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1、实时荧光定量实时荧光定量PCR技术的原理及应用注技术的原理及应用注意事项适合菜鸟入门意事项适合菜鸟入门第1页/共51页实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR基本原理基本原理第2页/共51页常规常规vs vs实时实时第3页/共51页第4页/共51页第5页/共51页第6页/共51页第7页/共51页荧光强度荧光强度-循环数曲线循环数曲线初始模板量对数初始模板量对数-C(T)循环数标准曲线循环数标准曲线10410310610510210第8页/共51页第9页/共51页第10页/共51页GTTTGGCCCCCCCAAAGGGACTTGATAGCATCGTAA第11页/共51页第12页/共51页第13页/共

2、51页第14页/共51页第15页/共51页第16页/共51页第17页/共51页第18页/共51页实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR的实验设计的实验设计第19页/共51页第20页/共51页第21页/共51页第22页/共51页实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR两种相对两种相对定定量量方法比较方法比较相对标准曲线相对标准曲线法和法和2-c(t) 法法第23页/共51页第24页/共51页第25页/共51页第26页/共51页第27页/共51页第28页/共51页实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR误差分析误差分析及及操作规范操作规范第29页/共51页第30页/共51页第31页/共51页第32页/共51

3、页第33页/共51页第34页/共51页第35页/共51页第36页/共51页同一cDNA样品的三个重复第37页/共51页模板浓度越低，染料法的误差越大。如图一系列梯度稀释的模板，理论上它们在扩增曲线上的CT值之差，应该相等，但是后边几个浓度低的样品CT值明显提前了，由熔解曲线可知对于浓度低的样品，引物二聚体引起的误差非常严重。第38页/共51页实验中污染的防控第39页/共51页第40页/共51页第41页/共51页第42页/共51页第43页/共51页第44页/共51页第45页/共51页第46页/共51页图中最后一个样品为阴性对照，本来应该是一直线，但是仪器也检测到了荧光信号第47页/共51页电泳结果显示，该阴性对照确实有PCR产物出现第48页/共51页通过定量PCR检测，测得该阴性样品中含有227个初始模板。假如这个污染属于是顽固的未知污染，可以用正常样品测得的初始模板量减去227，来避免污染引起的误差第49页/共51页荧

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