武汉大学天然产物的提取茯苓

1、天然产物茯苓提取研究进展武汉大学化学学院应用化学系(200622030137) 1.研究意义 2.研究对象简介 3.主要成分 4.主要成分提取流程 5.分析方法 6.研究新进展 7.参考文献 茯苓Poria cocos (Schw. )Wolf 为常用中药, 性味甘淡,平,具有祛湿利水、健脾和胃、宁心安神的作用,用于治疗小便不利,水肿胀满,痰饮咳逆,呕秽,泄泻,遗精,淋浊,惊悸,健忘等。茯苓单用或与其他药物配伍广泛应用于临床,名医洪竹书先生茯苓、甘草每方必用。茯苓在中医临床及人民生活中有着广泛的使用价值。近些年来,国内外对茯苓多糖、三萜类等成份及其药理作用、生物活性方面作了较多的研究,并且有了

2、较大的进展。从茯苓的药理作用与社会、经济发展的眼光看, 其开发的前景会越来越受世人的广泛关注。 我国食用茯苓的历史已有两千多年。神农本草经将茯苓列为“上品”，称其“久服安魂养神，不饥延年”。南朝医学家陶弘景辞官隐退后，梁武帝即令“每月赐茯苓五斤，白蜜二斤，以供服饵”。可见当时茯苓被视为延寿珍品。唐宋时服食茯苓更加普遍，唐诗人贾岛就有“二十年中饵茯苓，致书半是老君经”之诗句。 常见者为其菌核体。多为不规则的块状，球形、扁形、长圆形或长椭圆形等，大小不一，小者如拳，大者直径达2030厘米，或更大。表皮淡灰棕色或黑褐色，呈瘤状皱缩，内部白色稍带粉红，由无数菌丝组成。子实体伞形，直径0.52毫米，口缘

3、稍有齿；有性世代不易见到，蜂窝状，通常附菌核的外皮而生，初白色，后逐渐转变为淡棕色，孔作多角形，担子棒状，担孢子椭圆形至圆柱形，稍屈曲，一端尖，平滑，无色。有特殊臭气。 寄生于松科植物赤松或马尾松等树根上，深入地下2030厘米。 加工:茯苓出土后洗净泥土，堆置于屋角不通风处，使其“发汗”，析出水分。然后取出，将水珠擦去，摊放阴凉处，待表面干燥后再行发汗。切制:于发汗后趁湿切制，亦可取干燥茯苓以水浸润后切制。将茯苓菌核内部的白色部分切成薄片或小方块，即为白茯苓；削下来的黑色外皮部即为茯苓皮；茯苓皮层下的赤色部分，即为赤茯苓；带有松根的白色部分，切成正方形的薄片，即为茯神。切制后的各种成品，均需阴

4、干，不可炕晒，并宜放置阴凉处，不 能 过 于 干 燥 或 通 风 . 以 免 失 去 粘 性 。 茯苓的主要化学成分为:多糖、三萜、脂肪酸、甾醇、酶等。 茯苓主含-茯苓聚糖(-pachyman)约占干燥品的93%,是具有-(1 6)吡喃葡萄糖为支链的(13)葡萄糖聚糖。另外还有茯苓次聚糖(pachymaran),木聚糖(xylam),-茯苓多糖f(-pachyman f),羧甲基茯苓多糖(Carboxymethyl pachymaran, CMPA)。 从茯苓中分离出39种三萜,主要分为以下几类:羊毛甾-8-烯型三萜类化合物(Lanosta-8-ene type triterpenes) 羊毛

5、甾-7,9(11)-二烯型三萜类化合物(Lanosta-7,9(11)- diene type triterpenes) 3,4-开环-羊毛甾-7,9(11)-二烯型三萜(3,4-seco-lanostan -7,9(11)-diene type triterpenes)该类化合物仅存在于茯 苓皮中 甾醇类主要存在于茯苓的石油醚、乙醚提取部位,其中主要含有 Ergosterol , Ergost - 7 - en - 3- ol , (22E) Er- gosta - 5 , 7 , 9 (11) , 22 - tetraen - 3- ol , Ergosta - 5 , 7 di-en -

6、 3- ol , (22E) - Ergosta - 6 , 8 (14) , 22 - trien - 3- ol ,(22E) - Ergosta - 7 , 22 - dien - 3- ol , (22E) - Ergosta - 8(14) , 22 - dien - 3- ol 辛酸( Caprylic acid) , 十一酸( Undecanoicacid) , 月桂酸(Lauric acid) , 十二酸(Dodecanoic acid) , 棕榈 酸(Palmitic acid) 等 ; 组氨酸, 甲壳素, 蛋白质, 卵磷脂, 左旋葡萄糖, 腺嘌呤, 胆碱, 树胶, 脂肪及酶

7、等; 无机元 素钙, 镁, 铁, 钾, 钠, 锰, 磷, 硫, 硅, 铬, 镉, 铜, 铅及 氯 。 茯苓多糖的提取主要是使用溶剂提取法,如下: 准确称取茯苓500g ,切成碎片,加入46 倍量的水,回流提取3 次,时 间分别是3 ,2 和1h。合并3 次提取液滤过,除去不溶性杂质,得2000ml 滤液。取600ml减压蒸馏浓缩76ml ,在搅拌下加入乙醇,使含醇量达到80 % ,静置12h ,离心,收集沉淀,加蒸馏水60ml 溶解煮沸,趁热滤除不溶物,滤液在搅拌下再加入乙醇,使含醇量达到80 % ,放置,析出褐色沉淀后,低温干燥,即得茯苓多糖粗品。再经过一定处理制得精品。 用稀碱(1.0mo

8、l/ l的NaOH)分别处理水提后的茯苓渣。把用水提后的茯苓渣分别用5倍量的碱液置于不同的温度下泡4小时,此时溶液呈粘稠状,离心得上清液,把渣再用3倍量的碱液提取一次,所得上清液与合并,抽滤,滤液以10%的醋酸液中和至pH=6,再加3倍量的95%的乙醇,于4 放置过夜,离心沉淀,Smith降解,流水透析两天,再依次用蒸馏水,无水乙醇,丙酮,乙醚洗涤后,真空干燥。 白茯苓1 000 g ,用无水乙醇浸泡20 h ,过滤,滤液浓缩至干,得浓缩物8.17 g ,取8 g 用适量硅胶H 吸附,加在装有80 g 硅胶H 的真空快速色谱柱(VLC) 上,依次用石油醚、石油醚-乙酸乙酯( v v = 7 3

9、) 和乙酸乙酯洗脱,得到不同极性的三部分,其中石油醚2乙酸乙酯部分浓缩后用20 cm 20 cm 的硅胶GF254薄层板,在环己烷-乙酸乙酯-冰醋酸 ( v v v = 6 4 0.5) 中进行分离,甲醇重结晶得到晶( ) 3.4 mg ,晶( ) 14 mg ,晶( ) 25 mg. 取由真空快速层析柱上收集到的主含茯苓四环三萜( ) , ( ) , ( ) 的样品500 mg 用150 mL 丙酮溶解,加入1 g 无水碳酸钾和1 mL 1 ,2-二溴乙烷,回流4 h 后,荧光检测. 反应液过滤,浓缩后用20 cm 20 cm 的硅胶GF254薄层板, 在苯2石油醚2乙酸乙酯( v v v

10、= 3 2 1)溶剂系统中分离,甲醇重结晶,得目标物: ( 1) 2.1 mg , ( 1) 4.8 mg , ( 1) 12 mg. 用同样方法与1-溴-3-氯丙烷、1-碘丙烷反应得目标物( 2) , ( 2) , ( 5) , ( 2) . 取( 2) 200 mg ,加入2 mL 吡啶和1 mL 醋酸酐,室温搅拌24 h 后,用6 mol/ L盐酸将反应液调pH 3 左右,用乙酸乙酯提取,荧光检测,将乙酸乙酯液浓缩,用20 cm 20 cm 硅胶GF254薄层板,在苯-石油醚-乙酸乙酯( v v v = 2 2 015) 中进行分离,甲醇重结晶,得目标化合物( 3) 60 mg ,用同样

11、方法制得目标物( 4) , ( 3) , ( 4) . 取( 2) 250 mg 溶于20 mL 二氯甲烷中,加入吡啶嗡氯铬酸盐( PCC) 600 mg ,室温搅拌10 h后,用20 cm 20 cm 的硅胶GF254薄层板,在苯-石油醚-乙酸乙酯( v v v = 3 2 1) 中进行分离,甲醇重结晶,得目标物( 5) 100 mg. 取( 2) 400 mg 溶于8 mL 无水乙醇中,加120 mg 盐酸羟胺8 mL 吡啶,回流10 h 后,用6 mol/ L盐酸将反应液调pH 3 左右,用乙酸乙酯提取,荧光检测,将乙酸乙酯液浓缩后,用20 cm 20 cm硅胶GF254薄层板,在苯-石

12、油醚-乙酸乙酯( v v v = 3 2 1) 中进行分离,甲醇重结晶,得目标物( 3) ,用同样方法制得目标物( 6) . 晶( ) 、晶( ) 和晶( ) 经元素分析、红外光谱、紫外光谱、质谱、核磁共振氢谱及碳谱等分析以及与文献对照,确定结构如图 1所示. 所制备的14 个茯苓四环三萜衍生物均未见文献报道,其结构经元素分析、红外光谱、紫外光谱、质谱及核磁共振谱等确证无误(见图2 ,图3) . 多糖在强酸作用下水解生成单糖,并迅速脱水生成糠醛,糠醛与酚性物质如苯酚缩合成有色化合物,反应迅速,完全,有色物质稳定,并且有色物生成量与多糖浓度存在定量关系,这样用分光光度法在适当波长处可以得到多糖含

13、量。本法简便快速,易行。 精密吸取对照品溶液1. 0ml ,和供试品溶液1. 0ml ,分别置于20ml 的试管中,各精密加入5 %的苯酚液1. 0ml ,然后缓慢精密加入5. 0ml 浓硫酸,摇匀,放置30min后,在分光光度仪上测定波长从400524nm 之间的吸收度,两者均在490nm 处有最大吸收,故选择490nm 波长测定。 根据实验测得最佳反应条件是:5 %苯酚2. 0ml ,浓硫酸6. 0ml ,加酸后 放置 30min ,反应温度为室温。 精密量取葡萄糖对照品溶液0 ,0. 1 ,0. 2 ,0. 4 ,0. 5 ,0. 6 ,0. 7 和0. 8ml 置于20ml 试管中,分

14、别加水至1. 0ml 再分别加入5 %苯酚溶液2. 0ml ,等充分混合后,然后加入浓硫酸6. 0ml ,再充分混合, 放置室温, 在490nm处测得吸收度分别为0. 121 , 0. 249 , 0. 495 ,0. 614 ,0. 730 ,0. 815 和0. 913 。求得标准曲线的回归方程: A = 0. 02282 c + 0. 02453 ( r = 0. 9994 , n = 7) 。 吸取供试品溶液1. 0ml 3 份,分别置于20ml 试管中,加入5 %苯酚溶液2. 0ml ,混合后加入浓硫酸6. 0ml ,放置30min ,在490nm 处分别测得其吸收度A 值:A1 =

15、0. 871 ,A2 = 0. 872 ,A3 = 0. 876 ,根据回归方程求出百分含量为74. 16 % , 74. 27 % 和74. 62 % , 平均含量74. 35 %。 红外光谱用于三萜类化合物的结构测定, 主要根据区域A (1355 1692 cm - 1 ) 和区域B(1245 1330 cm - 1) 的碳氢吸收来区别四环三萜型和其它类型. 四环三萜的A ,B 区各有一个峰, 而齐墩果烷型和乌索烷型在A 区或B 区都有2 个或3 个峰. 茯苓中羊毛脂甾烷型和3, 4 开环羊毛脂甾烷型三萜化合物的21 个成分中, 只有化合物(1) , (3) , (8) 和(10) 的环上

16、双键为8 位双键, 其它17 个均为7, 9 (11) 异环双烯, 这在茯苓三萜化学成分的紫外光谱分析中极为有用, 且在紫外光谱的242 (或243, 244) nm 处有最大吸收, 吸光系数一般在10000 以上. 在三萜类化合物的结构测定中, 质谱分析具有重要地位. 不同母核的三萜类化合物均有各自的裂解特征, 并遵循一定的规律, 产生一系列特征的碎片离子峰. 1HNMR 谱中主要信号来自双键质子, 连氧碳质子和甲基质子, 而13CNMR 谱中信号一般来源于环内和环外双键碳原子, 且所处位置不同, 其碳原子化学位移亦有明显差别, 一般不受取代基团的影响, 以此判断其母核骨架类型、双键位置和解

17、决某些立体化学问题. 茯苓多糖体具有增强免疫功能的作用。它具有抗胸腺萎缩及抗脾脏增大和抑瘤生长的功能。羧甲基茯苓多糖还是免疫调节、保肝降酶、间接抗病毒、诱生和促诱生干扰素、减轻放射副反应、诱生和促诱生白细胞调节素等多种生理活性,无不良毒副作用。有实验证明,茯苓多糖确有针对性地保护免疫器官,增加细胞免疫功能,从而改善机体状况,增加抗感染能力,尤其对老年人免疫功能有较强作用。另外茯苓聚糖还具有抗肿瘤作用和防石作用。最近有实验证实,茯苓多糖能有效抑制大鼠肾内草酸钙结晶的形成和沉积,具有较好的防石作用。Roberton 等认为,尿液中主要抑制结石形成的物质是酸性粘多糖。但茯苓多糖的防石作用机制是否与酸

18、性粘多糖一致,有待进一步研究证实。 茯苓多糖及其衍生物(羧甲基茯苓多糖、羧甲基茯苓聚糖等) 的开发应用, 目前还处于研究阶段, 以茯苓多糖衍生物作添加剂制成茯苓饮料的工作, 目前已有人开始进行。由于羧甲基茯苓多糖、羧甲基茯苓聚糖同羧甲基淀粉钠(CM S) 一样具有水溶性和增稠性, 由此可配制成茯苓系列保健食品。如茯苓冰淇淋、茯苓奶油蛋糕、茯苓果酱等。还可同固体饮料如豆浆晶、菊花晶、麦乳晶、果汁晶配伍制成茯苓系列饮料。在医学上, 茯苓多糖对肝炎、鼻咽癌和胃癌等患者有一定的疗效, 能增强机体的免疫功能, 特别引人注目的是羧甲茯苓多糖不仅是低浓度干扰素的诱生剂, 而且是理想的干扰素促生剂, 可提高单

19、位细胞干扰素的产量。据近期的研究报道, 发现茯苓中含有微量抗癌元素有机锗。湖北省化学研究所与海南应用技术研究所合作, 正在开发一种茯苓花生奶茶, 试制研究表明, 该饮料酸甜适口、营养丰富、性能稳定, 是一种新型的天然饮品, 已引起不少厂家的兴趣。 茯苓素体外对小鼠白血病L210细胞的DNA 合成有明显不可逆的抑制作用,可显著抑制L1210C 的核苷转运,抑制L1210DNA 合成的补偿途径的各个环节,对胸苷激酶有一定抑制作用。且茯苓素对抗癌药有一定增效作用。茯苓素在体内外均有明显增强巨噬C 产生诱生肿瘤坏死因子的能力 。 茯苓由三萜1 和12 作为蛇毒液的磷脂酶A2 (PLA2) 的抑制剂,P

20、LA2 可抑制多种炎症过程。 茯苓三萜及其衍生物抑制蛙口服五水CuSO4 引起的呕吐。实验证明,侧链上C -24 位具有末端双键基团的三萜显示对蛙有止吐作用。 茯苓三萜类成分除了具有上述功效外还具有增强免疫功能,利尿等作用。近年来, 国内学者对传统中药茯苓应用现代医学的实验研究与临床观察方法和手段进行了深入广泛的研究, 进一步探明了茯苓许多与现代医学相关而原来未知的功效。 其发展也相当迅猛,很早以前, 我国食用茯苓就有“南糕北饼”的传统习惯。茯苓食品的一些品种在我国曾一度失传。近年来随着食品疗法的重新兴起, 茯苓食品也得到了发展, 许多茯苓食品相继问世。在北京可以买到茯苓夹饼, 崇文门外的应市早点中还有“茯苓豆沙