妥布霉素滴眼液含量测定

1、I 摘 要 目的目的：研究妥布霉素滴眼液的含量测定方法，比较各种方法的优点。方法：方法：(一)建立高效液相色谱-蒸发光散射检测器检测法(HPLC-ELSD)测定妥布霉素滴眼液的含量。 （二）采用双波长紫外分光光度法测定妥布霉素的含量。 （三）以邻苯二甲醛(PHT)为显色剂的比色法测定妥布霉素滴眼剂的含量。 （四）比较三种方法。结果：结果：HPLC-ELSD 方法专属性强，准确可靠，适用于妥布霉素滴眼液产品质量控制。双波长紫外分光光度法准确简便，重现性好，可用于制剂的质量控制。比色法具有快速、简便、准确、重现性好等优点，适合于产品中间体的质量控制和医院制剂的快速分析。关键词关键词 妥布霉素 含量

2、测定 HPLC-ELSD 含量测定 比色法II ABSTRACT Objective: Research the content determination of tobramycin eye drops and compare the methods.Methods: (1) To establish an HPLC - ELSD method for the content determination of tobramycin eye drops.(2) To establish the double wavelength ultravioletspectrophotometry met

3、hod for the content determination of tobramycin eye drops.(3) To establish the colorimetric method use PHT as the chromogenic reagent for the content determination of tobramycin eye drops.(4) Compare various methods.Results: The HPLC-ELSD is simple accurate and reliable. It is suitable for the routi

4、ne quality control of tobramycin eye drops preparations.The double wavelength ultravioletspectrophotometry method is simple, accurate, reliable, reproducible, and could be used for the routine quality control of the preparation.The colorimetric method is rapid, simple, accurate, reproducible, rapid

5、analysis and quality control of the preparation and the hospital are suitable for intermediateKey words tobramycin content determination HPLC ELSD content determination colorimetric methodI 目目 录录第 1 章 文献综述 11. 1 妥布霉素的发现以及应用 11. 2 妥布霉素含量测定方法以及优缺点 21. 3 本课题研究的内容及意义 2第 2 章 高效液相色谱-蒸发光散射检测器检测法 32. 1 仪器与试

6、药 32.1.1 原料与仪器 32.1.2 色谱条件 32. 2 实验方法 42.2.1 强力破坏试验 42.2.2 系统适应性试验 42.2.3 线性关系试验 52.2.4 灵敏度试验 62.2.5 稳定性试验 62.2.6 回收率试验 62.2.7 重复性试验 62.2.8 样品测定 62. 3 结果与对比 8第 3 章 双波长紫外分光光度法 93. 1 仪器与试药 93.1.1 原料与仪器 93.1.2 处方 93. 2 试验方法 93.2.1 测定波长的选择 93.2.2 线性关系及标准曲线的绘制 93.2.3 回收率试验 103.2.4 含量测定 103. 3 试验结果 10第 4

7、章 比色法 114. 1 仪器与试药 114. 2 实验方法与结果 11II 4.2.1 邻苯二甲醛(PHT)试液的配制18 114.2.2 妥布霉素衍生物吸收光谱 114.2.3 妥布霉素衍生物稳定性 114.2.4 重现性 114.2.5 标准曲线的绘制 124.2.6 样品含量测定 124.2.7 回收率试验 124.2.8 比色法与微生物法的比较 134. 3 试验结果 14第 5 章 结论 155. 1 准确性 155. 2 通用性 15参考文献 16致谢 181 第 1 章文献综述妥布霉素属氨基糖苷类抗生素。抗菌谱与庆大霉素近似，对大肠埃希菌、产气杆菌、克雷白杆菌、奇异变形杆菌、某

8、些吲哚阳性变形杆菌、铜绿假单胞菌、某些奈瑟菌、某些无色素沙雷杆菌和志贺菌等革兰阴性菌有抗菌作用；本品对铜绿假单胞菌的抗菌作用较庆大霉素强 35 倍，对庆大霉素中度敏感的铜绿假单胞菌对本品高度敏感。革兰阳性菌中，金黄色葡萄球菌（包括产内酰胺酶株）对本品敏感；链球菌（包括化脓性链球菌、肺炎球菌、粪链球菌等）均对本品耐药。厌氧菌（拟杆菌属） 、结核杆菌、立克次体、病毒和真菌亦对本品耐药。本品的作用机制是与细菌核糖体 30S 亚单位结合，抑制细菌蛋白质的合成。1. 1 妥布霉素的发现以及应用妥布霉素（tobramycin）是 1967 年由链霉菌得到的抗生素，亦可从kanamycin B 脱氧制备，临

9、床制剂为其硫酸盐。妥布霉素适用于绿脓杆菌、变形杆菌(吲哚阳性和阴性)、大肠杆菌、克雷伯菌属、肠杆菌属、沙雷菌属及葡萄球菌（包括耐青霉素 G 与耐甲氧西林菌株）所致的新生儿脓毒症、败血症、中枢神经系统感染（包括脑膜炎） 、泌尿生殖系统感染、肺部感染、胆道感染、腹腔感染（及腹膜炎） 、骨骼感染、皮肤、软组织感染（包括烧伤） 、急性与慢性中耳炎、鼻窦炎等。该品用于绿脓杆菌脑膜炎或脑室炎时可同时鞘内注射给药；用于支气管及肺部感染时可同时气溶吸入该品作为辅助治疗。妥布霉素对多数 D 组链球菌感染无效。用于结膜炎、角膜炎等眼部细菌感染，特别是对庆大霉素耐药的革兰阴性秆菌感染，如严重的绿脓杆菌感染有效。妥布

10、霉素由肌注后吸收迅速而完全。局部冲洗或局部应用后亦可经身体表面吸收一定量。吸收后主要分布于细胞外液；其中 515%再分布到组织中，在肾皮质细胞中积蓄，该品可穿过胎盘。分布容积为 0、26L/kg。尿液中药物浓度高，肌注 1mg/kg 后尿中浓度可达 75100g/ml。滑膜液内可达有效浓度，在支气管分泌液、脑脊液、胆汁、粪便、乳汁、房水中浓度低。肌注 1mg/kg 后血药浓度可达 4g/ml；静滴上述剂量 1 小时，其血药浓度与肌注相似。T1/2 为 1、92、2小时，蛋白结合率很低。该品在体内不代谢，经肾小球滤过排出。24 小时内排出2 给药量的 8593%。该品可经血液透析或腹膜透析清除。

11、1. 2 妥布霉素含量测定方法以及优缺点 妥布霉素 tobramycin 是从黑暗链霉菌 Streptomyces tenebrarius 发酵液中提取得到的具有广谱抗菌活性的氨基糖苷类抗生素，其含量测定方法主要有微生物效价测定法1-3、旋光法3、UV 衍生化法3、高效液相色谱-间接光度检测法HPLC-IPD4、HPLC 衍生化法5-7、HPLC 电化学检测器法8及 TLC 3，但常用的微生物效价测定法测定误差较大，衍生化法影响因素较多，而电化学检测法使用不易，较难普及。近年来国内外有文献报道采用蒸发光散射检测技术 ELSD 分析氨基糖苷类抗生素 9-13，中国药典 2005 年版也已收载该检

12、测技术和部分相关品种；以 HPLC-ELSD 测定妥布霉素及其制剂的方法也陆续见诸报道。 1. 3 本课题研究的内容及意义含量测定是指原料药可用已知纯度的对照品或符合要求的原料药进行测定，或用本法所得结果与已建立准确度的另一方法测定的结果进行比较。 制剂可用含已知量被测物的各组分混合物进行测定。如不能得到制剂的全部组分，可向制剂中加入已知量的被测物进行测定，必要时，与另一个已建立准确度的方法比较结果。一般制剂的含量测定的回收率是向辅料中加入处方量 80、100%、120%已知含量的主药，按含量测定的方法测定。溶出度测定方法的回收率按处方量50、80、100加入主药进行测定。妥布霉素对听神经和肾

13、脏有一定毒性，可引起肾损害，对肾脏的毒性较庆大霉素为少见，仅约 1%的病人有肾功能武失常的征候，如管型尿、少尿、蛋白尿或血清肌酐浓度升高等。肾功能不全者可引起胃肠道反应：恶心，呕吐，食欲不振，腹胀，腹泻、可有肝损害，转氨酶升高、血小板减低、白细胞减低、粒细胞减低、皮疹、静脉炎等。血象改变、剂量大时可有神经毒性、二重感染、中毒性精神病均可发生。因此药品内含量检测直接关系到给药剂量，必须严格要求药品含量以确保给药剂量在可接受范围之内。3 第 2 章高效液相色谱-蒸发光散射检测器检测法2. 1 仪器与试药2.1.1 原料与仪器 Agilent 1100 高效液相色谱仪，Dikma SEDEX 75

14、型 ELSD 检测器美国安捷伦科技有限公司； 水为重蒸水；三氟乙酸、甲醇均为色谱纯；妥布霉素标准品批号：0340-200002 ，标示含量 880 umg-1 由中国药品生物制品检定所提供；妥布霉素原料药 1 批批号：020501；硫酸妥布霉素原料药 1 批批号：021003；妥布霉素 B 组分杂质对照品无批号均由浙江海正药业股份有限公司提供；妥布霉素滴眼液样品 5 批。分别为：宁波唯森制药有限公司批号：20050301、20050302、20050303；杭州易舒特药业有限公司批号：20041201；眼力健杭州制药有限公司批号：2H0249；上市或长期留样至今样品，规格均为 5 mL15 m

15、g。2.1.2 色谱条件色谱柱：Agilent Zorbax SB - C184.6 mm250 mm，5 um；柱温：35 ；流动相：0.2 molL-1 三氟乙酸溶液-甲醇 928；流速：0.8 mLmin-1；ELSD 漂移管温度：45 ；雾化气体压力：3.5 bar；灵敏度信号增益 GAIN 值：5；进样体积：10 uL。4 2. 2 实验方法2.2.1 强力破坏试验取妥布霉素原料药 5 份，各约 58 mg，分别置 4 个 50 mL 量瓶中，前 3 份分别加入 1 molL-1 冰醋酸溶液 1 mL、l molL-1 氨溶液 l mL 与 3 过氧化氢溶液 1 mL，第 4 份置

16、120 恒温箱中放置，第 5 份不作任何破坏。各放置 3 h 后，分别加流动相溶解并稀释至刻度。按“2”项下的色谱条件，取上述各溶液的混合液10uL 进样测试，记录色谱图。结果各受试样品中经极端条件破坏后产生的几种较大未知物峰与妥布霉素主组分峰均能良好分离。见图 2-1：图 2-1 强力破坏试验的 HPLC-ELSD 图（1.0mlmin-1，GAIN=6）1-未知物；2-未知物；3-妥布霉素2.2.2 系统适应性试验取妥布霉素原料药和妥布霉素 B 杂质对照品各适量，用流动相溶解并稀释制成每 1 mL 中含妥布霉素 1 mg 和妥布霉素 B 约 0.05 mg 混合溶液，取 10 uL 进样测

17、试，记录色谱图，结果妥布霉素主组分和妥布霉素 B 组分两峰之间的分离度达5 6.54，表明本法建立的色谱条件可以达到系统适用性试验要求。见图 2-2：图 2-2 系统适用性试验的 HPLC-ELSD 图（1.0mlmin-1，GAIN=6）1-妥布霉素 B 分组；2-妥布霉素2.2.3 线性关系试验取妥布霉素标准品，分别精密称取适量，加流动相溶解并稀释制成55.546，111.091，277.728，555.456，777.568，1 012.000，1 230.592，1 396.736ugmL-1 浓度的系列溶液，分别进样 10 uL，记录色谱图。以妥布霉素主组分峰面积的常用对数为纵坐标，

18、进样浓度 ugmL-1 的常用对数为横坐标，以最小二乘法进行线性回归，得回归方程为：Y 1.29569 X 7.61388，r0.999 7。结果表明，妥布霉素浓度在 55.551396.74 ugmL-1 内线性良好。6 2.2.4 灵敏度试验取“3.3”项下较低浓度的梯度测试溶液 1 份，用流动相逐级稀释，精密量取 10 uL 进样测试，结果测得本法的检测限按信噪比 31 计算时为 0.15 ugmL1，定量限按信噪比 101 计算时为 0.45ugmL-1。2.2.5 稳定性试验取妥布霉素滴眼液样品 1 批批号：2H0249，加流动相稀释制成每 1 mL 中含妥布霉素 1 mg 的溶液，

19、于 24 h 内分别在 1，2，4，8，12，16，24 h 进样测试。结果妥布霉素主组分峰面积与硫酸根的峰面积的 RSD 分别为 1.4 和 2.2，表明样品在 24 h 内稳定。2.2.6 回收率试验为考察滴眼液辅料对含量测定方法准确性的影响，按处方制备不含主药的空白基质用于加样回收率测定。分别以标示规格 15 mg 的 80、100 及 120 精密称取妥布霉素标准品适量，按处方规定加入常量的空白基质，涡旋混匀，即制成模拟的妥布霉素滴眼液，依法测定，按随行标准曲线法计算妥布霉素的加样回收率。结果 3 组3 份试样的回收率依次为100.7、97.5、99.2、98.7、98.2、99.5、

20、97.9、99.1 及 100.1，平均回收率为 98.99 RSD1.05，n9，表明本法具有较好的准确性。2.2.7 重复性试验取妥布霉素滴眼液样品一批批号：20050301，加流动相定量稀释制成每 1 mL中含妥布霉素 1 mg 的溶液，共平行制备 9 份，依法测定，按随行标准曲线法计算样品中妥布霉素的含量。结果该批样品中妥布霉素的平均含量为 103.5，RSD 为0.77，表明本法具有良好的重复性2.2.8 样品测定取妥布霉素滴眼液 5 个批次样品，分别加流动相定量稀释制成每 1 mL 中含妥7 布霉素 1 mg 的溶液，依法测定妥布霉素的含量；同时取上述各批样品，照妥布霉素滴眼液现行

21、国家标准制订的微生物效价检定法测定主药妥布霉素的含量。结果见表 2-1 与图 2-3：表 2-1 妥布霉素滴眼液 HPLC-ELSD 法与微生物检定法含量测定结果的比较（=3）图 2-3 妥布霉素标准品溶液(A)和供试品溶液（B）的 HPLC-ELSD 图（0.8mlmin-1，GAIN=6）8 2. 3 结果与对比在对妥布霉素原料药所进行的前期研究18中，ELSD 随行标准曲线法的含量测定结果与中国药典的微生物效价法测定结果基本一致，不过本试验以 HPLC-ELSD 测得的妥布霉素滴眼液中妥布霉素的含量与效价法测定结果相比均偏低。分析原因应是效价法的测定结果是该药物主成分与其次组分及相关物质

22、抑菌活性的总和，而 HPLC-ELSD 实现了药物主成分与其他并存组分或杂质的分离，测得的结果是主成分含量的真实体现，比效价法更能反应样品的实际情况，因而是更为科学、专属的检测方法。我国药典和国际药典标准中一般采用微生物法或衍生化法测定妥布霉素的含量，方法往往步骤繁杂，工作量大，耗时长，影响因素也较多。采用 ELSD 法检测具有简便、快速，样品无须处理及衍生化的优势，可以控制误差来源，提高分析精度，测定结果准确，方法经进一步改进和验证后并可同时进行样品的有关物质分析，有利于控制产品质量，提高药品生产水平。9 第 3 章 双波长紫外分光光度法3. 1 仪器与试药3.1.1 原料与仪器 754 紫

23、外分光光度计(上海分析仪器厂)；PHS-3C PH 计 (上海雷磁仪器厂)；妥布霉素(批号 20030507，福州抗生总厂提供)丙酮、醋 酸、硼酸、磷酸、氢氧化钠、乙酰丙酮、甲醛均为分析纯。3.1.2 处方妥布霉素 1.5g、苯扎溴铵 0.5ml，共制成 500ml。3. 2 试验方法3.2.1 测定波长的选择取妥布霉素适量, 用 0.2mol/醋酸、硼酸、磷酸、NaOH 调 pH2.50.05 与等体积妥布霉素溶液混合后 pH 应为 2 .6 的缓冲溶液，另取乙酰丙酮 0.8ml,36%甲醛液1.7ml,加配制好的缓冲溶液 30ml,搅匀为衍生化试剂，再取妥布霉 10ug/ml 与衍生化试剂

24、等体积于具塞试管 中，在沸水中加热 25min，冷至室温，于 300500nm波长范围内扫描，出现最大吸收为 322nm。溶剂在此波长无吸收，故选择 356nm波长分别为妥布霉素的测定波长。3.2.2 线性关系及标准曲线的绘制取妥布霉素精密称定,用水稀释成(ug/ml)5、10、15、 20、25、30、35 在356nm 波长处测定吸收值其回归方程为： A=0.0154C+0.3075 r=0.9999，n=7 妥布霉素每毫升溶液含 535ug 内浓度与吸收值呈线性关系。 10 3.2.3 回收率试验模拟试样取五份样品，在 356nm 处测其吸收值代入回归方程，计算浓度，求得百分率。结果见表

25、 3-1：表 3-1 妥布霉素回收率试验结果（n=5）3.2.4 含量测定取样品稀释至每毫升含妥布霉素 30ug,衍生化后，在 356nm 处测定吸收值，代入回归方程计算含量3. 3 试验结果妥布霉素在 535ug/ml 范围内浓度与吸收值呈线性关系，平均回收率为99.93%，RSD 为 0.3210%。含量测定方法准确简便，重现性好，妥布霉素测其吸收值 4 小时内无变化，适用于工业化生产，可用于制剂的质量控制。11 第 4 章 比色法4. 1 仪器与试药UV1601 紫外可见分光光度计(日本)；妥布霉素标准品(中国药品生物制品检定所，效价 862u/mg，批号 3408901);妥布霉素原料

26、药(广东新北江制药股份有限公司)；妥布霉素滴眼剂(中山医科大学眼科中心制剂室，5ml：15000u)；邻苯二甲醛(德国)。4. 2 实验方法与结果4.2.1 邻苯二甲醛(PHT)试液的配制14称取邻苯二甲醛 100mg 溶于适量 pH 值为 10.5 的硼酸盐缓冲液中，加 1ml 巯基乙醇，再加硼酸盐缓冲液至 100ml，用饱和氢氧化钠溶液调至 pH 值为 105。4.2.2 妥布霉素衍生物吸收光谱 称取妥布霉素适量，以水为溶剂配成 100g/ml 的标准溶液，精密吸取标准溶液 15ml 于 10ml 量瓶中，加异丙醇 3ml，PHT 试剂 2ml，以异丙醇稀释至刻度，于 60水浴加热 15m

27、in，以相应试剂作空白，在 200400nm 波长范围内扫描，绘制吸收光谱，结果在 333nm 波长处有最大吸收峰。4.2.3 妥布霉素衍生物稳定性以本品 15gml 反应液在 333nm 波长处立即测定，与在室温放置05h、1h、15h、2h 分别测得吸收度比较，结果几乎无变化。4.2.4 重现性取妥布霉素 15g/ml 的反应液 5 份，分别在 333nm 波长处进行测定，吸收度平均值为 0.7754，标准差为 00042，重现性良好。12 4.2.5 标准曲线的绘制精密称取妥布霉素标准品适量，以水为溶剂配成 100g/ml 的标准溶液，分别精密吸取标准溶液 0.5ml、10ml、1.5m

28、l、2.0ml、2.5ml 置 10ml 量瓶中，分别加异丙醇 3ml，PHT 试剂 2ml，用异丙醇稀释至刻度，以相应试剂作空白，于 60水浴加热 15min，冷却至室温，在 333nm 波长处依次测定吸收度，将数据进行回归处理得回归方程为 A=0.04918C+0.0394(C：g/ml)，r=0.9997，妥布霉素衍生物线性范围 130g/ml。4.2.6 样品含量测定精密吸取妥布霉素滴眼剂 2ml，置 100ml 量瓶中，以水稀释至刻度。从上述溶液中精密吸取 2ml 于 10ml 量瓶中，加异丙醇 3ml，PHT 试剂 2ml，用异丙醇稀释至刻度，以相应试剂作空白，于 60水浴加热 1

29、5min，冷却至室温，在 333nm波长处测定吸收度，利用回归方程计算百分含量。4.2.7 回收率试验按妥布霉素滴眼剂处方制备模拟制剂，照样品测定项下操作，依法测得回收率，结果如表 4-1:13 表 4-1 回收率试验序号投入量(万 u/ml)测得量(万 u/ml)回收率(%)10.240.234897.8320.240236098.3330.300.299899.9340.300.297599.1750.360.3625100.6960.360.359699.89注：平均回收率为 99.31%，RSD 为 1.084.2.8 比色法与微生物法的比较分别用比色法和微生物法测定 3 批妥布霉滴眼

30、剂的含量，结果如表 4-2：表 4-2 微生物法与比色法测定结果比较(n=3)批号微生物法标示量(%) 比色法标示量(%)P99100799.6396.00991026100.72101.890.0500022294.4295.3314 4. 3 试验结果妥布霉素滴眼剂处方中各辅料经实验验证，对结果没有影响。实验结果表明，两法测定妥布霉素含量的结果，经统计学处理，无显著性差异(P 0.05)。15 第 5 章 结论5. 1 准确性三种方法都能准确测量妥布霉素滴眼液中妥布霉素的含量。5. 2 通用性妥布霉素为较新的氨基糖苷类广谱抗生素，具有抗菌谱广，耐药性小，毒性低，临床疗效好的特点。美国药典1

31、5和我国卫生部颁标准均采用微生物检定法。相比较而言，HPLC-ELSD 方法专属性强，准确可靠，适用于妥布霉素滴眼液产品质量控制。双波长紫外分光光度法准确简便，重现性好，可用于制剂的质量控制。比色法具有快速、简便、准确、重现性好等优点，适合于产品中间体的质量控制和医院制剂的快速分析。16 参考文献1 Ch.P 2005 Vol II. 中国药典 2005 年版. 二部 S. 2005: 270. 2 Japan Antibiotics Research Association. Publisher Jp. The Minimum Requirement for Antibiotic Produ

32、cts of Japan in Japanese 日本抗生物质医药品基准解说 S. 2000: 95 3 SU Z. A Review on tobramycin analysis methods J. Strait Pharm J 海峡药学 2004 16 4: 13-14. 4 YUAN C JIA N WANG J X et al. Determination of aminoglycosides in body fluid by high performance liquid chromatographic-indirect photomation determination meth

33、od J. Chin J Pham Anal 药物分析杂志 1999 192:108-110. 5 EP5.1S. 2005: 2588.6 XIAO D W GUO H. Detemination of tobramycin in multivitamin B liquid by HPLC J. Jiangsu Pharm and Clinical Research 江苏药学与临床研究 2003 113: 14-15. 7 YU H S CHEN D H MA S J. Determination of tobramycin by HPLC with precolumn derivatization J. Strait Pharm J 海峡药学 2001 134:28-30. 8 USP28S. 2005: 1938. 9 WANG M J HU C Q JIN S H. Analysis of micronomycin Sagamicin and its related substances by HPLC-ELSD J. Chin J Pham Anal 药物分析杂志 2002 22 3: 205-208. 10 WANG M J，HU C Q，JIN S H. A new HPLC method for determ