间时间 与固定液的浓度、种类有关。不可随意更改。与固定液的浓度、种类有关。不可随意更改。 固定液的固定液的pH 接近组织的接近组织的pH。 固定液的浓度固定液的浓度 浓度过低，会发生组织肿胀、抽提；浓度过低，会发生组织肿胀、抽提； 浓度过高，组织收缩或遭破坏。浓度过高，组织收缩或遭破坏。 固定液的渗透压固定液的渗透压 应该接近组织液的渗透压。应该接近组织液的渗透

16、压。3 3、脱水脱水 一定浓度的酒精或丙酮系列一定浓度的酒精或丙酮系列 30% 50% 70% 30% 50% 70% 80% 90% 95% 100%80% 90% 95% 100%（2-32-3次），每步次），每步5 51515分钟。分钟。注意：注意： a a、70%70%脱水剂以上各步都在低温（脱水剂以上各步都在低温（4 4C C）下进行。下进行。b b、样品只有在样品只有在70%70%脱水剂，脱水剂，4 4C C可以存放过夜。可以存放过夜。 c c、脱水要彻底。脱水要彻底。4 4、浸透浸透 包埋剂成分：包埋剂成分： 树脂单体（环氧树脂树脂单体（环氧树脂618#618#、Epon812E

17、pon812等）、固化剂、增塑等）、固化剂、增塑剂及加速剂。剂及加速剂。注意事项：注意事项： 浸透要充分；包埋剂配制时要混匀各种成分；用具要干燥，浸透要充分；包埋剂配制时要混匀各种成分；用具要干燥，防止包埋剂吸潮。防止包埋剂吸潮。浸透过程：浸透过程： 无水丙酮无水丙酮 无水丙酮无水丙酮+1/2+1/2包埋剂（包埋剂（4 4小时）小时） 纯包埋剂（过夜）。纯包埋剂（过夜）。5 5、包埋与聚合包埋与聚合 包埋模包埋，加温聚合。包埋模包埋，加温聚合。 注意：防止产生气泡；包埋后要干燥，防止吸潮。注意：防止产生气泡；包埋后要干燥，防止吸潮。6 6、修块修块 注意事项：注意事项： 尽量削去样品周围的空白

18、介质，顶面呈梯形或方形，尽量削去样品周围的空白介质，顶面呈梯形或方形，大小大小1mm1mm。 梯形或方形的上下两边平行。梯形或方形的上下两边平行。7 7、切片切片 切片刀有钻石刀和玻璃刀。切片刀有钻石刀和玻璃刀。 注意事项：切片刀要锋利，否则切片上会出现划痕。注意事项：切片刀要锋利，否则切片上会出现划痕。 切片厚度切片厚度50050010001000，面积面积1mm1mm以下。以下。 切片连成带浮在水面上。切片连成带浮在水面上。8 8、装网装网 载网的类型：载网的类型：FormvarFormvar 膜的制备：膜的制备：配制配制0.3% 0.3% FormvarFormvar（聚乙烯醇缩甲醛）的

19、二氯乙烷（或聚乙烯醇缩甲醛）的二氯乙烷（或氯仿）溶液。氯仿）溶液。 切片用带膜的铜网捞取，在显微镜下进行。切片用带膜的铜网捞取，在显微镜下进行。 9 9、电子染色电子染色 醋酸双氧铀及柠檬酸铅染色。醋酸双氧铀及柠檬酸铅染色。1010、上镜观察上镜观察（二）负染色技术（二）负染色技术 所谓负染色，负染色技术又称为阴性染色术。所谓负染色，负染色技术又称为阴性染色术。是指通过重金属盐是指通过重金属盐 在样品四周的堆积而加强样在样品四周的堆积而加强样品外周品外周 的电子密度，使样品显示负的反差，的电子密度，使样品显示负的反差， 衬衬托出样品的形态和大小。托出样品的形态和大小。 磷钨酸滴染磷钨酸滴染 第

20、二节第二节 扫描电子显微镜技术扫描电子显微镜技术一、扫描电镜的结构一、扫描电镜的结构电子光学系统电子光学系统 信号的收集转换系统信号的收集转换系统信号的显示与记录系统。信号的显示与记录系统。真空和供电系统真空和供电系统电子枪电子枪 电磁透镜电磁透镜 扫描线圈扫描线圈 样品样品 入射电子入射电子直接透射电子直接透射电子小角度弹性碰撞电子小角度弹性碰撞电子大角度弹性碰撞电子大角度弹性碰撞电子小角度非弹性碰撞电子小角度非弹性碰撞电子背散射电子背散射电子俄歇电子俄歇电子二次电子二次电子阴极发光阴极发光X X射线射线扫描电镜扫描电镜透射电镜透射电镜 电子与样品作用后产生的信息电子与样品作用后产生的信息X X射线能射线能谱分析谱分析（一）电子光学系统（一）电子光学系统 1 1、电子枪、