生物技术综合大实验-GFP纯化

1、生物技术综合大实验实验报告GFP的分离与纯化 姓 名： 专业班级 院 系： 指导教师： 完成日期 GFP的分离与纯化摘要： GFP，在生物领域应用广泛。本实验回顾了GFP提取纯化过程，包括细菌破碎、GFP沉淀、疏水过滤层析、透析、离子交换层析和凝胶过滤层析等步骤，来获得较纯的GFP，并运用SDS-PAGE来检测纯化效果。关键词：GFP 应用进展 层析 SDS-PAGE绿色荧光蛋白(Green fluorescent protein，GFP)是一类存在于这些腔肠动物体内的生物发光蛋白。1962年Shimomura等首先从多管水母(Aequorin victoria)中分离出一种分子量为20kDa

2、的称为Aequorin的蛋白。由于水母整体荧光及提取的蛋白质颗粒荧光都呈绿色，因此，人们将这种蛋白命名为绿色荧光蛋白。1992年Prasher等克隆了GFP基因的cDNA，并分析了GFP的一级结构；1994年Chalfie等首次在大肠杆菌细胞和线虫中表达了GFP，开创了GFP应用研究的先河，之后很快发现GFP能在多种异源细胞中表达，GFP在细胞学、分子生物学和医学、病毒学等领域中迅速掀起了一股热潮；1997年10月1822日在美国NewJersey专门召开了一次关于GFP的国际会议。1994年钱永健改造了GFP，使得GFP的荧光变强、变色。由此和Shimomura、Martin Chalfie

3、共享了2008年诺贝尔化学。从此，荧光蛋白带来了生物技术的新革命。GFP本身是一种酸性，球状，可溶性天然荧光蛋白，分子量约27×103，一级结构为一个由238个氨基酸残基组成的单链多肽。在395 nm具有最高光吸收峰，肩峰为473 nm；发射光谱max=508509nm。GFP性质极其稳定，易耐受高温处理，甲醛固定和石蜡包埋不影响其荧光性质。其变性需在90或pH<4.0或pH>12.0的条件下用6mol/L盐酸胍处理，一旦恢复中性环境，或去除变性剂，虽然变性的蛋白质并不能完全复性，但是复性蛋白质同天然蛋白质对温度、pH变化的耐受性、抗胰蛋白酶消解的能力是相同的。更重要的是

4、，它们在很大的pH范围内(pH712.2)的吸收、发射光谱也是相同的。根据Sheen等的研究，GFP在受体内表达时，其稳定性并不亚于CAT蛋白，因而可以得到持续时间较长的荧光。GFP的性质和发射光谱的稳定性是同其生色团结构的稳定性密不可分的。GFP表达后折叠，在氧存在的条件下，使66位氨基酸残基的a、键间脱氢。由6567位的氨基酸残基(Ser-Tyr-Gly)环化为稳定的对羟基苯咪唑啉酮(4-P-hydroxybene-5-imidazolinone)，形成生色团(基于组成生色团的元件不同，可将已知的GFP及其变种分为7种，每一种都有一组不同的荧光激发和发射波长)。GFP无需再加任何底物和辅助

5、因子，在紫外或蓝光激发下就能发荧光，在450490 nm蓝光激发下，GFP荧光至少能保持10 min以上，不像其他荧光素，荧光容易淬灭。GFP在生物领域的最新应用进展包括多种技术。（1）显像技术是利用荧光蛋白有多种颜色，且稳定、无毒，所以荧光蛋白可使得动物体内复杂的系统结构可视化；（2）一般的荧光染料标记的微生物，由于其生长快、分裂多，染料可在短时间内被稀释，所以不能实时准确地观察微生物侵入活体动物以及细胞的过程。近年发现，荧光蛋白可用于示踪流行性病毒对活体细胞的感染，流行性病毒可被实时监控，借助于这一新技术，我们可以更深入地研究其感染方式；（3）由于荧光蛋白发光团的形成不具物种专一性，可发出

6、荧光稳定，且不需依赖任何辅因子或其他基质而发光，所以转入宿主细胞后的荧光蛋白基因很稳定，对多数宿主的生理无影响，也是理想的报告基因；（4）荧光蛋白由于其独特的光信号转导机制，适于用作活细胞内的光学感受器。现在许多研究者将具有信号转导功能的分子识别位点结合到荧光蛋白分子上来设计成生物感受器；（5）利用GFP可显色的特点，我们还可对需要的物质进行筛选和纯化。由于新型病毒的鉴别特征有限，使得传统的抗体生产方法不能被有效运用，生产抗体便遇到了极大的困难，而GFP的发现及其在分子生物学中的应用解决了这一难题。1.材料1.1实验材料含GFP融合质粒，Top10菌株1.2实验试剂溶液：50mM 葡萄糖，10

7、mM EDTA ，25mM Tris-HCl，pH=8.0；溶液：0.2M NaOH，1% SDS；溶液：3M醋酸钾，2M 醋酸；无水乙醇，75%乙醇，TE Buffer，0.1M预冷 CaCl2，LB培养基，氨苄青霉素，阿拉伯糖，液氮，饱和(NH4)2SO4溶液，溶菌酶，苯基琼脂糖凝胶CL-4B，DEAE-纤维素；Lysis Buffer（50mM Tris-HCl，1Mm EDTA，pH8.0）；Start Buffer(A液20mM Tris-HCl，pH7.0（透析液）) ； Elution buffer(B液20mM Tris-HCl，1M NaCl，pH7.0)；PEG10000，

8、Loading Buffer，溴酚蓝，丙烯酰胺，Tris，SDS，过硫酸铵，TEMED，Gly，SDS，甘油，-巯基乙醇，溴酚蓝，甲醇，考马斯亮蓝，乙酸等。1.3实验仪器高速冷冻离心机,移液枪，超声波破碎仪，梯度混合器，恒流泵,层析柱,色谱仪,自动记录仪,SDS-PAGE电泳装置。2.方法2.1 质粒的提取具体方法如下：1.取1.5ml菌液，12000rpm离心1min，弃上清液；2.加100l溶液，充分悬浮；3.加200l溶液，温和混匀，室温5min；4.加150l溶液，混匀，冰浴5min；12000rpm离心8min，将上清加入一新的1.5ml EP管中；5.加800l无水乙醇至上清液中，

9、混匀，-20放置10min，12000rpm离心8min，弃上清；6.70%乙醇洗DNA一次，离心弃上清；在超净台中吹干DNA（一般吹5-10min即可）；7.加40l TE Buffer溶解DNA，4备用。2.2 感受态的制备及转化具体方法如下：1. 取1.5ml Top10菌液，在4，4000rpm离心10min，弃上清；2. 加200l预冷的0.1M CaCl2悬浮沉淀（无菌操作）；3. 冰浴15min后再4，4000rpm，离心10min，弃上清；4. 加200l预冷的0.1M CaCl2悬浮沉淀（无菌操作），4备用；5. 将1l质粒和感受态细胞混合，冰浴15-30min；5.42热激

10、90s；7.立即放在冰上，冰浴3-5min；8.加入800l LB液体培养基，37，150rpm培养45-60min（主要用来使Top10恢复正常生长）；9.取200l菌液涂布在LB（加入Amp 100ng/ml，阿拉伯糖4mg/ml）培养基上。37培养过夜。2.3扩大培养具体方法如下：1、取涂有含GFP质粒Top10的平板，选择单克隆（选择在紫外灯照射下有绿色荧光的单菌落）；2、挑取绿色荧光的单菌落，接种至试管中（含4ml的LB液体培养基，加有100ng/ml的Amp和4mg/ml的阿拉伯糖）37，200rpm振荡培养至对数生长期，约3-4h；3、将上述摇好的菌，按1:100转接至250ml

11、LB液中（Amp 100ng/ml，阿拉伯糖2mg/ml），37，200rpm培养过夜。2.4 细菌破碎具体方法如下：1.3000g离心10min培养好的菌，紫外灯观察，弃上清，沉淀用液氮冻融；2.用30ml lysis buffer（50mM Tris-HCl pH8.0，1mM EDTA）悬浮沉淀；3.向悬浮液中加15mg溶菌酶，混匀，室温溶解10min；4.400w功率下，超声处理10min；5.9000g，15min离心破碎液，紫外灯观察，留上清备用；（1号样品）；6.选取合适的浓度破碎(NH4)2SO4沉淀GFP：一般(NH4)2SO4浓度为30%时，杂蛋白的沉淀量是最大，浓度达到7

12、0%时GFP沉淀量达到最大（附：(NH4)2SO4浓度与含量表）；体积为10ml：(NH4)2SO4饱和度10%20%30%40%50%60%70%80%90%(NH4)2SO4（g）0.561.141.762.433.133.94.725.616.627、向上清中加5.28g(NH4)2SO4，充分溶解，室温放置20min，9000rpm离心15min，转移上清至另一试管中，再加入6.88g(NH4)2SO4，充分混匀，室温放置至少20min，9000rpm离心15min，弃上清，留沉淀备用。2.5 疏水作用层析（苯基琼脂糖凝胶）具体方法如下：1.将沉淀的GFP，用10ml 2M (NH4)

13、2SO4/lysis Buffer，pH8.0溶解，9000rpm，离心10min，留上清；（2号样品）2.用3倍体积平衡Buffer（2M (NH4)2SO4，pH8.0）平衡柱子；3.将“1”中的上清上柱，用3倍柱体积的Wash Buffer（1.3M(NH4)2SO4，pH8.0）洗柱子；4.用恒流泵泵TE Buffer（Elution Buffer：10mM Tris, 1mM EDTA，pH8.0）洗柱，紫外灯检查，GFP快流出时，准备收集；5.将收集液透析过夜。（3号样品）。2.6离子交换层析（DEAE-纤维素）具体方法如下步骤：1.将透析后所得的透析液9000rpm离心10min

14、，弃去沉淀；(4号样品)2.用3倍体积的Start Buffer（A液）平衡柱子；3.将“1”中所得的上清液上柱，再用3倍柱体积的Start buffer洗柱子；4.梯度洗脱GFP；梯度液：Start Buffer A液（20mM Tris-HCl，pH7.0（透析液）；Elution Buffer B液（20mM Tris-HCl，1M NaCl，pH7.0）；紫外灯观察，GFP快流出来时，准备收集；5.将收集液透析过夜（透析液为A液）。2.7凝胶过滤层析（交联葡聚糖）具体方法如下：1.将透析液置入含pEG10000的培养皿中，浓缩至体积约2ml；（5号样品）2.用20mM Tris-HCl

15、，pH7.0，3倍柱体积平衡柱子；3.将“1”中所得的GFP上柱，用20mM Tris-HCl，pH7.0洗柱子，紫外灯检测，GFP快流出时，收集，备用。（6号样品）。2.8 SDSPAGE具体方法如下：将收集的各样品加入等体积的2×SDS-PAGE Loading Buffer，煮沸裂解5min，冰浴2min，12,000rpm离心10min，取上清-20保存备用。1.按照电泳装置的使用说明，装好洁净干燥的玻璃板。2.分离胶的制备按下列成分配制分离胶：试剂体积ddH2O8.2 mL30%丙烯酰胺混合液6.68mL1.5M Tris(pH8.8)5.0mL10%SDS0.1 mL10

16、%过硫酸铵0.1 mLTEMED0.04 mL各成分加入后迅速旋涡混匀，用微量移液器将其小心地注入准备好的玻璃板间隙中，并为积层胶留出足够空间。轻轻在顶层加入一薄层水封顶，以防止空气中的氧对凝胶聚合的抑制作用。凝胶聚合完成后，倒掉覆盖的水层，用水清洗凝胶顶部数次，用滤纸吸干凝胶顶端的水。3.浓缩胶的制备按下列成分配制2mL 5%的积层胶：试剂体积ddH2O7.35mL30%丙烯酰胺混合液1.3mL1.5M Tris (pH6.8)1.25mL10%SDS0.1mL10%过硫酸铵0.1mLTEMED0.1mL各成分加入后迅速旋涡混匀，用微量移液器将其灌注到分离胶上，灌满后小心插入加样梳，尽可能避

17、免产生气泡；4.待积层胶凝固后，小心拔下梳子；5.将凝胶固定于电泳装置上，加入足量的1×Tris-甘氨酸电泳缓冲液，在加样孔中分别加入20L各样品；6.样品在积层胶中电泳时，使用80V电压，待溴酚蓝带进入分离胶后，将电压升至120V，继续电泳直至溴酚蓝带到达分离胶的底部且开始泳出胶底面，关闭电源；7.卸下凝胶，将其浸泡在至少5倍体积的考马斯亮蓝R-250染色液（50%甲醇、0.05%考马斯亮蓝、10%乙酸、40%ddH2O）中，置水平摇床上室温染色至少4h，之后取出染色的凝胶并回收染液，以备再用，将凝胶浸泡于考马斯亮蓝脱色液（与染色液同，只是无考马斯亮蓝）中，在水平摇床上脱色48h，

18、其间更换脱色液34次，直至凝胶脱色到条带清晰为止，观察记录结果并拍照（本次实验中只染色45min，脱色1h左右）。（注：由于浓缩胶制备过程中凝固太快，所以最后未使用浓缩胶而只用分离胶进行的SDS-PAGE）。3.结果3.1 挑取单菌落在暗示中，用紫外灯照射下，发现单菌落发出绿色荧光。3.2 细菌破碎中第一步离心后图片细胞破碎后，蛋白质流出细胞外，在紫外照射下，整个细胞破碎液发出绿色荧光。3.3疏水层析结果（借鉴第一组的图）杂蛋白峰GFP峰疏水层析时，利用GFP和其他蛋白疏水性不同，分开从柱子里流出来。蛋白记录仪可通过出现波峰的形势记录蛋白的含量。GFP是较纯的蛋白，量大显示出峰值高；而杂蛋白量

19、少出现不规则的峰。3.4离子交换层析GFP峰离子交换层析利用是以离子交换剂为固定相，依据流动相中的组分离子与交换剂上的平衡离子进行可逆交换时的结合力大小的差别而进行分离的一种层析方法。3.5凝胶过滤层析凝胶过滤层析法又称排阻层析或分子筛方法，主要是根据蛋白质的大小和形状，即蛋白质的质量进行分离和纯化。层析柱中的填料是某些惰性的多孔网状结构物质，多是交联的聚糖（如葡聚糖或琼脂糖）类物质，使蛋白质混合物中的物质按分子大小的不同进行分离。一般是大分子先流出来，小分子后流出来。3.6 SDS-PAGE结果图其中样品1为细菌破碎样，样品2为疏水层析前离心样，样品3为疏水层析样，样品4为离子交换层析前离心

20、样，样品5为离子交换层析后的透析浓缩样，样品6为凝胶过滤层析样。标出来的为GFP条带，大小在2535kDa。4.分析讨论4.1实验评价及该进措施从最后的电泳图可以看出，前3个样品出现明显的拖尾现象，整个条带都明亮，说明杂蛋白质较多，随着运用多种纯化技术，GFP纯度越来越高，故在样品4、5、6的条带中，蛋白的分子量主要在2535kDa。图中提取的蛋白质纯度较高，所以本次试验较为成功。关于后续的进一步纯化，可采用结晶和重结晶方法来进一步提高蛋白质的纯度，并消除少量的杂蛋白和盐离子。试验中存在一些缺陷，如电泳图看出，整体跑胶效果不好，原因是未使用浓缩胶，而且染色时间过短。4.2 SDS-PAGE的样

21、品缓冲液中有哪些成分？它们有什么作用？为什么要将样品和缓冲液混合后煮沸？SDS-PAGE的样品缓冲液的主要成分有Tris-HCl，SDS，甘油，溴酚蓝和-巯基乙醇，其中Tris-HCl的主要作用是调节pH；SDS的作用主要是使蛋白质变性，断裂蛋白质分子间和分子内的氢键，使蛋白质分子去折叠，破坏蛋白质的二级和三级结构；甘油是增加密度，使蛋白质能很好的沉淀在下面；溴酚蓝作为指示前沿，防止电泳时间过长；-巯基乙醇作为保护剂，防止空气中的氧对蛋白质的氧化作用，同时还能断裂蛋白质分子中半胱氨酸残基中的二硫键。4.3常用的交联葡聚糖有G-25、G-50、G-75其中的25、50、75指的是什么？这种凝胶的排阻极限分别为多少？交联葡聚糖G-25、G-50、G-75中的25、50、75指的是1g交联葡聚糖干胶膨胀时所吸收水克数的10倍，如G-25中的25指1g这种交联葡聚糖干胶膨胀时要吸水2.5g。排阻极限是指不能进入凝胶颗粒孔穴内部的最小分子的分子量。所有大于排阻极限的分子都不能进入凝胶颗粒内部，直接从凝胶颗粒外流出，所以它们同时被最先洗脱出来。排阻极限代表一种凝胶能有效分离的最