Ch6 生物酶工程

1、Ch6 生物酶工程生物酶工程（Biological Enzyme Engineering）： 是指在基因水平上，对酶蛋白分子进行修饰、改造，改进酶蛋白的催化特性或酶蛋白的蛋白质特性等。本章主要介绍 核酶、进化酶、杂合酶和抗体酶的有关基本概念和基本知识。1Ch6-1 核酶(Ribozyme)到目前为止，除了我们传统概念的酶蛋白质外，还发现另一类具有催化活性的物质核酸。这里的核酶要和核酸酶（Nuclease）的概念区别开来，前者是酶的化学本质是核酸；后者是指催化核酸水解的酶，其化学本质是蛋白质；1981年Cech等发现四膜虫的核糖体前体RNA可以在没有酶蛋白存在的情况下，自身催化切除内涵子，完成加

2、工过程；发现了具有催化活性的RNA，从而提出了核酶这个概念。由于核酶具有很多与酶蛋白截然不同的特点，尤其在医学界的优势更为突出，用于基因治疗可以克服一直困扰人们的免疫问题。所以近些年来引起了酶工程研究领域的极大热情。 到目前为止，已经发现的天然核酶的作用底物都是核酸，按其催化反应可分两类：剪切型核酶：这类核酶主要催化自身或异体RNA的切割，相当于核酸内切酶的作用。目前发现的剪切型核酶包括三种： 锤头型核酶 R. Symons研究一些植物病毒RNA的自身剪切功能后，提出了锤头状二级结构模型； 发卡型核酶 发卡型核酶的二级结构象一个发卡装，由50个碱基组成，它和底物的14个碱基共同构成一个发卡结构

3、，识别顺序是NGUC，在N-G之间切割。 蛋白质RNA 复合酶 由蛋白质和M1RNA两个部分构成，其中蛋白质的分子量2000Da，RNA部分函377个碱基。催化活性完全有RNA部分完成，蛋白质部分只是维护RNA的构象，主要功能是剪切修饰tRNA。剪接型核酶：这类核酶主要催化mRNA前体的修饰加工，切除内含子，并完成片段的拼接； 主要包括组内含子和组内含子。Cech 研究发现四膜虫的核糖体RNA前体，具有自身切除413 碱基的intron，并进行片段的拼接功能，进一步研究发现，其Intron 本身具有催化RNA前体剪辑功能。脱氧核酶： 前述核酶的化学本质是RNA，在发现RNA核酶后，很快就发现了

4、切割RNA和DNA的DNA核酶。1994年，Breaker 利用体外选择技术，首次发现了切割RNA的DNA分子，命名为脱氧核酶（DNAzyme）关于核酶的应用前景关于核酶的研究，主要目标是将其应用于基因治疗，总体上讲，目前处于研究阶段。开发公司治疗对象研究阶段American CyanamidColumbia UniversityGene ShearsInnovirOsaka UniversityRibozyme Ph. Inc.Tokyo UniversityB细胞白血病-淋巴瘤人免疫缺陷病毒人免疫缺陷病毒乙肝病毒，丙肝病毒乙肝病毒，丙肝病毒丙肝病毒人免疫缺陷病毒血管生长因子丙肝病毒临床前期

5、临床前期一、二期临床临床前期临床前期临床前期一、二期临床临床前期临床前期关于核酶用于基因治疗研究存在的主要问题 体内运输与细胞吸收及残留问题： 切割位点的特异性选择问题： 自身稳定性问题： 毒性和免疫原性问题：2Ch6-2 酶分子的定向进化（Directed Evilution）酶分子的定向进化是指在分子水平上，人为地创造特殊的进化条件，模拟自然进化机制（随机突变、基因重组和自然选择），对酶基因进行改造，并进行定向选择，筛选出所需性质的酶蛋白。对酶蛋白分子的改造，主要包括两个方面，即酶分子改造的合理化设计（Rational Design）和非合理设计（Irrational Design）合理化

6、设计：主要指事先已经搞清楚了酶蛋白的结构，有明确的修饰目标，定点改造某一结构活某氨基酸而设计的改造修饰方案，如酶蛋白的化学修饰、酶蛋白基因的定点突变等；非合理设计： 事先不必确定基因的改造修饰目标，设计酶蛋白基因改造技术和方法，设计基因改造方案，然后按照预定目标要求，进行筛选。酶分子的定向进化就属于非合理设计。 1. 酶分子定向进化方法： 目前已经研究成功的酶蛋白分子定向进化方法只要包括一下几个方面： 易错PCR方法； DNA改组方法； 基因家族之间的同源重组方法； 易错PCR法：易错PCR是在利用PCR（Polymerase Chain Reaction）技术在Taq聚合酶的催化下，对目的基

7、因进行扩增，通过调整反应条件（提高Mg 2浓度、加入Mn 2 改变反应体系中四种dNTP的比例浓度等） ，改变Taq酶催化的目的基因扩增中的突变频率，以一定的频率随机构件了基因突变库，然后选择或筛选符合需要的突变体。易错PCR的关键在于一下两点控制： 每个目的基因的突变碱基数要严格控制：突变率不应太高，太高时酶的基因突变太大，酶固有活力不易保持，太低不易实现酶分子的有效进化，一般理论上讲每个靶基因导入的突变碱基数控制在1.55个； 一般一次突变很难获得有用突变，所以在设计易错PCR时，是设计连续易错PCR 扩增，连续进行随机突变，从而获得符合进化目的的突变体。易错PCR定向进化的应用实例：利用

8、易错PCR定向进化L天冬氨酸酶实例设计工作程序：易错PCR筛选突变体（优势突变重组筛选）；研究结果： 获得了一株酶活力提高28倍的突变体；并且进化酶的pH稳定性和热稳定性都明显优于原始酶。进一步测序研究表明进化后的突变体共发生了7个碱基突变，其中3个突变位点引起了氨基酸的改变Asn217Lys； Thr233 Arg； Val367 Gly3Ch6-2 酶分子的定向进化（Directed Evilution）DNA改组技术DNA改组技术是在易错PCR方法基础上发展起来的，设想经过易错PCR获得的两个或两个以上的正突变的突变体，如果将这些正突变的突变部位整合到一个突变体上，会获得更为突出的定向进

9、化效果。具体方法是将多个正突变的突变体混合，然后用脱氧核糖核酸酶进行随机切割，得到随机DNA片段，然后进行PCR扩增，此时随机DNA片段互为模版（Template）或引物（Primer），直到获得全长基因片段后，进行分离和筛选，以获得高效突变体。基因家族之间的同源重组本定向进化方法是利用自然界中天然存在的基因家族出发，利用它们之间的同源顺序进行重组，这种方法获得高效突变的几率较大，并且盲目性小，容易获得理想的进化效果。研究报道实例：Stemmer等利用来自4种微生物编码头孢菌素酶的基因进行同源重组进化研究，获得了进化重组体的产酶活性提高了270倍。2.酶分子定向进化的酶工程意义酶分子定向进化研

10、究实践表明， 在改造、修饰酶蛋白分子方面主要体现以下几点： 提高酶分子的催化活力 提高酶的催化活力始终是酶工程研究的最实际、最有价值的研究热点之一。关于定向进化提高酶催化活力的实例前已列举，这里提高酶催化活力和提高产酶菌株的产酶活力的概念要加以区别，酶分子的定向进化是通过对酶蛋白分子进行改造来实现的酶活力提高；但传统的在酶工程研究领域，对产酶菌株进行诱变育种、培育，实现产酶活力的提高，后者不排除有导致酶蛋白分子发生改变的可能，但更重要的是通过点突变，改变细胞的代谢调控机制而实现产酶活力的提高。 改善酶蛋白的稳定性：提高酶蛋白的稳定性，尤其是热稳定性提高，是酶工程研究的另一研究热点。因为在关于生

11、产中，提高反应温度，可以提高底物的溶解度、降低反应介质的黏度，提高酶的催化活力，特别是防止在生产过程中的微生物污染。Zhao H 等在对枯草杆菌蛋白酶进行定向进化研究中，取得了很大成功，他们利用易错PCR 和突变体的DNA 改组方法，并进行提高温度的筛选条件进行重组体的筛选，使枯草杆菌蛋白酶的最适催化温度提高了17（65） 在最适温度下的半衰期增加了200倍。 改善酶蛋白的底物专一性 根据酶蛋白在生产中的应用特点，可以有目标地通过分子定向进化，提高或降低底物专一性。通过定向进化，降低Km值的实例很多，通过对进化酶蛋白的动力学研究，证明很多通过催化效率的进化酶的Km值大大降低。 通过酶蛋白分子对

12、应用环境的适应能力 许多酶蛋白催化适应环境是在长期生物体内的催化环境进化形成的，而在使用中，很难模拟体内的催化环境，通过定向进化，可以提高酶蛋白对催化环境的适应能力。如：在洗涤剂生产中，添加枯草杆菌蛋白酶，以增加洗涤剂去污能力，添加去脂肪酶增加去油渍的能力，而这些酶需要有特定的金属离子作为配基时，才能发挥良好的催化活性，而在洗涤过程中，往往在洗涤剂中都加有去离子熬合剂，对酶蛋白不利，利用定向进化改造酶蛋白的适应环境极为必要。Bryant报道利用定向进化方法，对枯草杆菌蛋白酶改造，去除了结合Ca的环突结构，获得了一株产不依赖Ca蛋白酶的枯草杆菌菌株。4Ch6-3 酶基因的定点突变定点突变是对已知

13、序列的基因(或DNA)中任意指定位置进行突变的技术，它又可以分为寡核苷酸诱导和寡核苷酸置换两大类。分别适用于不同类型的预先确定突变氨基酸位置的突变实验。5Ch6-3 酶基因的定点突变1.寡聚核苷酸诱导的定点突变这项技术主要是利用带有预定突变序列的寡核苷酸单链引物，在体外与原基因序列退火，诱导合成少量完整的突变基因，然后，通过体内增殖得到大量的突变基因。这类技术的最早应用是Hutehison和Razill等人，分别用合成的寡核苷酸引物诱导了X174单链噬菌体DNA嘌吟点突变。后来，逐渐改用M13单链噬菌体DNA作为基因载体，突变技术也日趋成熟。 定点突变的基本操作程序： (1)将酶基因(包括结构

14、基因和起动基因)克隆到M13(一种单链DNA噬菌体)上(或质粒上)，由此得到模板(以下称“正链”)。 (2)化学合成含有所需突变顺序的寡核苷酸引物，这段“突变引物”的核苷酸顺序，除预定突变的部位外，其余的顺序与“正链”互补。 (3)合成含突变顺序的双链M13 DNA，即是将合成的突变引物5端磷酸化后，与“正链”DNA退火，这时突变引物与“正链”的欲突变部位，形成含错误配对的双链，然后加入DNA聚合酶(常用大肠杆菌DNA聚合酶I)和四种dNTP，将引物延伸，合成全部互补的双链、并由T4噬菌体DNA连接酶封口，得到共价闭环双链DNA(cccDNA)。并用超离心或凝胶过滤等技术分离纯化双链DNA。

15、(4) 将双链DNA转染受体菌(例如大肠杆菌F株)使其扩增。从所得到的噬菌斑分离单链DNA。经印迹转移至硝酸纤维素薄膜上，把上述突变引物标记532P作为探针，进行杂交(退火)，此时突变型单链DNA与探针全部互补，而野生型(未突变者)与探针之间，存在错误配对，在高温洗涤时，这种互补链，易解链，探针被洗掉，因而留下来的互补链，可能是突变酶基因的链。 (5)由筛选到的含突变酶基因的受体菌株，进一步纯化，分离DNA，测定突变部位的顺序，与预定序列相符者，即为所要求的突变酶基因。 (6)将含有突变酶基因的M13，转化高效表达体菌、溶菌后即可收得大量的突变酶。这个方法有许多重要的优点: 它可以精确地在基因

16、的预定位置导入任何所需的突变，并有有效的筛选手段取得突变基因； 它对目的基因本身的结构没有任何附加要求(如要求它在某处具有某种限制位点之类)，可以直接地用于各种需要突变的基因； 这个方法步骤比较简单、技术比较成熟，因此，目前在蛋白质工程研究中得到了广泛的应用。这个方法也有一些缺点，最突出的一个缺点是突变基因产率较低，噬菌体后代带有所需突变的比率常常远低于理论值(50)。在某些场合，尤其当需要进行较多突变工作时，突变率低是很不利的，近年来，针对这一缺点，提出了许多改进方案。6Ch6-3 酶基因的定点突变2.寡聚核苷酸置换的定点突变 寡核苷酸诱导的定点突变法，只适用于将蛋白质中的某一氨基酸，转变为

17、预定的另一种氨基酸。但如果事先不能确定转变产物，需将每一种可能代替的氨基酸逐一实验的时候，就要同时进行某一位点的多种突变。适合这类要求的突变方法，就是寡核苷酸置换的定点突变法。 这类方法的特点是，用带有各种所需突变序列的寡核苷酸，在体外直接置换目的基因中欲变部位而实现突变。因为是直接置换，所以不需要进行退火和诱导合成。然而置换过程需要限制性酶切和连接酶连接，所以必须在双链DNA之间进行。寡核苷酸是双链，目的基因及其载体(质粒或 Phage M13)也是双链。盒式突变(Cassette mutagenesis) 本方法是这类技术的代表。所谓盒(Cassette)就是指与目的基因欲变部位相应的化学

18、合成的一系列双链寡核苷酸，它们带有各种能选用的突变序列。当进行突变处理时，根据实验需要把各种突变“盒”插入目的基因中，犹如把盒式录音带插入录音机一样，非常灵活方便，用此技术可使蛋白质中某种氨基酸残基一次分别为多种氨基酸取代。实例： 枯草杆菌蛋白酶(Subtilisin)的活性中心涉及Ser-221残基，与其邻近的是Met-222。由于Met-222的存在，使该酶易被氧化失活。因为事先无法确定哪种氨基酸取代Met-222后会既改善对氧化的稳定性，又不致剧烈降低酶的活力，故采用这种盒式突变技术对该酶进行修饰。完整的枯草杆菌蛋白酶的基因在质粒PS4.5的一个1.5Kb的EcoR I-BamHI消化片

19、段中。 将此片段连接到噬菌体M13mp9上，构成一个单链重组噬菌体DNA(M13mp9 SUBT)。 合成一个38体寡聚脱氧核苷酸引物，该引物缺失包括Met-222在内的10个核苷酸，并在其两侧分别创造了限制酶Kpn I和Pst I的新切点。 以此核苷酸为引物，以M13mp9SUBT为模板，在DNA聚合酶I(Klenow)和T4 DNA连接酶催化下体外复制成新的突变DNA分子。 用EcoRI-BamH I 消化后获得的DNA片段，再克隆到穿梭质粒pBS42上，获得质粒p222。 用限制酶Kpn I和Pst I消化这个质粒，形成切口，将5种双链25体寡核苷酸混合物(库)在连接酶催化下插入切口，形成五种不同的重组质粒。 用此混合质粒转化大肠杆菌，培养后提取质粒。分离单菌落的质粒DNA，测定DNA序