第二章基因工程酶学

1、1/98第二章第二章 基因工程的酶学基础基因工程的酶学基础2/98一、限制性核酸内切酶一、限制性核酸内切酶第一节第一节 限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶是一类能够识别是一类能够识别双链双链DNA分子中的某种分子中的某种特定核苷酸序列特定核苷酸序列，并于此处或其附近，并于此处或其附近切切割割DNA双链双链的核酸的核酸内切酶内切酶。（Restriction endonuclease）3/982. 性质性质内切酶。内切酶。原核生物。原核生物。能从能从DNA分子中间水解磷酸二酯键，从分子中间水解磷酸二酯键，从而切断双链而切断双链DNA的核酸水解酶。的核酸水解酶。自我保护作用。自我保护作用。3. 功能功

2、能细菌的限制和修饰系统（细菌的限制和修饰系统（Restriction modification system ，R/M体系）体系）1. 来源来源4/98限制性内切酶将侵入细菌体内的限制性内切酶将侵入细菌体内的外源外源DNA切切成小片断。成小片断。（1）限制（）限制（Restriction）5/98细菌自身的细菌自身的DNA碱基被碱基被甲基化酶甲基化酶甲基化修饰所甲基化修饰所保护，不能被自身的限制性内切酶识别切割。保护，不能被自身的限制性内切酶识别切割。（2）修饰（）修饰（Modification） Dam甲基化酶甲基化酶GATC 腺嘌呤腺嘌呤N6位置引入甲基位置引入甲基 Dcm甲基化酶甲基化酶

3、CCAGG或或CCTGG序列在第二个序列在第二个C上上C5位置上引入甲基位置上引入甲基6/98I 型限制性内切酶型限制性内切酶 目前鉴定出目前鉴定出三种不同类型三种不同类型的限制性内切酶。的限制性内切酶。二、限制性内切酶的类型二、限制性内切酶的类型II 型限制性内切酶型限制性内切酶 III型限制性内切酶型限制性内切酶 7/98首先由首先由M. Meselson和和W. Arber在在1968年年从大肠杆菌从大肠杆菌 K株株和和 B株株分离的。分离的。（1）识别位点序列）识别位点序列EcoB： TGA(N)8TGCT EcoK：AAC(N)6GTGC1. I型限制性内切酶型限制性内切酶 如如 E

4、coK和和 EcoB。未甲基化修饰的特异序列。未甲基化修饰的特异序列。8/98作用时需作用时需ATP、Mg2+和和SAM（S-腺苷蛋氨酸）腺苷蛋氨酸）在距离特异性识别位点约在距离特异性识别位点约10001500 bp处处随机随机切开一条切开一条单链单链。Recognize sitecut1-1.5kb（2）切割位点）切割位点序列？序列？约约75nt 75nt 切口切口9/98首先由首先由H.O. Smith和和K.W. Wilcox在在1970年从流感嗜血菌中分离出来。年从流感嗜血菌中分离出来。 （1）识别位点序列）识别位点序列未甲基化修饰未甲基化修饰的的双链双链DNA上的特殊靶序上的特殊靶序

5、列（多数是回文序列）。列（多数是回文序列）。 与与DNA的来源无关。的来源无关。2. II类限制性内切酶类限制性内切酶 分离的第一个酶是分离的第一个酶是Hind 10/98EcoR I 5-GAATTC-3 3-CTTAAG-5 Pst I 5-CTGCAG-3 3-GACGTC-5 产生粘性末端产生粘性末端EcoR V 5-GATATC-3 3-CTATAG-5 产生平齐末端产生平齐末端（2）切割位点）切割位点切开切开双链双链DNA，形成，形成粘性末端粘性末端（sticky end）或）或平齐末端平齐末端（blunt end）。如：）。如：识别位点处。识别位点处。11/98（3）粘性末端（）

6、粘性末端（sticky ends，cohensive ends）含有几个核苷酸含有几个核苷酸单链单链的末端。的末端。分两种类型：分两种类型： 5端凸出（如端凸出（如EcoR I切点）切点）GAATTC CTTAA G G AATTC CTTAAG5-3 3-5 5-3 3-5 12/98CTGCAG 3端凸出（如端凸出（如Pst I切点）切点）GACGTC 5-3 3-5 5-3 3-5 CTGCA G G ACGTC 13/98 连接便利连接便利 （4）粘性末端的意义）粘性末端的意义i）不同的）不同的DNA双链：双链：只要粘性末端碱基互补就可以连接。只要粘性末端碱基互补就可以连接。ii）同一

7、个）同一个DNA分子内连接：分子内连接：通过两个相同的粘性末端可以连接通过两个相同的粘性末端可以连接成成环形分子环形分子。这比连接两个平齐末端容易的多。这比连接两个平齐末端容易的多。14/9815/98补平成平齐末端补平成平齐末端凸出的凸出的3端端更易于通过更易于通过末端核苷酸转移末端核苷酸转移酶酶添加几个多聚核苷酸的尾巴（如添加几个多聚核苷酸的尾巴（如AAA或或TTT等）造成人工粘性末端。等）造成人工粘性末端。 末端标记末端标记凸出的凸出的5末端末端更易于用更易于用DNA多核苷酸激多核苷酸激酶酶进行进行32P标记。标记。凸出的凸出的5粘性末端可以用粘性末端可以用DNA聚合酶补聚合酶补平成平齐

8、末端。平成平齐末端。同聚物加尾同聚物加尾16/98指来源于不同物种但能识别相同指来源于不同物种但能识别相同DNA序序列的限制性内切酶。列的限制性内切酶。 （5）同裂酶（）同裂酶（Isoschizomers) 完全同裂酶：完全同裂酶： 识别位点和切点完全相同。识别位点和切点完全相同。 如如Hind 和和Hsu I。17/98Xma I 5-CCCGGG -3 3-GGGCCC-5 Sma I 5-CCCGGG-3 3-GGGCCC-5 识别位点相同，但切点不同。识别位点相同，但切点不同。 如如Xma I 和和 Sma I。 不完全同裂酶：不完全同裂酶：18/98即能切割产生相同即能切割产生相同末

9、端末端（一般指粘性末端一般指粘性末端）的）的限制性内切酶。如限制性内切酶。如：（6）同尾酶）同尾酶(Isocaudamers） 19/98 Sau 3A同尾酶的粘性末端互相结合后形成的新位点同尾酶的粘性末端互相结合后形成的新位点一般不能一般不能再再被原来的酶识别。被原来的酶识别。Sau 3A20/98限制性内切酶的识别和酶切活性一般在一限制性内切酶的识别和酶切活性一般在一定的定的温度温度、离子强度离子强度、pH等条件下才表现等条件下才表现最佳切割能力和位点的专一性。最佳切割能力和位点的专一性。 （7）限制酶的酶活性）限制酶的酶活性如果改变反应条件就会影响酶的专一性如果改变反应条件就会影响酶的专

10、一性和切割效率，称为星号（和切割效率，称为星号（*）活性。）活性。所以一般使用专一的反应缓冲液。所以一般使用专一的反应缓冲液。 星号（星号（*）活性）活性21/98EcoR I和和BamH I等都有等都有*活性。活性。在低盐、高在低盐、高pH（8）时可识别和切割）时可识别和切割GAATTA、AAATTC、GAGTTC等等GAATTCEcoR I：使用的时候要特别注意！使用的时候要特别注意！22/98在离它的在离它的不对称识别位点不对称识别位点一侧的一侧的特定特定距离距离处（处（20 l）一般采取一般采取28/98大肠杆菌一般有大肠杆菌一般有两种甲基化酶两种甲基化酶修饰质粒：修饰质粒：2. DN

11、A的甲基化程度的甲基化程度 dam甲基化酶（修饰甲基化酶（修饰GATC中的中的A）；）； dcm甲基化酶（修饰甲基化酶（修饰CCA/TGG的的C）。）。基因工程中必须使用甲基基因工程中必须使用甲基化酶失活突变的菌株。化酶失活突变的菌株。29/98不同的限制性内切酶的最适反应温度不同。不同的限制性内切酶的最适反应温度不同。大多数是大多数是37 ，少数要求，少数要求40-65 。酶酶最适最适温度温度酶酶最适最适温度温度酶酶最适最适温度温度Apa I Bcl I Mae II Taq I30 50 50 65Apy I BstE II Mae III30 60 55Ban I Mae I Sma I

12、50 45 253. 温度温度 30/98是影响限制酶活性的重要因素。是影响限制酶活性的重要因素。4. 缓冲液缓冲液(Buffer) 缓冲液的化学组成：缓冲液的化学组成：MgCl2、NaCl/KCl： 提供提供Mg2+ +和离子强度；和离子强度； Tris-HCl： 维持维持pH； 二硫苏糖醇（二硫苏糖醇（DTT）：保持酶稳定性；）：保持酶稳定性； 牛血清蛋白牛血清蛋白BSA等：有助于酶的稳定；等：有助于酶的稳定；商品化的限制酶一般都带有专用缓冲液。商品化的限制酶一般都带有专用缓冲液。31/98五、限制性内切酶对五、限制性内切酶对DNA的消化的消化1. 内切酶与识别序列的结合模式内切酶与识别序

13、列的结合模式 1986年年J.A. McClarin等通过等通过X射线晶体射线晶体衍射发现衍射发现II类限制酶是以类限制酶是以同型二聚体同型二聚体的的形式与靶序列结合。形式与靶序列结合。GAATTCCTTAAG32/98内切酶在内切酶在DNA上的上的所有所有识别位点都被切开。识别位点都被切开。2. 完全消化完全消化 12 34123433/98只有有限数量的酶切位点被切开。只有有限数量的酶切位点被切开。 通过通过缩短保温时间缩短保温时间、降低反应温度降低反应温度或或减减少酶的用量少酶的用量可达到局部消化的目的。可达到局部消化的目的。3. 局部消化局部消化 12 341434/98大多数酶可用大

14、多数酶可用65 oC温育温育5分钟失活。分钟失活。 或用或用酚酚和和氯仿抽提氯仿抽提使酶失活，使酶失活，再再用用乙醇乙醇沉淀沉淀DNA。4. 限制酶酶切反应的终止限制酶酶切反应的终止 5. 几种常用限制酶识别位点几种常用限制酶识别位点35/9836/986. 限制性内切酶识别序列的交叉列表限制性内切酶识别序列的交叉列表 AATT ACGT AGCT ATAT CATG CCGG * * *MaeII Hpac MspIc * * Alu I * A *T Nla A* *T ApoI Hind Afl III AgeI BsrFI A* *T A* *T SspI A* T 37/98从细菌从

15、细菌DNA环化现象推测，必定存在一环化现象推测，必定存在一种能把两条种能把两条DNA双链连接到一起的酶。双链连接到一起的酶。第二节第二节 DNA 连接酶连接酶一、一、DNA连接酶（连接酶（ligase)的发现的发现DNA复制一定有断口。复制一定有断口。1967年年5个实验室几乎同时发现了个实验室几乎同时发现了DNA连接酶。连接酶。38/98（1）大肠杆菌连接酶）大肠杆菌连接酶1. 两种两种DNA连接酶连接酶只能连接只能连接粘性末端粘性末端。二、二、DNA ligase的特点的特点（2）T4噬菌体的连接酶噬菌体的连接酶不但能连接粘性末端，不但能连接粘性末端， 还能连接还能连接平齐末端平齐末端。3

16、9/98（1）必须是两条）必须是两条双链双链DNA切口切口。（2）DNA 3端有游离的端有游离的-OH， 5端有一个磷酸基团（端有一个磷酸基团（-P）。）。（3）需要）需要能量能量动物或噬菌体中：动物或噬菌体中：ATP 大肠杆菌中：大肠杆菌中： NAD+ +2. 连接条件连接条件40/981. ATP（NAD+ +)提供激活的提供激活的AMP，与连接酶的与连接酶的赖氨酸赖氨酸 -氨基氨基相相连，形成共价连，形成共价“连接酶连接酶-AMP”复合物，并释放出焦磷酸复合物，并释放出焦磷酸PPi；三、连接反应的机理三、连接反应的机理2. AMP随后从连接酶随后从连接酶 的赖氨酸的赖氨酸 -氨基转移氨基

17、转移 到到DNA一条链的一条链的5端端 P上，形成上，形成“DNA-腺腺 苷酸苷酸”复合物。复合物。3. 3-OH对磷原子作亲对磷原子作亲 核攻击，形成磷酸二核攻击，形成磷酸二 酯键，释放出酯键，释放出AMP。41/98连接酶反应的最佳温度是连接酶反应的最佳温度是37 C。四、连接反应的温度四、连接反应的温度1. 最佳温度最佳温度但在但在37下下粘性末端粘性末端的结合很不稳定的结合很不稳定,2. 实用温度实用温度所以一般采用所以一般采用 416 C。42/98增加插入片段与载体的接触机会，增加插入片段与载体的接触机会，减少载体自我连接的现象。减少载体自我连接的现象。1. 插入片段与载体的浓度比

18、例插入片段与载体的浓度比例 2. 反应温度反应温度五、影响连接反应的因素五、影响连接反应的因素1020倍。倍。一般一般41643/98第三节第三节 DNA聚合酶聚合酶一、基因工程中常用的一、基因工程中常用的DNA聚合酶聚合酶1. 大肠杆菌大肠杆菌DNA聚合酶聚合酶 2. Klenow fragment 3. T DNA聚合酶聚合酶 4. T DNA聚合酶聚合酶 5. 修饰过的修饰过的T DNA聚合酶聚合酶 6. 逆转录酶逆转录酶DNADNA聚合酶：以一条聚合酶：以一条DNADNA为为模板模板通过通过聚合作用聚合作用把把dNTPsdNTPs加加 到双链到双链DNADNA分子的分子的3-OH3-O

19、H端而合成新的端而合成新的DNADNA。44/981. 共同特点共同特点把把dNTPs连续地加到引物的连续地加到引物的3OH端。端。2. 主要区别主要区别T DNA聚合酶可以连续添加数千个聚合酶可以连续添加数千个dNTPs而不从模板上掉下来。而不从模板上掉下来。其它几种其它几种DNA聚合酶只能连续添加聚合酶只能连续添加10多多个个dNTPs就会从模板上解离下来。就会从模板上解离下来。二、常用的二、常用的DNA聚合酶的特点聚合酶的特点持续合成能力和外切酶活性不同。持续合成能力和外切酶活性不同。45/98DNA聚合酶聚合酶35外外切酶活性切酶活性53外外切酶活性切酶活性聚合聚合速率速率持续持续能力

20、能力大肠杆菌大肠杆菌DNA聚合酶聚合酶低低有有中中低低Klenow fragment低低无无中中低低T4DNA聚合酶聚合酶高高无无中中低低T7DNA聚合酶聚合酶高高无无快快高高化学修饰的化学修饰的T7DNA聚合酶聚合酶低低无无快快高高遗传修饰的遗传修饰的T7DNA聚合酶聚合酶无无无无快快高高逆转录酶逆转录酶无无无无低低中中Taq DNA聚合酶聚合酶无无有有快快高高常用常用DNA聚合酶的特性比较聚合酶的特性比较:46/98三、三、DNA聚合酶在基因工程中的用途聚合酶在基因工程中的用途1. 大肠杆菌大肠杆菌DNA聚合酶聚合酶 I主要用来制备带放射性标记的主要用来制备带放射性标记的DNA探针。探针。

21、（1）大肠杆菌）大肠杆菌DNA聚合酶聚合酶I 的性质的性质一条一条单链多肽单链多肽。 用枯草杆菌蛋白酶处理可以切掉用枯草杆菌蛋白酶处理可以切掉N 端的端的部分。就成部分。就成 为为Klenow fragment。47/98 底物：底物：dNTPs（dATP、dGTP、dCTP、dTTP） Mg2+ + 带有带有3OH游离端的引物游离端的引物 DNA模板模板（2）DNA聚合酶聚合酶I（Pol I）的反应条件）的反应条件-OH5 3 dNTPs48/98标记标记 核酸探针（核酸探针（probe）能够同某种被研究的核酸序列特异性能够同某种被研究的核酸序列特异性结合的，带有结合的，带有标记标记的寡聚核

22、酸分子。的寡聚核酸分子。（3）用）用DNA聚合酶聚合酶I 制备探针制备探针已知序列的核酸片断已知序列的核酸片断显示位置显示位置与互补的待测序列杂交与互补的待测序列杂交49/98标记标记已知序列的核酸片断已知序列的核酸片断 探针的标记方式探针的标记方式标记标记已知序列的核酸片断已知序列的核酸片断带有标记的已知序列的核酸片断带有标记的已知序列的核酸片断5 3 50/98 DNA聚合酶聚合酶I 对探针序列的标记对探针序列的标记缺口平移法缺口平移法(nick translation )进行探针标记进行探针标记DNA聚合酶聚合酶I 同时具备同时具备53外切酶外切酶活活性和性和53的聚合酶的聚合酶 活性（

23、以及活性（以及35外切酶活性外切酶活性）。）。51/98缺口缺口1缺口缺口25 5 3 3 5 3 5 3 缺口平移法：缺口平移法：53外切酶活性从外切酶活性从DNA缺口的缺口的下一段下一段 DNA 5端除去一个核苷酸后，聚合酶活性就会在端除去一个核苷酸后，聚合酶活性就会在 缺口的缺口的上一段上一段DNA 3端补上一个新的核苷酸。端补上一个新的核苷酸。52/98纯化的纯化的DNA片断片断DNase I 制造制造单链缺口单链缺口DNA Pol I 进行进行缺口转移缺口转移一种一种 -32P-dNTP和和dNTPs 5 5 5 5 5 5 5 5 3 3 3 3 3 3 3 3 32P-dNTP3

24、2P-dNTP从头至尾都被标记从头至尾都被标记用用DNA Pol I-缺口平移法进行探针标记的步骤缺口平移法进行探针标记的步骤53/982. Klenow fragment具有具有53聚合酶活性和聚合酶活性和35外切酶活外切酶活性。（性。（失去了失去了53外切酶活性外切酶活性）。）。（1）Klenow fragment的性质的性质DNA Pol I Klenow fragment (76KD） 枯草杆菌枯草杆菌蛋白酶蛋白酶54/98 3端补平端补平5 5 klenow DNA 3末端标记末端标记补平限制性内切酶切后形成的补平限制性内切酶切后形成的3隐蔽端隐蔽端。在在3隐蔽端隐蔽端加上放射性标记

25、的加上放射性标记的dNTP。klenow（2）主要用途）主要用途55/983隐蔽末端的隐蔽末端的DNA片断片断Klenow fragment补平补平根据末端的顺序选择根据末端的顺序选择一种一种 -32P-dNTPs末端标记的末端标记的DNA 限制性内切酶切限制性内切酶切5-G3 3-CTTAA5 5-GAA3 3-CTTAA5 5-GAATT3 3-CTTAA5 5-G3 3-CCTAG5 5-GG3 3-CCTAG5 5-GGATC3 3-CCTAG5 EcoR IBamH I -32P-dATP -32P-dGTP25oC 1h用用Klenow酶进行探针标记的步骤酶进行探针标记的步骤56/

26、98 cDNA第二链的合成第二链的合成mRNAcDNA第一链第一链逆转录逆转录cDNA第二链第二链klenow5 3 3 5 5 3 引物引物57/98（1） T4 DNA聚合酶的性质聚合酶的性质3. T4 DNA聚合酶聚合酶从从T 噬菌体感染后的大肠杆菌培养物噬菌体感染后的大肠杆菌培养物中分离纯化。由中分离纯化。由噬菌体基因噬菌体基因43编码。编码。有有53聚合酶活性聚合酶活性和和35外切酶活性外切酶活性（降解单链更快）。（降解单链更快）。 来源来源 酶活性酶活性58/985 5 3 3 5 5 3 3 T4 DNA聚合酶聚合酶无无dNTPsT4 DNA聚合酶聚合酶有有dNTPs5 5 特点

27、特点当当没有没有dNTP时，时，T4DNA聚聚合酶行使合酶行使35外切酶功能，外切酶功能，制造出制造出3隐蔽隐蔽端。端。如果如果只有一种只有一种dNTP，则降，则降解到该解到该dNTP的位置。的位置。59/98（2） T4 DNA聚合酶的用途聚合酶的用途末端标记末端标记取代合成法：取代合成法：用用35外切酶活性作用于外切酶活性作用于所有末端形式所有末端形式的的3端端（平端、（平端、3隐蔽端、隐蔽端、5隐蔽端）制隐蔽端）制造出造出3隐蔽端隐蔽端; 再利用它的再利用它的53聚合酶活性补平，并加聚合酶活性补平，并加入放射性标记的入放射性标记的dNTP。 补平隐蔽末端补平隐蔽末端 DNA 3末端标记末

28、端标记60/98酶切中间产酶切中间产生两个末端生两个末端标记的探针标记的探针加入某种加入某种32P-dNTP和和dNTPsT4 DNA聚合酶聚合酶 （35外切）外切）DNA酶切片断酶切片断T4 DNA聚合酶聚合酶 （53聚合）聚合）5 5 3 3 5 5 3 3 5 5 3 3 5 5 3 3 5 5 3 3 内切酶切内切酶切无无dNTPs用用T4 DNA聚合酶聚合酶-取代合成法进行探针标记的步骤取代合成法进行探针标记的步骤32P-dNTP61/984. T7 DNA聚合酶聚合酶（1）来源）来源从从T7 7噬菌体感染大肠杆菌细胞中纯化噬菌体感染大肠杆菌细胞中纯化出来的，由出来的，由两个亚基两个

29、亚基组成：组成： T T7 7基因基因5 5编码的大亚基：编码的大亚基：有有53聚合酶和聚合酶和35外切酶活性外切酶活性。 大肠杆菌编码的小亚基：大肠杆菌编码的小亚基：硫氧还蛋白。硫氧还蛋白。 增加大亚基对模板的亲和性增加大亚基对模板的亲和性。62/98（2）T7 DNA聚合酶的特点聚合酶的特点 持续合成能力强持续合成能力强一旦与模板结合就会不间断地合成一旦与模板结合就会不间断地合成互补链。互补链。 35外切酶活性高外切酶活性高单链和双链都能降解。单链和双链都能降解。 不受不受DNADNA二级结构的影响二级结构的影响其它其它DNA聚合酶受聚合酶受DNA二级结构的阻碍。二级结构的阻碍。63/98

30、 进行末端标记进行末端标记 以大分子量以大分子量DNA为模板的合成为模板的合成如如M13： 6407 bp 补平隐蔽末端补平隐蔽末端（3）T7 DNA聚合酶的用途聚合酶的用途取代合成法标记取代合成法标记3末端末端与与T4 DNA聚合酶相同。聚合酶相同。合成合成补平补平3隐蔽末端；隐蔽末端； 水解水解修平修平3突出末端。突出末端。64/985. 修饰后的修饰后的T7 DNA聚合酶聚合酶（1）T7DNA聚合酶的化学修饰聚合酶的化学修饰去除去除35外切酶活性，使外切酶活性，使DNA聚聚合能力和聚合速率提高了合能力和聚合速率提高了3倍。倍。（2）修饰后的）修饰后的T7 DNA聚合酶的用途聚合酶的用途

31、DNA测序测序双脱氧法。双脱氧法。 标记标记DNA 3隐蔽末端隐蔽末端 更有效地补平末端更有效地补平末端65/986. 逆转录酶逆转录酶最普遍使用的是来源于最普遍使用的是来源于鸟类骨髓母鸟类骨髓母细胞瘤病毒细胞瘤病毒（avian myeloblastosis virus, AMV）：）：依赖依赖RNA的的DNA聚合酶（聚合酶（RNA指导的指导的DNA聚合酶）。聚合酶）。（1）来源）来源RNA肿瘤病毒。肿瘤病毒。（2）AMV逆转录酶的性质逆转录酶的性质由由 和和 两条多肽链组成。两条多肽链组成。66/98 链链有反转录活性和有反转录活性和 RNaseH活性。活性。RNaseH： 链经过蛋白酶水解

32、后产生的一条多肽。链经过蛋白酶水解后产生的一条多肽。 以以53或或35方向特异地方向特异地水解水解RNA-DNA杂交双链中的杂交双链中的RNA链链。RNaseHRNA DNARNA DNA67/98（3）逆转录酶的用途）逆转录酶的用途 链链RNA-DNA杂交双链中杂交双链中53DNA外外切酶活性。切酶活性。 合成合成cDNA以以oligo dT为引物（与为引物（与mRNA的的polyA尾巴互补结合）。尾巴互补结合）。AAAAATTTTT5 3 mRNA 5 cDNA68/98 合成合成cDNA探针探针用用随机引物随机引物（random primer）或）或oligo dT做引物。做引物。随机引

33、物：随机顺序形成的寡聚随机引物：随机顺序形成的寡聚DNA 片断（片断（810nt）。）。 （理论上能与各种序列的模板结合）（理论上能与各种序列的模板结合） RT-PCR用的模板用的模板克隆某个基因时，用其克隆某个基因时，用其mRNA反转录反转录出出cDNA第一链。第一链。69/98第四节第四节 DNA修饰酶修饰酶一、末端脱氧核苷酸转移酶一、末端脱氧核苷酸转移酶1. 来源来源小牛胸腺。小牛胸腺。2. 组成组成大小两个亚基。大小两个亚基。3. 特性特性53DNA聚合酶活性聚合酶活性（terminal deoxynucleotidyl transferase，TdT） 不需要模板不需要模板！ 需要需

34、要3OH、二甲胂酸缓冲液。、二甲胂酸缓冲液。70/98 底物可以是底物可以是单链单链DNA、 3OH突出突出的双链的双链DNA、 平末端平末端在在Co2+ +代替代替Mg2+ +下也可以。下也可以。 随机添加随机添加dNTPs。 如果只有一种如果只有一种dNTP，就添加上，就添加上同聚物同聚物。DNA 5 3 TTTdTTP ，末端转移酶，末端转移酶71/984. 末端脱氧核苷酸转移酶的用途末端脱氧核苷酸转移酶的用途（1）同聚物加尾）同聚物加尾给给外源外源DNA片断片断和和载体载体分子分别加上互补分子分别加上互补的同聚物尾巴，以使它们有效地连接。的同聚物尾巴，以使它们有效地连接。外源外源DNA

35、DNA载体载体DNADNA5 3 5 3 CCCCCCGGGGGGdGTPdCTP末端转移酶末端转移酶72/98（2）再生酶切位点）再生酶切位点便于回收克隆片断。便于回收克隆片断。AAGCTT TTCGAA5 5 Hind酶切酶切A TTCGAAGCTT AKlenow补平补平73/98AAGCT TTCGAAGCTT TCGAAAAGCTTTT TTCGA AGCTT TTTTCGAA末端转移酶末端转移酶dTTPAAAAAA外源外源DNA74/98（3）非放射性标记）非放射性标记DNA片断的片断的3端端AAGCTTTT TTCGA AGCTT TTTTCGAAAAAAAAHind位点位点Hi

36、nd位点位点连接连接催化非放射性标记物参入催化非放射性标记物参入DNA片断的片断的3端。（生物素端。（生物素-1,1-dUTP等）等）75/98 二、碱性磷酸酶二、碱性磷酸酶1. 碱性磷酸酶种类碱性磷酸酶种类从大肠杆菌中分离出来。从大肠杆菌中分离出来。Bacterial alkaline phosphatase，BAP（1）细菌碱性磷酸酶）细菌碱性磷酸酶（2）小牛肠碱性磷酸酶）小牛肠碱性磷酸酶Calf intestinal alkaline phosphatase，CIP从小牛肠中纯化出来。从小牛肠中纯化出来。具有抗热性（具有抗热性（65）。）。SDS中加热中加热65oC可完全失活。可完全失活

37、。76/982. 碱性磷酸酶的特性碱性磷酸酶的特性催化脱掉催化脱掉DNA（或（或RNA）5端的磷酸端的磷酸根。根。3 P-OH5 3 HO-P5 5 3 HO-OH5 3 HO-OH碱性磷酸酶碱性磷酸酶3. 碱性磷酸酶的用途碱性磷酸酶的用途防止线性化的载体分子自我连接。防止线性化的载体分子自我连接。77/98单一酶切口的载体的粘性末端容易自我连接。单一酶切口的载体的粘性末端容易自我连接。AAGCTT TTCGAAHind酶切酶切A-OH TTCGA-PP-AGCTT HO-A碱性磷酸酶碱性磷酸酶5 5 5 78/98A-OH TTCGA-OHHO-AGCTT HO-AOH与与OH不能形成磷酸二

38、酯键，所以不不能形成磷酸二酯键，所以不能自我连接。能自我连接。但同一酶切后的但同一酶切后的外源外源DNA的的5端有端有P，能与脱磷酸的载体能与脱磷酸的载体OH连接。连接。碱性磷酸酶碱性磷酸酶79/98A TTCGA AGCTT AAGCTTA ATTCGA 连接酶连接酶-OH与与-OH连不住连不住其中每条链上都有一个其中每条链上都有一个nick，但转入细，但转入细菌后会被修复。菌后会被修复。3 P-AGCTTA-OH5 3 HO-ATTCGA-P5 外源外源DNA80/98三、三、T4多核苷酸激酶多核苷酸激酶1. 来源来源T4噬菌体的噬菌体的pseT基因编码。基因编码。 从从T4感染大肠杆菌细

39、胞中分离出来。感染大肠杆菌细胞中分离出来。多种哺乳动物细胞中也发现这种酶。多种哺乳动物细胞中也发现这种酶。2. 功能功能催化催化ATP的的 磷酸转给双链或单链磷酸转给双链或单链DNA或或RNA的的5-OH端。端。不论不论5-OH端突出与否。端突出与否。81/985 3 HO-OH5 3 HO-OH3 P-OH5 3 HO-P5 ATPT4多核苷酸激酶多核苷酸激酶如果如果ATP的的 磷酸带有磷酸带有32P标记标记，就会被转，就会被转移到移到DNA的的5端端。但天然的但天然的DNA的的5端都是磷酸化的。端都是磷酸化的。82/983. 多核苷酸激酶的用途多核苷酸激酶的用途DNA 5-OH端磷酸化、标

40、记端磷酸化、标记DNA的的5端。端。5 3 HO-OH5 3 HO-OH3 32P-OH5 3 HO-32P5 ( -32P)ATP多核苷酸激酶多核苷酸激酶3 P-OH5 3 HO-P5 碱性磷酸酶碱性磷酸酶（1）正向反应（）正向反应（forward reaction）83/98（2）交换反应标记法）交换反应标记法反应混合物中具有超量反应混合物中具有超量( -32P)ATP和和ADP时，多核苷酸激酶能催化时，多核苷酸激酶能催化( -32P)ATP的的 -32P与与DNA5端的磷酸端的磷酸交换交换。3 P-OH5 3 HO-P5 3 32P-OH5 3 HO-32P5 ( -32P)ATP、AD

41、P多核苷酸激酶多核苷酸激酶反应效果不理想。反应效果不理想。84/98第五节第五节 核酸外切酶核酸外切酶Exonucleases：是一类从多核苷酸链的一头开：是一类从多核苷酸链的一头开始催化始催化降解降解核苷酸的酶。核苷酸的酶。一、单链一、单链DNA外切酶外切酶1. 核酸外切酶核酸外切酶I（exo I）来源于大肠杆菌；来源于大肠杆菌； 35外切外切 识别识别3-OH2. 核酸外切酶核酸外切酶（exo ）来源于大肠杆菌；来源于大肠杆菌；53、35外切。外切。识别识别3-OH、5-P85/98二、双链二、双链DNA外切酶外切酶1. 核酸外切酶核酸外切酶（exoexo ）由大肠杆菌由大肠杆菌xthA基

42、因编码；基因编码； 35外切。外切。识别识别3-OH主要用途：主要用途：在在DNA双链的末端产生出单链区域。双链的末端产生出单链区域。5 5 5 5 exo 与与klenow配合进行配合进行3端标记端标记-OHHO-86/982. 核酸外切酶（核酸外切酶（ exo）从感染从感染噬菌体的大肠杆菌细胞中纯化噬菌体的大肠杆菌细胞中纯化 ；53外切。外切。主要用途：主要用途：使使DNA双链变成单链（短）。双链变成单链（短）。5 P-P 5 5 5 exo 成为测序模板。成为测序模板。识别识别5-P（但不能降解（但不能降解5-OH）87/983. T7核酸外切酶核酸外切酶 该酶是该酶是T 噬菌体基因噬菌

43、体基因6的产物；的产物； 53外切。外切。用途与用途与 exo一样。一样。既能识别既能识别5-P，又能识别，又能识别5-OH。5 5 5 5 已被克隆到大肠杆菌中表达。已被克隆到大肠杆菌中表达。88/98第六节第六节 单链单链DNA内切酶内切酶一、一、S1核酸酶核酸酶1. 来源来源稻谷曲霉（稻谷曲霉（Aspergillus oryzae）。）。2. 特性特性（1）高度单链特异性）高度单链特异性（2）反应条件）反应条件 低水平低水平Zn2+ + pH4.04.389/983. S1核酸内切酶的功能核酸内切酶的功能（1）催化单链）催化单链RNA或或DNA降解。降解。 （2）切掉双链核酸中的单链区。）切掉双链核酸中的单链区。S1S1发卡发卡或有或有缺口缺口的部位。的部位。90/98（4）不能降解双链）不能降解双链DNA或或RNA-DNA杂交链杂交链ATGCAT GCATGCTACGTA CGTACGT甚至能识别单个核苷酸的单链区！甚至能识别单个核苷酸的单链区！（3）降解限制酶切形成的单链突出端。）降解限制酶切形成的单