第八章酶催化

1、第八章 酶催化章节分配一、酶的结构和分类二、酶的分离与纯化三、酶活力测定四、酶作用动力学五、酶的抑制作用六、pH值和温度对酶作用的影响七、酶的作用机制八、应用酶学九、酶法制备L-氨基酸十、生物催化反应器十一、生物有机化学与生物催化 生物催化的定义：是利用生物催化剂(主要是酶或微生物)来改变(通常是加快)化学反应速度的作用。生物催化转化的分类：(1)发酵：用活细胞将原材料(如糖、淀粉或甲醇)转化成更复杂的目标产物。(2)前体发酵：发酵过程中添加前体物质，并由活细胞将其转化成目标产物。(3)生物转化：用酶或静息细胞经过一系列步骤，将前体转化成目标产物。(4)酶催化：提取粗酶或部分纯化的酶

2、，将底物转化成目标产物。生物催化的产生与发展：远古时代酒的酿造：酵母发酵的产物，是细胞内酶作用的结果；饴糖的制作：用麦曲含有的淀粉酶将淀粉讲解为麦芽糖；豆类做酱：在霉菌蛋白酶作用下，豆类蛋白质水解得豆酱和豆鼓，压榨后制得酱油。1878年，Kuhne第一次提出“酶”(Enzyme)的概念,意为“在酵母中”(in yeast)；1894年，Emil Fischer发现了酶对底物(酶作用的物质)的专一性现象,提出了“锁和钥匙”模型；酶晶体的获得，才认识到酶是蛋白质，是由酰胺键连接的氨基酸组成；1926年，Sumner从刀豆中得到脲酶结晶，催化尿素水解,产生CO2和NH3；1967年，丝氨酸蛋白酶的发

3、现，它专门用于洗涤剂；1992年，用于生产酶的克隆技术的诞生；最近发现除了“经典”酶以外，某些生物分子也具有催化活性。1982年Cech小组发现，四膜虫的rRNA(核糖体核糖核酸)前体能在完全没有蛋白质的情况下进行自我加工，催化得到成熟的rRNA产物。这就是说，RNA本身就是生物催化剂。20世纪80年代以来，基因工程技术用于酶学研究得到高度重视。应用DNA重组技术可以生产出高效能、高质量的酶产品，用定点突变法在指定位点突变，可以改变酶的催化活性与专一性。生物催化研究的重要意义：(1)生物催化与生物转化是与生命活动及人类发展关系最为密切的自然规律之一；(2)基于生物催化与生物转化的物质加工新模式

4、是人类发展的必然趋势；(3)生物催化的独特优势可以促进传统产业的升级改造；(4)生物催化对于我国的经济发展和安全具有战略意义。生物催化的主要方式：生物催化几乎能应用于所有化学反应，例如氧化反应、羟基化反应、脱氢反应、还原反应、水解反应、酰基化反应等。生物催化材料有酶、微生物菌体、动植物的组织及细胞。在手性合成中应用较多的是水解酶、氧化-还原酶以及面包酵母等微生物。生物催化的方式有添加前体发酵法、游离酶法、静息细胞法、固定化酶法、固定化细胞法。可在水相、有机相和水-有机溶剂双相等系统中进行。生物催化反应的特点：(1)高催化效率(2)高专一性(3)酶活性受一些化合物调控  酶催

5、化能力举例底物催化剂温度(K)速度常数*脲(水解)H+脲酶3352947.4×10-75.0×1052H2O2" 2H2O+O2Fe2+过氧化氢酶295295563.5×107*单位：(mol·L-1)-1·s-1NH3的合成：在植物中通常是25和中性pH下由固氮酶催化完成，酶是由两个解离的蛋白质组分组成的一个复杂的系统，其中一个含金属铁，另一个含铁和钼，反应需消耗一些ATP(三磷酸腺苷)分子；工业上由氮和氢合成氨时，需在700-900K、10-90MPa下，还要有铁及其他微量金属氧化物作催化剂才能完全反应。酶催化的最适条件几乎都为温

6、和的温度和非极端pH值。专一性：有些酶专一性很低(键专一性),如肽酶、磷酸(酯)酶、酯酶,可以作用很多底物, 只要求化学键相同,例如它们可分别作用肽、磷酸酯、羧酸酯;具有中等程度专一性的为基团专一性,如己糖激酶可以催化很多己醛糖的磷酸化;大多数酶呈绝对或几乎绝对的专一性，它们只催化一种底物进行快速反应。调节性：酸浓度的调节:诱导或抑制酶的合成,调节酶的降解;抑制剂的调节:酶的活性受到大分子抑制剂或小分子抑制剂抑制,从而影响活力;金属离子的调节:有些酶需要K+活化,但Na+不能活化这些酶,有时还有抑制作用。生物催化研究的新进展：1.生物催化一进入传统的化工领域，就给原料来源、能源消耗、经济效益、

7、环境保护等方面带来了根本性的变化。2.作为生物技术第三次浪潮标志的生物催化技术已成为发达国家的重要科技与产业发展战略，以生物催化技术为核心的生物制造产业正以指数规律加速发展。3.目前，美国在酶催化剂及手性化合物合成方面已处于领先地位，其生物催化制造的化学品产值已超过生物医药的产值。 所以，新的生物催化剂是21世纪可持续发展的化学加工业的必需工具。到2020年通过生物催化技术，化学加工业的原料、水资源及能量消耗将各降低30，减少污染物排放和污染扩散30。生物催化技术的应用领域： 工业部门应用领域成熟程度及应用情况石油炼制生物脱硫工业示范大宗化学品乙醇/甘油已成熟/工业示范高分子聚合物可

8、生物降解聚合物工业应用特殊有机中间体手性中间体工业应用医药医用蛋白/手性药物工业应用农用化学品生物杀虫剂工业应用日用化学品乳酸/柠檬酸接近成熟/工业应用环境保护废物处理技术开发中 现状：1996年生物催化剂已占世界催化剂90亿美元市场的11%；美国EBC成功开发了一种生物脱硫的新工艺；我国：生物催化丙烯腈制丙烯酰胺、有机废水发酵法制氢技术、生物发酵法制造甘油已建成投产或通过中试验证。 §1 酶的结构和分类蛋白质是构成人体的基础物质、酶是蛋白质、酶由长链氨基酸组成、酶结构的4个层次：       

9、    溶菌酶(lysozyme)的一级结构图：             酶的二级结构:-螺旋和-褶片              蛋白溶菌酶的三级结构图：           &#

10、160;  溶菌酶部分四级结构示意图：            氨基酸的排序决定酶的功能：            酶的分类(编号的第一个数字)：表示这个酶属于哪一大类氧化还原酶：用于将电子从一个分子转移到另一个分子;转移酶：催化原子基团从一个分子转移到另一个分子;水解酶：催化底物与水之间的反应,以及将水结合到某些分子上;裂解酶：从底物上移去

11、一个基团;异构酶：催化原子基团从一个位置转移到另一个位置;连接酶：利用共价键将分子连接到一起.编号的第二个数字：表示在类以下的大组氧化还原酶：表示氧化反应供体基团的类型；转移酶：表示被转移基团的性质；水解酶：表示被水解键的类型；裂解酶：表示被裂解键的类型；异构酶：表示异构作用的类型；连接酶：表示生成键的类型.编号的第三和第四个数字：编号的第三个数字：表示大组下面的小组，各个数字在不同类别，不同大组中都有不同的含义；编号的第四个数字：是小组中各种酶的流水编号.例如：氧化还原酶的第二个数字E.C.1.（氢或电子供体）醇(RRCHOH) 1；醛或酮(RRC=O) 2； RRCHCHRR 3；伯胺RC

12、HNH2 4；仲胺RRCHNH 5；NADH或NADPH 6。氧化还原酶的第三个数字E.C.1.16.（氢或电子受体）NAD+或NADP+ 1； Fe3+(如细胞色素) 2；O2 3； 其他未分类的受体 99。NAD+(NADP+)：烟酰胺腺嘌呤二核苷酸 (磷酸)转移酶的第二个数字E.C.2.（转移的基团）含一个碳原子的基团 1；醛基或酮基 2；酰基 3；糖基 4；含磷基团 7。转移酶的第三个数字，例如：E.C.2.1.1 转移甲基的酶类E.C.2.1.2 转移羟甲基的酶类E.C.2.1.3 转移羧基的酶类E.C.2.4.1 转移己糖基的酶类E.C.2.1.4 转移戊糖基的酶类水解酶的第二个数

13、字E.C.3.（水解的键）酯 键 1；糖苷键 2；肽 键 4；肽键以外的C-N键 5。水解酶的第三个数字，例如：E.C.3.1.1 水解羧酸酯的酶类E.C.3.1.2 水解硫代酯的酶类E.C.3.1.3 水解磷酸单酯的酶类E.C.3.1.4 水解磷酸二酯的酶类裂解酶的第二个数字E.C.4.（裂解的键）CC 1； CO 2； CN 3； CS 4。裂解酶的第三个数字（以CC裂解酶为例，移去基团为）E.C.4.1.1 羧基(即CO2)E.C.4.1.2 醛基(CH=O)E.C.4.1.3 酮羧基(-OOC-C=O)异构酶的第二个数字E.C.5.（反应类型）消旋和差向异构 1； 顺式-反式异构 2；

14、分子内氧化还原酶类 3； 分子内的转移反应 4。异构酶的第三个数字，例如：底物E.C.5.1.1 氨基羧E.C.5.1.2 羟基羧酸E.C.5.1.3 糖类连接酶的第二个数字（合成的键）CO 1； CS 2； CN 3； CC 4连接酶的第三个数字，例如：进一步说明合成的键E.C.6.3.1 羧酸-氨(胺)连接酶类酰胺合成酶类E.C.6.3.2 羧酸-氨基酸连接酶类肽合成酶类 §2 酶的分离与纯化酶的纯化独有的特点：特定的一种酶在细胞中的含量很少，给纯化带来了困难；酶可以通过测定活力的方法加以跟踪，能迅速找出纯化过程的关键所在。酶的纯化过程包括下列步骤：  

15、60;       建立一个适当的测活方法测定酶活力方法要求高灵敏性、高准确性、是否经济、方法简单。          酶源选材要以含酶丰富、取材方便、经济为原则例如，在分离纯化动物Cu、Zn-SOD（超氧化物歧化酶）时，一般以动物血球为原料；Mn-SOD主要存在于线粒体中，所以肝、肾脏适宜作原材料；利用动植物细胞体外大规模培养技术，可获得极为珍贵的原材料（如人参细胞、某些昆虫细胞等），用于酶的分离纯化；利用基因工程重组DNA技术，使某些在细胞中含量极微的

16、酶的纯化成为可能。          酶的提取除在体液中提取酶或胞外酶外，一般是将含目的酶的生物组织破碎，促使酶增溶溶解，最大程度的提高抽提液中酶的浓度。生物组织的破碎方法有：机械法、超声波法、冻融法、渗透压法、酶消化法。超声波法：细菌和酵母细胞能得到很好的破碎；问题：超声空穴局部过热引起酶活性丧失，所以时间应尽可能短，容器周围以冰浴处理。冻融法：生物组织经冰冻后，细胞胞液结成冰晶，使细胞壁胀破；简单易行，但效率不高，需反复几次才能达到破壁效果；若冻融时间过长，还应注意胞内蛋白酶作用引起的后果，一般需在冻融液中加入

17、络合剂EDTA等蛋白酶抑制剂以防破坏目的酶。渗透压法：是破碎细胞最温和的方法之一，细胞在低渗溶液中溶胀破碎；此法对具有坚韧的多糖细胞壁的细胞，如植物、细菌和霉菌不太适用。酶消化法：利用溶菌酶、蛋白水解酶、糖苷酶对细胞膜或细胞壁的酶解作用，使细胞崩解破碎；酶消化法常与其他破碎方法联合使用，如在大肠杆菌冻融液中加入溶菌酶就可大大提高破碎效果。破碎生物组织一般在适当的缓冲溶液中进行。典型的抽提液由以下几部分组成：抽提液=离子强度调节剂+pH缓冲剂+温度效应剂蛋白酶抑制剂防氧化剂重金属络合剂增溶剂          酶的提

18、纯：常用的提纯方法如下。 性 质方 法溶解度改变离子强度、改变pH、温度、改变介电常数电荷极性离子交换层析、色谱聚焦、电泳、等电聚焦大小或重量离心分离、透析超滤、凝胶过滤亲和部位亲和层析、免疫吸附层析、共价层析           酶的纯度检验酶纯化的目标是使酶制剂具有最大的催化活性和最高纯度，以下几种方法用于检验这些指标：1. 酶纯度的检验2. 酶催化活性的检验3. 酶活性部位滴定§3 酶活力测定在酶作用下化学反应进行的速度，就代表酶的活力；酶活力的测定，实质上就是一个测定为酶所催化

19、的反应速度问题。在实际测定过程中，为了保证测得的是初速度，往往使底物浓度足够大，把酶完全饱和，这样整个酶反应对于底物来说是零级反应，而对于酶来说是一级反应，这样测得的初速度可以比较可靠地反映酶的含量。酶活力的测定方法：中止法：是在恒温反应系统中进行酶促反应，间隔一定的时间，分几次取出一定容积的反应液，使酶即刻停止作用，然后分析产物的生成量或底物的消耗量；连续法：不需取样中止反应，而是基于反应过程中光谱吸收、气体体积、酸碱度、温度、粘度等的变化用仪器跟踪监测反应进行的过程，算出酶活性。一般的连续法包括：光谱吸收法：主要是指分光光度法和荧光法。     &#

20、160;        分光光度法是利用反应物和产物在紫外和可见光部分的光吸收不同，选择一适当的浓度，连续测定出反应过程中光吸收的变化。该法适用于反应速度较快的酶；              荧光法是具有荧光性的化合物吸收了某一波长的光后发射出更长波长的光。只要酶反应的底物或产物之一具有荧光，测定荧光的变化就可表示出酶反应的速度。电化学法：溶液的电势取决于被测物质的浓度和性质，采用这一原理制成的离子选择性电

21、极，如pH电极可测定酶反应过程中反应液pH的变化，从而得知参与反应的酶的活力；实际上，H+变化的酶促反应需要不断加入酸或碱来恒定溶液的pH值，才能使酶活力不发生变化。量气法：在酶反应底物或产物之一为气体时，可通过测量反应系统中气相的体积或压力的改变，计算出气体释放或吸收的量；根据气体变化和时间的关系，即可求得酶反应速度，准确程度较光谱吸收法低。量热法：由于在反应过程中有反应热的变化，用非常灵敏的量热计可以测定酶反应速度；量热法灵敏、无干扰，且很通用。旋光法：在某些酶催化反应中，底物和产物的旋光有所不同，这时就可以根据旋光的变化来跟踪酶反应过程；在某些情况下，可通过形成络合物来提高旋光度。酶活力

22、的定义与表示方法：国际酶学委员会曾规定：一分钟内转化一个微摩尔底物所需的酶量为一个国际单位IU；规定反应必须在25，在具有最适底物浓度、最适缓冲液离子强度和pH的系统内进行；EC推荐一个新的酶活力国际单位kat:一个kat单位定义为:每秒钟能使一个摩尔底物转化的酶量,则1kat=6×107IU。酶反应的分析：              总反应           &#

23、160;  部分反应一个由特定的酶所催化的化学反应，当写作计量化学方程式时，就称为总反应（Overall reaction）；从底物A与B生成产物P与Q的总反应，可写作：E + A + B = E + P + Q在适当条件下（如缺少一种底物），那么总反应的一部分就能被观察到，这就称作部分反应；举例： Eox + S Ered + P Ered + O2 Eox + H2O2编号E.C.1.1.3.4的葡萄糖氧化酶催化的总反应为：-D-葡萄糖 + O2 " D-葡萄糖酸-内酯 + H2O2§4 酶作用动力学一、单底物酶促反应动力学· 以底物S、生成产物P的

24、酶催化反应为例，以E表示酶，其反应历程如下： E + S D ES " P + E· 第一步：酶和底物形成中间配合物ES； · 第二步：ES配合物释放能量，生成产物P和酶。 单底物酶催化反应与非酶催化反应的进程曲线图如下：          对典型的单底物酶催化反应：酶的总浓度：(CE)t = CE + CES假定S、E和ES很快达到平衡，ES的分解是控速步骤，则在平衡时E + S D ES " P + E    &

25、#160;其中：kM是酶的特性常数，表明酶和底物间亲和力的大小，kM愈小的酶，其催化活性愈高。酶催化反应的速率：r = k2CES，代进上式，得 即Michaelis-Menten(米氏)动力学方程。k2也称为kcat，代表酶催化反应的转化数(turnover number)。在极限情况下：1. 若底物浓度很大，使催化活性中心饱和，Cs>kM，此时上式简化为Kcat为一级速率常数，反应速率取决于酶量。若反应速率以每个酶分子来表示，而不是以单位体积来表示，则应为零级反应。2. 如果底物对活性中心覆盖度很低， CSkM，动力学方程简化为：  Kcat/kM为二级

26、反应速率常数，若反应速率以每个活性中心表示，则为表观一级反应。· 从动力学方程可见，酶的浓度、底物浓度、产物浓度都影响酶催化反应速率。此外温度、酸碱度、离子强度和抑制剂也会影响酶催化反应。 · 酶催化反应速率与温度的关系服从Arrhenius方程，温度升高时，反应速率呈指数上升，与化学催化的规律相同；但酶蛋白质温度过高，则易于变性，导致酶的催化活性下降，甚至失活；一般蛋白质在45-50便开始变性，到55变性已相当严重。 酶促反应按底物数分类： 底物数酶分类催化反应酶种类占总酶1. 单底物异构酶A DB5%2. 单向单底物裂解酶A DB+C12%3. 假单底物水解酶

27、A-B+H2ODA-OH+BH26%4. 双底物氧化还原酶基团转移酶AH2+BDA+BH2A+BXDAX+B27%5. 三底物连接酶A+B+ATPDAB+ADP+P130% 二、酶作用于多底物时的动力学双底物、双产物反应通式为：E + A + B = E + P + Q 考虑酶与底物是否形成三元络合物，将酶分为两大类。1. 反应过程中形成三元络合物 2. 反应过程中不形成三元络合物 E + A + B " EAB " EPQ " E + P + Q 形成了三元络合物。A + E " EA " FP " F " FB

28、 " EQ " E + Q酶首先与一个底物结合，释放一个产物，再与另一个底物结合，再释放出产物，即底物和产物交替地与酶结合或从酶释放。好像打乒乓一样一来一去。反应过程中无三元络合物形成。双底物反应恒态动力学：Alberty推导的一般速度方程为：    Vmax A、B都饱和时的最大初速度；KmA B饱和时v0=1/2Vmax的A的浓度；KmB A饱和时v0=1/2Vmax的B的浓度；KsA E+ADEA的解离常数。 双底物动力学方程的简化： （1）在B0很高时，方程简化为：  （2）在A0很高时

29、，方程简化为： §5 酶的抑制作用许多物质与酶结合以后，影响了酶与底物的结合及酶的转化数，从而改变了酶的活力。这些降低酶催化反应速度的物质称抑制剂。很多抑制剂结构类似底物，但不被酶所催化或与底物相比反应速度极慢。 · 可逆抑制剂：以可逆方式与酶结合，可通过透析、直接稀释、凝胶过滤等物理手段使酶活性恢复； · 不可逆抑制剂：不能用上述物理手段除去。 酶的抑制作用：a. 可逆抑制作用· 竞争性抑制 原理：竞争性抑制剂结构往往与正常底物非常相似，因而与底物竞争酶分子上的同一结合部位，与酶结合的抑制剂缺乏具有反应活性的基团或处于不恰当的部位，

30、使酶无法发挥催化功能，底物不能转化为产物，上述任一情形下都会形成死端复合物(dead-end complex)。举例：丙二酸(CO2-CH2CO2-)是琥珀酸脱氢酶的竞争性抑制剂：   丙二酸与琥珀酸结构非常相似，都具有两个羧基，因而可以占据酶分子上底物的结合位点. 但由于丙二酸在两个羧基之间只有一个碳原子，不会形成双键，因而不会发生后续反应。竞争性抑制剂与底物结合部位相同：          竞争性抑制剂与底物结合部位不同：   &#

31、160;        · 反竞争性抑制 原理：反竞争性抑制剂(I)只与酶-底物复合物结合而不与自由酶结合。E + S D ES (DESI) " E + P反竞争性抑制示意图：          ESI · 非竞争性抑制 原理：不论底物分子是否与酶结合，非竞争性抑制剂都能与酶分子结合，产生死端复合物。E (DEI) + S D ES (ESI) " E + PEI D ESI

32、非竞争性抑制示意图：         · 混合型抑制 原理：若底物和抑制剂与酶的结合完全独立，这种现象就称为混合型抑制。E (DEI) + S D ES (DESI) " E + P· 部分抑制 原理：以上讨论的都是形成死端络合物的抑制，而这些复合物不会释放产物。部分抑制就是指混合型抑制中ESI复合物也能释放产物。ESI " E + P + I· 底物抑制 原理：在给定的酶浓度下，酶催化反应的速度随底物浓度的增加而加快，至极限Vmax；有时，在极高的底物浓

33、度下，初速度仍低于最大值，有时认为测定系统与过量底物之间有相互作用，但在有些情况下的确发现高浓度的底物会抑制自身转化为产物。· 产物抑制 产物对酶反应的抑制作用在生物体内较为常见，在细胞内，酶反应的产物虽然不断地为另外的酶所作用，但S和P总是同时存在的；在单底物酶反应中，产物P对反应速度的影响相当于底物S的竞争性抑制对反应速度的影响。· 变构抑制 原理：抑制剂与酶结合，引起酶构象的改变，使底物结合部位的性质发生变化和改变了后续的催化活性，而不是指形成死端复合物. 例如：某一生物合成途径表示为A " B " C " D " E &quo

34、t; F产物F作为这一合成途径中几个早期的酶(如A"B的酶)的变构抑制剂，对这一合成途径加以反馈抑制，以避免产物过量堆积。b. 不可逆抑制作用原理：抑制剂与酶的必需基团以共价键连接，将必需基团进行了化学修饰，从而引起酶活性的丧失；被修饰的基团可以很多，多至酶蛋白中相似性质的基团都被修饰，也可专一地只修饰某一个必需基团。§6 pH值和温度对酶作用的影响pH值对酶活性的影响主要是：· 使酶的空间结构破坏，引起酶活性丧失； · 影响酶活性部位催化基团的解离状态，使底物不能分解为产物； · 影响酶活性部位结合基团的解离状态，使其不能与底物结合；

35、83; 影响底物的解离状态，使底物不能和酶结合，或结合后不能生成产物。 综合上述种种原因，用酶活力对pH作图往往有钟罩形曲线，酶的作用存在一最适的pH值，它和酶的最稳定pH值不一定相同。 温度值对酶作用的影响：· 影响酶的稳定程度，酶蛋白的热变性； · 影响最大反应速度，即k2； · 影响酶和底物的结合，即影响k1或k-1 ； · 影响酶和抑制剂、激活剂或辅酶的结合； · 影响酶和底物分子中某些解离基团的pK值。  温度对反应速度的影响：根据绝对反应速度理论， (1)式 式中k 反应速度常数； KB Boltzma

36、n常数； K 反应物与活化络合物之间的平衡常数. 将热力学关系 代入(1)式   (2)式 将(2)式两边取对数，再对T微分：     (3)式 将(3)式与Arrhenius经验方程比较： 将式 改写为：    用以上方法即可测定酶反应的活化能数值。§7 酶的作用机制酶的活性部位：              

37、;  酶和底物的诱导契合模式图：           酶和底物的活性部位结合图：          提出一个酶的作用机制，应确证以下几个方面：· 底物转变为产物每一步过程的中间络合物及其基元反应次序； · 这些络合物之间相互转变的速度常数； · 络合物的结构。 基元催化反应酸碱催化：· 酸(或碱)可以通过暂时提供(或接受)一个质

38、子以稳定过渡态达到催化反应的目的，如醇与酮的异构化反应十分缓慢，若加入酸或碱催化剂，可使反应大大加快。 · 酶分子中氨基酸侧链具有质子供体和受体的功能，所以推测酸碱催化在酶分子中起了重要作用是合理的。 基元催化反应共价催化：是通过催化剂与底物的共价键结合，形成过渡态来加速反应，如伯胺催化的乙酰乙酸脱羧过程：            共价催化具有亲核、亲电过程：（1）催化剂和底物进行亲核反应形成共价键；（2）再通过同一催化剂进行亲电催化，从反应中心吸收电子。已分离出大量

39、的共价键连接的酶-底物络合物，证明酶具有共价催化机理。基元催化反应金属离子催化：在所有已知的酶中，几乎有三分之一的酶表现活性时需要存在金属离子。根据金属离子与蛋白质结合作用的大小，将需要金属的酶分成两大类：金属酶，具有紧密结合的金属离子，常见的过渡金属离子为Fe2+、Fe3+、Cu2+、Mn2+、Co3+；金属激活酶，金属离子结合较松，通常是碱金属和碱土金属离子如Na+、K+、Mg2+、Ca2+。金属酶：· 极微量的Mo和Fe存在于氧化氮还原酶、固氮菌的活化氮络合物中； · Fe是血红蛋白的组分； · Co存在于维生素B12中。 在生物体中这些金属离子含量极微。金

40、属激活酶：· 碱金属阳离子和酶以弱的结合形成络合物，细胞内含量最多的K+能激活很多酶，特别是催化磷酰基转移或消去反应的酶； · K+的作用基本上是和酶失活形式的负电荷基团结合，从而引起酶分子构象的变化，使之变为更有活性的形式；在某些情况下，K+也能促进底物的结合。 1970年Mildvan指出，在酶(E)、金属离子(M)和底物(S)之间形成三元络合物，可有以下几种形式：（1）酶桥络合物 ME S（2）底物桥络合物 E S M（3）金属桥络合物 E M S 多元催化：· 酶的催化反应通常是几个基元反应协同作用的结果； · 多元催化也是使酶反应加速的因素之一

41、。 酶作用机制的实验探测：· 动力学研究 · 中间物探测 · X-射线晶体衍射 · 氨基酸侧链化学修饰 · 定点突变 · 蛋白水解酶作用(酶的修饰) 这些方法互为补充，并应得到一致的结果。80年代初期，重组DNA技术迅速发展，如果能够得到某一蛋白质密码顺序，具有合适的表达基因的载体，这一技术已可能将氨基酸导入该蛋白质特定的位点，典型操作过程见图：定点突变的典型操作过程：             ·

42、 定点突变是评价酶分子的特定氨基酸重要性的非常有效的方法，圆二色性(circular dichroism)与分光光度技术可以快速确定酶的结构特征，在这一领域非常有用； · 定点突变首先要得到酶的基因，如果已知酶的X-射线结构，就可以很详细地描述实验结果。 举例：枯草杆菌蛋白酶对核糖核酸酶的作用，它可将酶分子水解成两部分，一部分称S-肽(核糖核酸酶一级结构中最初由20个氨基酸组成)，另一部分称为S-蛋白(由酶分子上其他104个残基组成)； 将这两部分分开，都没有活力，若将两者以等摩尔比例混合，酶完全恢复活性，推测两者对于酶的活性中心都有贡献，结合侧链修饰方法证实了第12、41和119号

43、侧链都为酶活性所必需。§8 应用酶学· 固定化酶（immobilized enzyme） · 酶在医药上的应用 · 酶法手性化合物的拆分 酶的固定化方法：载体结合法（共价结合法、离子结合法和物理吸附法）、交联法、包埋法（网络型和微囊型）。固定化酶的模式：                         

44、60; 游离的酶经固定化后所引起的酶性质的改变，其原因可能有：· 酶分子构象的改变 · 微环境的影响 · 底物在载体和溶液间存在着分配效应 · 扩散效应 药用酶类：· 促进消化酶类 · 消炎酶类 · 与纤维蛋白溶解作用有关的酶类 · 抗肿瘤的酶 酶类药物一览表品 种来 源用 途胃蛋白酶胃粘膜助消化木瓜蛋白酶木瓜果汁抗炎，消化溶菌酶鸡蛋卵蛋白抗炎，抗出血链激酶B-溶血性链球菌部分清洁，溶解血栓凝血酶牛血浆止血弹性蛋白酶胰脏降压，降血脂无花果蛋白酶无花果汁液驱虫剂青霉素酶蜡状芽孢杆菌青霉素过敏症细胞色素酶牛、

45、猪、马心脏改善组织缺氧 诊断用酶：· 临床生化的中心任务是研究并定量分析疾病时的生化改变。细胞外液(血浆、血清、尿、消化液及羊水等)，是最常用的材料。 · 大多数酶存在于活细胞内，但细胞受损时，酶则溢出并进入细胞外液，于是细胞外液酶活性增高。测定这些酶活性增高的程度、类型及持续时间，可为临床医生鉴别受损细胞，了解损伤程度，估价治疗效果提供极为有用的资料。 酶法拆分手性化合物：· 化学方法难以拆分的外消旋体，可藉酶动力学拆分。主要是利用酶或微生物与消旋化合物中两个对映体水解或还原速率不同，进行拆分以获得两个光学活性产物。 · 例如：D-苯基甘氨基

46、酸是制备抗菌类药物的重要中间体，它由化学合成法制备得到外消旋体，利用氨肽酶成功地进行了拆分。 §9 酶法制备L-氨基酸L-氨基酸的主要用途：· ·        医药领域（氨基酸输液、抗生素及多肽类药物）· ·        食品添加剂领域（风味及营养强化剂、甜味剂）· ·        饲料添加剂领域（蛋氨酸、赖氨酸、色氨酸） 国内L-氨基酸生产状况：· 生产规模小 · 生产工艺落后 · 生产品种不齐全 L-苯丙氨酸：· 学名（L-2-氨基-3-苯基丙酸） · 医药领域（人体必需的8种氨基酸之一） · 食品添加剂领域（用于合成阿司帕坦甜味剂） 酶法制备L-苯丙氨酸：苯丙酮酸 " L-苯丙氨酸（在转氨酶作用下）肉桂酸 + NH3 " L-苯丙氨酸（在苯丙氨酸解氨酶作用下）酶法制备L-丙氨酸：· 学名（L-氨基丙酸，最甜的氨基酸） · 医药领域（输