分子生物学实验：实验三 琼脂糖凝胶电泳检测质粒DNA

1、实验三、琼脂糖凝胶电泳检测质粒DNA1201504 课件作者:蒋华云你提取的质粒DNA怎么样？准备配试剂提取质粒DNA是否提取到质粒DNA？质粒DNA质量怎么样？实验目的学习琼脂糖凝胶电泳检测质粒DNA确定后续实验材料2012-3-13课件作者：蒋华云22201504 课件作者:蒋华云电泳原理带电物质在电场中的趋向运动称为电泳。凝胶电泳由于其操作简单、快速、灵敏等优点，已成为蛋白质、核酸研究的首选标准方法。泳动率是带电颗粒在一定的电场强度下，单位时间内在介质中的迁移距离。样品的物理性状（分子大小、电荷多少、颗粒形状和空间构型）支持物介质（琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶）电场强度缓冲液离子强度（最适

2、离子强度一般在0.020.2之间）2012-3-13课件作者：蒋华云33201504 课件作者:蒋华云DNA分子在琼脂糖凝胶中DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应DNA分子在高于等电点的pH溶液中带负电荷，在电场中向正极移动在一定的电场强度下， DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应，即DNA分子本身的大小和构型凝胶电泳不仅可以分离不同相对分子质量的DNA，也可以分离相对分子质量相同，但构型不同的DNA分子2012-3-13课件作者：蒋华云44201504 课件作者:蒋华云不同构型的质粒DNA超螺旋的共价闭合环状质粒DNA（covalently closed circular D

3、NA，简称CCCDNA）开环质粒DNA，即共价闭合环状质粒DNA一条链断裂（open circular DNA，简称OCDNA）线状质粒DNA，即共价闭合环状质粒DNA二条链断裂（linear DNA，简称L DNA）2012-3-13课件作者：蒋华云55201504 课件作者:蒋华云实验仪器分析天平微波炉（电炉）移液器（10uL）琼脂糖凝胶电泳系统（水平槽）紫外线透射仪（或凝胶成像系统）2012-3-13课件作者：蒋华云66201504 课件作者:蒋华云琼脂糖凝胶电泳系统（水平槽）7201504 课件作者:蒋华云水平槽电泳系统的使用缓冲液染料指示剂琼脂糖凝胶电泳仪8201504 课件作者:蒋

4、华云电泳正在进行电泳仪DNA分子在高于等电点的pH溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。 点样端靠近负极DNA分子在凝胶中移动9201504 课件作者:蒋华云材料与试剂质粒DNADNA marker 2000DNA marker 100001TAE(电泳缓冲液)6凝胶加样缓冲液琼脂糖1%溴化乙锭溶液（EB）（注意： EB 具有毒性，戴手套操作）10201504 课件作者:蒋华云实验操作步骤胶板的制备制备1%琼脂糖凝胶加样记录点样的顺序和点样量电泳DNA的迁移速度和电压成正比，最高的电压不超过5V/cm， DNA片段从负极向正极移动，当溴酚蓝指示剂移动到距凝胶前沿12cm处时，停止电泳。 90V恒

5、压电泳25min实验报告请详细记录实验过程11201504 课件作者:蒋华云操作详解制备1%琼脂糖凝胶（1）按水平槽制胶板操作说明，将制胶板安装好，调节水平。（2）称取0.3g琼脂糖，加30mL1TAE电泳缓冲液，微波炉加热至完全透明，凉却至60度时，加入1L1%EB，摇匀倒板。记录加样的顺序和加样量（3）待琼脂糖凝胶完全凝固，将胶板放入电泳槽，加入1TAE电泳缓冲液，通常加至没过胶面2mm，拔去梳子。（4） 选择一个加样孔加入5LDNA marker 2000或15000（5）吸取5 L样品DNA和1 L 6凝胶加样缓冲液混匀，加入加样孔。（注意：此混匀操作可在一次性手套上完成。）电泳（6）接通电泳槽和电泳仪电源，调节电压为90V，稳压电泳25分钟。（注意：DNA片段从负极向正极移动，即加样端靠近电泳槽负极。）12201504 课件作者:蒋华云结果检测在紫外灯（360nm，312nm，254nm）下观察电泳凝胶，DNA存在处显出桔红色荧光条带。【紫外透射仪】记录观察结果或拍照记录实验结果【402房间】注意：紫外线对眼睛有伤害作