分子生物学实验技术核酸的凝胶电泳PPT学习教案

1、会计学1分子生物学实验技术核酸的凝胶电泳分子生物学实验技术核酸的凝胶电泳第1页/共42页第2页/共42页Home第3页/共42页第4页/共42页第5页/共42页第6页/共42页（二）（二）DNA的迁移速率决定因素的迁移速率决定因素第7页/共42页第8页/共42页第9页/共42页第10页/共42页 琼脂糖类型琼脂糖类型凝结温度凝结温度/熔化温度熔化温度/ 标准琼脂糖标准琼脂糖35389095不同厂家不同厂家生产的不生产的不同商品其同商品其凝结温度凝结温度和熔化温和熔化温度有一定度有一定差异差异40428590 高强度琼脂糖高强度琼脂糖34438595 修饰的低熔点修饰的低熔点/ 凝点琼脂糖凝点琼

2、脂糖253563653565 超低熔点超低熔点8154045 低黏性低熔点琼低黏性低熔点琼脂糖脂糖25307038853075第11页/共42页浓浓 度度（%）标标 准准(kb)高强度高强度(kb)低熔点低熔点(kb)低黏度低低黏度低溶点溶点(kb)0.31500.50.7250.80.5150.8100.8101.00.25120.480.481.20.1560.370.371.50.0840.240.242.00.130.133.00.0510.514.00.10.56.00.010.1第12页/共42页 7 7 电泳缓冲液电泳缓冲液 常用的有常用的有TAETAE、TPETPE及及TBET

3、BE第13页/共42页 都是常用电泳缓冲液。三者相比：都是常用电泳缓冲液。三者相比：1 1）TAETAE的缓冲容量最低，如长时间电泳会被消耗，此时的缓冲容量最低，如长时间电泳会被消耗，此时凝胶的阳极一侧将发生酸性化；凝胶的阳极一侧将发生酸性化；2 2）TBETBE和和TPETPE比比TAETAE花费稍贵，但有高得多的缓冲容量；花费稍贵，但有高得多的缓冲容量；3 3）双链线状双链线状DNADNA片段在片段在TAETAE中比在中比在TBETBE或或TPETPE中迁移快中迁移快10%10%；4 4）对于高分子质量的对于高分子质量的DNADNA，TAETAE的分辨率略高于的分辨率略高于TBETBE或或

4、TPETPE，对于低分子质量的，对于低分子质量的DNADNA，TAETAE要差些。超螺旋要差些。超螺旋DNADNA在在TAETAE中的电泳分辨率要好于中的电泳分辨率要好于TBETBE。 第14页/共42页载样缓冲液：载样缓冲液：临上样到临上样到凝胶加样孔凝胶加样孔之前与待之前与待电泳的样品相混合的一种缓冲液。电泳的样品相混合的一种缓冲液。载样缓冲液有三个作用：载样缓冲液有三个作用：1 1）增加样品密度保证）增加样品密度保证DNADNA沉入加样孔内；沉入加样孔内；2 2）使样品带有颜色便于简化上样过程；）使样品带有颜色便于简化上样过程；3 3）其中的染料在电场中以可以预测的泳动）其中的染料在电场

5、中以可以预测的泳动速率向阳极迁移。速率向阳极迁移。第15页/共42页类型类型6 缓冲液缓冲液贮存温度贮存温度I0.25%溴酚蓝溴酚蓝40.25%二甲苯氰二甲苯氰FF40% (m/V)蔗糖水溶液蔗糖水溶液II0.25%溴酚蓝溴酚蓝室温室温0.25%二甲苯氰二甲苯氰FF15% Ficoll(Type400)水溶液水溶液III0.25%溴酚蓝溴酚蓝40.25%二甲苯氰二甲苯氰FF30%甘油水溶液甘油水溶液IV0.25%溴酚蓝溴酚蓝440% (m/V)蔗糖水溶液蔗糖水溶液第16页/共42页 通过染色通过染色, 紫外灯下检测。紫外灯下检测。 主要有溴化乙锭（主要有溴化乙锭（ethidium bromid

6、e, EB）染色法和）染色法和SYBR Gold染色法。染色法。第17页/共42页第18页/共42页第19页/共42页第20页/共42页第21页/共42页第22页/共42页第23页/共42页第24页/共42页 可以用透射或入射紫外光对可以用透射或入射紫外光对EBEB染色的凝胶染色的凝胶成像，图像可以直接输出到计算机观察。成像，图像可以直接输出到计算机观察。第25页/共42页现一般采用试剂盒回收：现一般采用试剂盒回收： 存在的主要问题：存在的主要问题：1 1 不能有效的回收大片段不能有效的回收大片段DNA DNA 2 2 不能有效回收少量不能有效回收少量DNA DNA Home第26页/共42页

7、第27页/共42页第28页/共42页酰胺和双功能交联剂的浓度。酰胺和双功能交联剂的浓度。（一）（一） 聚丙烯酰胺凝胶的本质聚丙烯酰胺凝胶的本质第29页/共42页第30页/共42页第31页/共42页第32页/共42页丙烯酰胺浓度丙烯酰胺浓度（%）有效分离范围有效分离范围（bp）二甲苯氰二甲苯氰FF溴酚蓝溴酚蓝3.5100020004601005.080500260658.0604001604512.040200702015.025150601520.061004512注注:N,N-:N,N-亚甲双丙烯酰胺的浓度为丙烯酰胺的亚甲双丙烯酰胺的浓度为丙烯酰胺的1/301/30; ; Home第33页/共42页第34页/共42页第35页/共42页第36页/共42页B+A-+A-B脉冲电场电泳示意图脉冲电场电泳示意图第37页/共42页第38页