第二章 发酵工业菌种改良3

1、一、蛋白质工程育种n酶或者蛋白质在医药、工业和环境保护中起着重要的作用，为了获得具有新功能的酶或者蛋白质，可以通过寻找新的物种，再从中分离筛选新蛋白，或者通过对天然功能蛋白进行改造的方法实现。n目前，根据实验的指导思想，可以把蛋白质工程方法分为理性设计（定点突变、定向改造）和非理性的体外定向进化（随机化突变、定向筛选）两大类。1 定点突变技术n基于蛋白质工程的理论，以蛋白质结构和功能的计算机预测为基础，设计新的蛋白质氨基酸序列，应用重组DNA技术设计并构建具有新性质的蛋白质或酶的过程。n适用于三维结构已被解析的蛋白质。n普遍用于菌种改良。定点突变2 融合蛋白和融合酶技术n利用蛋白质的结构允许某

2、个结构的插入与融合，运用DNA重组技术使不同基因或基因片段融合，经合适的表达系统表达后即可获得由不同功能蛋白拼接在一起而形成的新型多功能蛋白。n应用于多功能工程酶的构建和研究。定向进化技术n可以在尚不知道蛋白质空间结构或者根据现有的蛋白质结构知识尚不能进行有效的定点突变时，借鉴实验室手段在体外模拟自然进化的过程（随即突变、重组和选择），使基因发生大量变异并定向选择出所需性质或功能的蛋白质。定向进化的原理定向进化的原理随机突变或重组随机突变或重组克隆克隆 筛选或选择筛选或选择定向进化随机突变选择定向进化随机突变选择Evolution gradual changesnatural evolutio

3、n spontaneous mutations recombination natural selectionApplied Molecular GeneticsDarwins evolution theory complexity of life is the result of an algorithm of mutation, recombination & natural selectionRevolution very fast changeslaboratory evolution enhanced mutation rate molecular breeding selectio

4、n/screeningLaboratory evolution differs from natural evolution in that there is a functional goal. In this sense it is “directed” and more like breeding. In addition, it is extremely fast. 定向进化与自然进化的异同点定向进化与自然进化的异同点定向进化的实质是达尔文进化论在分子水平上的延伸和应用。定向进化是在体外模拟突变、重组和选择的自然进化，使进化朝着人们需要的方向发展。n进化动力不同： n保守突变 非保守取

5、代；n进化方向不同 n适应 突变的积累； 进化速度不同： 非常漫长 只需几年、甚至几天； 进化目标不同： 适应环境 超越生物学意义的要 求，探索所希望的蛋白质在顺序空间的可及性。随机突变的策略随机突变的策略易错PCR技术(error-prone PCR)DNA改组(DNA shuflling)：由美国Stemmer 于1994 年首次提出 一项体外重组技术易错易错PCRPCR易错 PCR（error prone PCR）是通过改变PCR的反应条件，增加DNA聚合酶在扩增时碱基错配的概率。相对简单、快速、廉价的随机突变方法错位PCR增加错配几率的条件n降低一种dNTP的量，以dITP来代替，使碱

6、基在一定程度上随机错配n使用错配概率较高的DNA聚合酶(Taq)n增加镁离子浓度，稳定非互补的碱基配对n加入锰离子，降低聚合酶对模板的特异性Random mutagenesis & recombinationA. error-prone PCR B. DNA shufflingDNaseIPCRscreen and select screen and select* * PCR* * * * * * * * librarylibraryTopics in EnzymologyA. error-prone PCRscreen and select* * * * * * PCRPCR* * * *

7、 * * * libraryshuffling易错易错PCRDNA改组改组DNA随机重组n将一组紧密相关的核酸序列随机片段化，这些片段通过自配对PCR或重组装PCR延伸，最后组装成一个完整的全长核酸序列。主要步骤n目的DNA片段的获得n随机片段化 用DNase I处理n重组装PCR或者无引物PCRn筛选或选择 加入引物进行常规PCRDNA Shuffling:项目进化速度进化对象进化周期影响对象突变效率常规定向进化缓慢进化整个基因组多年完整基因组低DNAShuffling快速进化特定基因/操纵子/病毒几天部分基因组高DNA Shuffling与常规定向进化的比较类 型示 例特 性活性增加倍数潜

8、在应用领域抗 体 人源抗体亲和性400生物制药酶天冬氨酸转氨酶催化特异性10，000生物制药 -内酰胺酶抗生素抗性32，000抗生素枯草杆菌蛋白酶E耐热性65耐热时间17200工业酶细胞因子人类干扰素抗病毒285，000基因治疗肿瘤抑制因子P53 37半衰期12基因治疗代谢途径砷酸盐代谢途径砷酸盐解毒40生物制药汞代谢途径汞解毒12生物制药部分DNA Shuffling技术的研究成果二 代谢工程育种n改变代谢途径 改变分支代谢途径的流向，阻断其他代谢产物的合成n扩展代谢途径 引入外源基因使原来的代谢途径向后延伸，产生新的末端产物；或者向前延伸，利用新的原料n转移或构建新的代谢途径n将催化一系列

9、生化反应的多个酶基因克隆到不能产生某种代谢产物的微生物中，使其获得产生新的化合物的能力；克隆少数基因，使原来的代谢途径连起来，产生新的代谢产物；将催化某一代谢途径的基因组克隆到另一微生物中，使之发生代谢转移，产生目的产物。第五节 菌种保藏n菌种退化n生产菌种或选育过程中筛选出来的较优良菌株，由于进行接种或保藏之后，群体中某些生理特征和形态逐渐减退或者完全丧失的现象。1 常见的退化现象n目的代谢物合成能力降低，产量下降n发酵力和糖化力降低n孢子数量减少或增加n部分菌落变小或更大n生长能力更弱n生长速度变慢n菌种退化的本质：基因突变引起的生产能力下降n连续传代是加速发生退化的直接原因。2 菌种保藏

10、的原理n根据微生物的生理、生化特点，人工地创造条件，使微生物的代谢处于不活泼、生长繁殖受到抑制的休眠状态。n首先选取优良纯种，最好是休眠体n其次要创造最有利于休眠的环境条件(低温、干燥、缺氧、缺营养)3 保藏方法n斜面保藏法（低温）n将菌种接种在不同成分的斜面培养基上，待菌种生长完全后，便置于4度左右的冰箱中保藏，每隔一段时间进行移植培养，再将新斜面继续保藏。n适用范围是各类微生物 3-63-6月月n特点：操作简单，不需要特殊设备矿油封藏法n原理：低温、缺氧、缺营养n方法：取细沙过40-60目筛，用10%盐酸处理2h，水洗至中性，烘干。取肥沃园土过筛，将细土与沙按1：2（质量比）混合，分装入安

11、醅管内约2厘米高，加棉塞，间歇灭菌（三次）。灭菌后的的沙土，放在培养基上培养，经检查确认无菌后备用。n将菌苔已长好的斜面，注入无菌水3-5ml，用接种针轻轻将菌苔刮下，使其形成菌悬液。用无菌滴管吸取菌液滴入沙土管中，滴入菌液量以管中沙土全部湿润为度，沙土和菌液在管中高度约2cm，把装了菌液的沙土管放在装有干燥剂的真空干燥器，接通真空泵抽干，放在干燥器内，置5-8度冷库中保存。n适用于产孢子的微生物，产芽孢的细菌，放线菌和霉菌n特点是简单易行，工作量大，费人力。n保藏时间保藏时间1-21-2年年n冷冻真空干燥法n原理：低温、干燥、缺氧n适合各类微生物n特点：保藏时间长5-155-15年，存活率高，变异率低，手续较麻烦，需要一定设备，操作较严格n液氮超低温保藏法n菌种置于保护剂中，预冻后保存在液氮超低温冰箱中（ -196）。适用于各种微生物的较理想的保藏方法。 15年以上n长期保存的方法，保存时间最长，需特殊设备，操作较复杂。4 保藏菌种的质量控制n制备前反复核对，监测生理生化指标，与亲本特征比较n制备后，按3%抽样检查n注重连续性国内外菌种保藏机构国内外菌种保藏机构外外中国微生物菌种保藏委员会中国微生物菌种保藏委员会( (CCCCM)CCCCM)美国的典型菌种保藏中心美国的典型菌种保藏中心( (ATCC)ATCC)英国国家典型菌种保藏所（英国国家