分子生物学实验：8DNA重组与转化

1、DNA重组与转化2015年5月1课件作者:蒋华云一、实验目的通过本实验学习重组DNA连接与转化的方法。2015年5月2课件作者:蒋华云什么是重组？怎样转化？重组：载体和外源连接什么是载体？这里的外源指什么？转化质粒DNA或以它为载体构建的重组子导入细菌的过程。准备好的感受态的细胞（70度低温保存）2015年5月3课件作者:蒋华云二、实验原理外源DNA与载体分子的连接就是DNA重组，这样重新组合的DNA叫做重组体或重组子。通常:重组的DNA分子是在DNA连接酶的作用下，有Mg2+、ATP存在的连接缓冲系统中，将分别经酶切的载体分子与外源DNA连接。T载体: pMD 18-T 2015年5月4课件

2、作者:蒋华云pMD 18-T (PCR产物克隆载体)2015年5月5课件作者:蒋华云连接2015年5月6课件作者:蒋华云DNA连接酶有两种：T4噬菌体DNA连接酶和大肠杆菌DNA连接酶DNA重组的方法主要有粘端连接法和平端连接法，为了防止载体本身的自连，可以通过（牛小肠碱性磷酸酶）CIP处理克服 连接反应的温度在37时有利于连接酶的活性。但是在这个温度下，粘性末端的氢键结合是不稳定的。因此人们找到了一个折中的温度，即1216，连接1216h（过夜），这样既可最大限度地发挥连接酶的活性，又兼顾到短暂配对结构的稳定pMD18-T Vector 是一种高效克隆PCR 产物（TA Cloning）的专

3、用载体，该载体由pUC18 载体改建并在其3端添加“T”而成大部分耐热性DNA聚合酶进行PCR反应时都有在PCR产物的3末端添加一个“A”的特性，所以使用本制品可以大大提高PCR产物的连接、克隆效率 转化是指质粒DNA或以它为载体构建的重组子导入细菌的过程2015年5月7课件作者:蒋华云2015年5月8课件作者:蒋华云2015年5月9课件作者:蒋华云重组质粒转化宿主细胞后，还需对转化菌落进行筛选鉴定。利用互补现象进行筛选是最常用的一种鉴定方法 互补：质粒载体上lacZ基因编码的肽段与失去了正常氨基端的-半乳糖苷酶突变受体菌之间实现互补的现象由互补而形成的有功能活性的半乳糖苷酶，可以用Xgal显

4、色测定出来 任何携带着lacZ基因的质粒载体在转化半乳糖苷酶突变的大肠杆菌细胞后，在含有Xgal的培养基平板上形成蓝色菌落，而含有重组质粒载体的克隆往往是白色菌落 。2015年5月10课件作者:蒋华云蓝斑和白斑2015年5月11课件作者:蒋华云三、仪器、材料与试剂【仪器】(1)超净工作台（417室）(2)恒温培养箱（412室）(3)恒温摇床（404室）(4)台式离心机(5)高压灭菌锅(6)Micro Cooler（16度连接）(7)移液枪2015年5月12课件作者:蒋华云【材料与试剂】(1)LB固体和液体培养基(2)X-gal（20mg/mL）将X-gal溶于二甲基甲酰胺，配成20mg/mL，

5、不需要过滤灭菌，每份1mL分装，避光贮存于-20。(3)IPTG（200mg/mL）：取2g IPTG溶于10mL双蒸水，用0.22m滤膜过滤除菌，每份1mL，贮存于-20。(4)氨苄青霉素（Amp 100mg/mL）2015年5月13课件作者:蒋华云(5)pMD18-T Vector（TaKaRa连接试剂盒）pMD18-T Vector*1（50 ng/L）20 L1 支Control Insert（50 ng/L）10 L1 支Ligation Mix*30 L5 支*注意：* 使用时请于冰中融解。(6)玻璃涂棒(7)培养皿（9cm）(8)10L/1000 L移液器（配套枪头）(9)小指管

6、（1.5mL离心管）2015年5月14课件作者:蒋华云四、实验步骤在微量离心管中配制下列DNA溶液，全量为10L16连接反应30min含有X-gal、IPTG、的LB琼脂平板培养基的制备：200mL固体培养基（融化状态下60度），加入200L100mg/mL Amp，加400L X-gal （20mg/mL）和24L IPTG（ 200mg/mL）溶液，摇匀，倒制平板。待凝固后避光保存备用。pMD18-T Simple Vector（50ng/L）0.5LInsert DNA（0.1pmol0.3pmol）3LddH2O up to 5LLigation Mix*5L总体积10L2015年5月

7、15课件作者:蒋华云实验组：将5L连接产物加入至200L DH5感受态细胞中，冰中放置30min 阳性对照组：将2L质粒加入至200LDH5感受态细胞中，冰中放置30min42加热45s后，再在冰中放置1min 加入800L LB液体培养基，37振荡培养60min4000r/min离心5min，去掉800L上清，混匀菌液，用灭菌玻璃涂棒涂布于含有X-gal、IPTG、Amp 的LB琼脂平板培养基上，37正置吸收30min倒置平皿37培养过夜（1216h）。在含有X-gal、IPTG、Amp 的LB琼脂平板培养基上培养，形成单菌落计数白色、蓝色菌落。挑选白色菌落，可使用菌落PCR 法确认载体中插入片段的长度大小 2015年5月16课件作者:蒋华云五、实验分组DNA重组连接反应：每组4人，10L连接产物。全班6组。转化实验：每组2人，全班12组。5L连接产物加入至200LDH5感受态细胞中（实验组）2L质粒加入至200LDH5感受态细胞中（阳性对照）需要2块LB琼脂平板（实验组和阳性对照）2L无菌水加入至200L