第10章核酸的生物合成

1、第十章 核酸的生物合成基基 因因 (gene)： 为蛋白质或为蛋白质或RNA编码的编码的DNA功能片功能片段，是以碱基排列顺序的方式储存的遗段，是以碱基排列顺序的方式储存的遗传信息。传信息。基基 因因 组组（genome)： 某一物种拥有的全部遗传物质，从某一物种拥有的全部遗传物质，从分子意义上说，是指全部分子意义上说，是指全部DNA序列。序列。 转录转录 翻译翻译 复制复制 DNA RNA 蛋白质蛋白质 逆转录逆转录 * 中心法则中心法则(the central dogma) 转录转录 翻译翻译 复制复制 DNA RNA 蛋白质蛋白质 逆转录逆转录 转录转录 翻译翻译 复制复制 DNA RN

2、A 蛋白质蛋白质 逆转录逆转录 转录转录 翻译翻译 复制复制 DNA RNA 蛋白质蛋白质 逆转录逆转录 转录转录 翻译翻译 复制复制 DNA RNA 蛋白质蛋白质 逆转录逆转录 转录转录 翻译翻译 复制复制 DNA RNA 蛋白质蛋白质 逆转录逆转录 主要内容主要内容 DNA的生物合成的生物合成 复制复制 RNA的生物合成的生物合成 转录转录 蛋白质的生物合成蛋白质的生物合成 翻译翻译 基因重组与基因重组与基因工程基因工程第一节第一节 DNA的生物合成的生物合成 DNA Biosynthesis一、DNA的复制二、逆转录三、 DNA的损伤和修复四、多聚酶链式反应（PCR）一、一、DNA的复制

3、的复制 DNA分子是如何通过复制把遗传信息高度保真性地（fidelity）传递给子代细胞的？一、DNA的复制 概念：DNA在复制时，以亲代DNA的每一股作模板，合成完全相同的两个双链子代DNA，每个子代DNA中都含有一股亲代DNA链，这种现象称为DNA的半保留复制(semi-conservative replication)。 （一）复制的基本规律1、半保留复制复制复制亲代亲代DNA子代子代DNADNA半保留复制示意图Watson 和和Crick于于1953 年假定年假定DNA的的复制为半保留复制。复制为半保留复制。A TG CC GT A亲代DNATCGAA G C TA G C TTCGA

4、子代DNA 全保留式全保留式 半保留式半保留式 混合式混合式 DNA复制的三种可能方式复制的三种可能方式 1958 年M. Meselson 和F. M. Stall 利用同位素15N标记大肠杆菌，首先证明了DNA半保留复制。15N-15N14N-14N15N-14N 半保留复制的生物学意义 按半保留复制方式，子代DNA与亲代DNA的碱基序列一致，即子代保留了亲代的全部遗传信息，体现了遗传的保守性。 遗传的保守性，是物种稳定性的分子基础，但不是绝对的。 DNA在复制时，需在特定的位点起始，这是一些具有特定核苷酸排列顺序的片段，即复制起始点(origin) 。 在原核生物中，复制起始点通常为一个

5、，而在真核生物中则为多个。2. 有一定的复制起始点有一定的复制起始点 放射自显影证实亲代链解开后立即进行复制，没有发现单链DNA。细菌和酵母菌中DNA复制起始点的碱基序列 习惯上把两个相邻DNA复制起始点之间的距离（或DNA片段）定为一个复制子(replicon) 。 复制子是独立完成复制的功能单位。 DNA复制时，局部双螺旋解开形成两条单链，这种叉状结构称为复制叉。起起点点起起点点起起点点起起点点起起点点起起点点3、复制方式E.coil基因结构与复制起点基因结构与复制起点oriterA B CA. 环状双链环状双链DNA及复制起始点及复制起始点B. 复制中的两个复制叉复制中的两个复制叉C.

6、复制接近终止点复制接近终止点(termination, ter)DNA的双向复制示意图 DNA聚合酶只能以53方向聚合子代DNA链，即模板DNA链的方向必须是35。 由于DNA分子中两条链的走向相反，因此当分别以两条亲代DNA链作为模板聚合子代DNA链时，子代链的聚合方向也是不同的。4、半不连续复制3 5 3 5 3 5 3 5 解链方向解链方向领头链领头链(leading strand)随从链随从链(lagging strand)DNA的半不连续复制3 5 半不连续复制动画半不连续复制动画冈崎片段：冈崎片段： 1968年日本生化学者冈崎用电镜及放射年日本生化学者冈崎用电镜及放射自显影技术，观

7、察到自显影技术，观察到DNA复制中出现复制中出现一些一些不连续的片段不连续的片段，将这些不连续的片，将这些不连续的片段称为段称为冈崎片段冈崎片段。 原核生物原核生物: : 10002000个核苷酸个核苷酸 真核生物真核生物: : 100200个核苷酸个核苷酸 以35方向的亲代DNA链作模板的子代链在复制时基本上是连续进行的，其子代链的聚合方向为53，这一条链被称为领头链(leading strand)。 以53方向的亲代DNA链为模板的子代链在复制时则是不连续的，其链的聚合方向也是53，这条链被称为随从链(lagging strand)。 领头链连续复制而随从链不连续复制，就是复制的半不连续性

8、。 （二） DNA复制的体系复制的体系 底物底物: : dNTP (dATP、dGTP 、dCTP 、dTTP) 聚合酶聚合酶: 依赖依赖DNA的的DNA聚合酶聚合酶(DNA-pol) 模板模板: 解开成单链的解开成单链的DNA母链母链 引物引物: : 提供提供3-OH末端的寡核苷酸末端的寡核苷酸 其他酶和蛋白质因子其他酶和蛋白质因子: : 拓扑异构酶、解螺旋酶、拓扑异构酶、解螺旋酶、单链单链DNA结合蛋白结合蛋白、引物酶、连接酶引物酶、连接酶复制的化学反应复制的化学反应 (dNMP)n + dNTP (dNMP)n+1 + PPi 聚合反应的特点 以DNA单链为模板 以dDNA为原料 引物提

9、供3OH 聚合方向为5 331、拓扑异构、拓扑异构E（动画动画）1010 8 8 局部解链后DNA复制过程中正超螺旋的形成解链过程中正超螺旋的形成解链过程中，解链过程中，DNA分子会过度拧紧、打结、缠绕、分子会过度拧紧、打结、缠绕、连环等现象。连环等现象。拓扑异构酶的作用特点既能水解 、又能连接磷酸二酯键 拓扑异构酶拓扑异构酶分 类拓扑异构E不需要能量或辅助因子如：不需要能量或辅助因子如：ATPATP和和NADNAD需要能量或辅助因子如：需要能量或辅助因子如：ATPATP和和NADNAD拓扑异构酶拓扑异构酶的作用的作用拓扑异构酶拓扑异构酶的作用的作用通过催化通过催化DNADNA拓扑结构的变化，

10、拓扑结构的变化，减少由于解链形成的张力减少由于解链形成的张力解链解链双螺旋存在张力双螺旋存在张力DNADNA拓扑异构酶拓扑异构酶张力解除张力解除双螺旋变成松弛状态双螺旋变成松弛状态 解螺旋酶解螺旋酶(helicase)又称解链酶或又称解链酶或rep蛋白蛋白 利用利用ATP供能，作用于氢键，使供能，作用于氢键，使DNA双链双链解开成解开成为两条为两条单链。单链。每解开一对碱基，需消耗每解开一对碱基，需消耗2分子分子ATP。2. 解旋酶解旋酶3、单链DNA结合蛋白 (SSB )3555 3 SSB的作用的作用 保护单链保护单链DNA 免遭核酸免遭核酸的降解。的降解。 防止单链再次形成双链防止单链再

11、次形成双链 降低降低DNA 的的Tm，促进促进DNA 解链。解链。SSB4、引发酶和引发体3 HO53 5 3 5 引物酶引物酶是一种是一种依赖依赖DNA的的RNA聚合酶聚合酶，该酶以，该酶以DNA为为模板，合成一段模板，合成一段RNA引物，为引物，为DNA聚合酶提供自由的聚合酶提供自由的3-OH，使子代，使子代DNA链能够开始聚合。链能够开始聚合。引物引物引物引物酶酶 Dna ADNA拓扑异构酶拓扑异构酶 Dna B Dna CSSB Dna A Dna B Dna CDNA拓扑异构酶拓扑异构酶引物引物酶酶SSB3 5 3 5 含有解螺旋酶(DnaB蛋白)、DnaC蛋白、引物酶和DNA复制起

12、始区域的复合结构称为引发体。 引发体的组装形成 引物酶的作用：为DNA聚合酶提供自由的3OH RNA引物的大小，在原核生物中通常为50 100个核苷酸，而在真核生物中约为10个核苷酸。RNA引物的碱基顺序，与其模板DNA的碱基顺序相配对。 5、DNA 聚合酶全称：依赖DNA的DNA聚合酶 ( DNA-dependent DNA polymerase, DDDP )简称：DNA-pol活性：1. 53 的聚合酶活性 2. 核酸外切酶活性大肠杆菌中至少有5 种，分别命为DNA 聚合酶、。 DNA 聚合酶I（单体酶：单肽链） 主要功能：负责DNA 的损伤修复及在DNA 复制中切除引物，填补空隙的作用

13、。 若用枯草杆菌蛋白酶处理此酶，可得两个片段。蛋白酶切口蛋白酶切口Klenow片段的分子结构片段的分子结构大片段保留了两种酶活性,即53聚合酶和35外切酶活性，通常被称为Klenow fragment。5 3 聚合酶活性5 A G C T T C A G G A T A 3 | | | | | | | | | | |3 T C G A A G T C C T A G C G A C 5 3 5 外切酶活性外切酶活性 5 3 外切酶活性外切酶活性?能切除突变的能切除突变的 DNA片段。片段。能辨认错配的碱基对，并将其水解。能辨认错配的碱基对，并将其水解。 DNA聚合酶的核酸外切酶活性 35外切酶

14、活力外切酶活力DNA 聚合酶I小结DNA 聚合酶（单体酶） 主要功能参于DNA 的损伤修复，具有53 聚合活力，较弱，3 5外切活性。但无5 3外切活性。DNA 聚合酶 （寡聚酶） 是催化大肠杆菌DNA 复制的主酶，全酶有10 种亚基，含Zn2+。大肠杆菌大肠杆菌DNA聚合酶聚合酶全酶的结构和功能全酶的结构和功能 延长因子延长因子DNADNA聚合酶聚合酶 两个两个 亚基夹住亚基夹住DNADNADNADNA聚合酶聚合酶异二聚体异二聚体核心酶核心酶校对校对引物的结引物的结合和识别合和识别促使核心促使核心酶二聚化酶二聚化原核生物 DNA聚合酶真核 DNA聚合酶聚合酶聚合酶 DNA连接酶(DNA li

15、gase)可催化两段DNA片段之间磷酸二酯键的形成，从而把两段相邻的DNA链连接成一条完整的链。6、DNA连接酶功能功能 连接复制过程形成的连接复制过程形成的DNADNA片段片段, ,形成一个形成一个3 3,5,5- -磷酸二酯键磷酸二酯键连接酶连接酶ATGCCGPPOHAPTATGCCGPAPTP连接酶连接酶DNA连接酶连接酶ATP（NAD+）ADP+Pi（NMN+AMP）HO5POO-O-O353POO-O-O3553DNA连接酶的连接作用连连接接酶酶连连接接切切口口Mg2+连接酶连接酶ATP或或NADAMP+PPi或或NMN+AMPATCGPTTPPPAACCTGAPACPPPPOHTG

16、GATCGPTTPPPAACCTGAPACPPPTGGP缺口33555533模板链模板链模板链模板链 DNA连接酶催化的条件是： 需一段DNA片段具有3-OH，而另一段DNA片段具有5-Pi基； 未封闭的缺口位于双链DNA中，即其中有一条链是完整的； 需要消耗能量，在原核生物中由NAD+供能，在真核生物中由ATP供能。DNA连接酶在复制中起最后接合缺口的作用。连接酶在复制中起最后接合缺口的作用。在在DNA修复、重组及剪接中也起缝合缺口作修复、重组及剪接中也起缝合缺口作用。用。是基因工程的重要工具酶之是基因工程的重要工具酶之一。一。DNA连接酶的作用DNA复制酶系总览复制酶系总览（三）原核生物D

17、NA 复制DNA +n1dATPn2dGTPn3dCTPn4dTTPDNA+(n1+n2+n3+n4)PPi聚合酶聚合酶Mg2+以四种dNTP 为底物在DNA 模板指令下，按碱基配对的原则，由DNA 聚合酶催化，向DNA 的3OH 端添加核苷酸，以5 3 的方向合成与模板互补的新链。1、复制的起始原核生物：原核生物：特定位点开始，特定位点终止，只有特定位点开始，特定位点终止，只有 一个复制子。（基因组能独立进行复一个复制子。（基因组能独立进行复 制的单位）。制的单位）。真核生物：真核生物：多个位点起始，多复制子。多个位点起始，多复制子。大肠杆菌复制起始点：大肠杆菌复制起始点：oriCoriC

18、（originaloriginal） 终止点：终止点：terter （terminateterminate） 一些特殊的Pr 可以识别并结合到复制起点，随即使DNA 双螺旋局部解链，形成复制眼，在其两端的DNA 的两股链呈丫字状，称为复制叉。分别向两侧进行复制，通常复制叉双向等速前进， 迅速生长的细菌，第一轮复制未完成就启动第二次复制。迅速生长的细菌，第一轮复制未完成就启动第二次复制。DNA复制的起始阶段，由下列两步构成。 1解旋解链，形成复制叉： 由拓扑异构酶和解链酶作用，使DNA的超螺旋及双螺旋结构解开，碱基间氢键断裂，形成两条单链DNA。 单链DNA结合蛋白（SSB）四聚体结合在两条单链

19、DNA上，形成复制叉。2引发体组装和引物合成： 由解螺旋酶(DnaB蛋白) 、DnaC蛋白、引物酶(DnaG蛋白)和DNA复制起始区域形成引发体； 在引物酶的催化下，以DNA为模板，合成一段短的RNA片段，从而获得3端自由羟基（3-OH）。 5 5 3 35 5dATPdGTPdTTPdCTPdTTPdGTPdATPdCTPOH 33 3DNA-polDNADNA复制的延长过程复制的延长过程2、DNA 链的合成与延伸领头链的合成过程随从链的合成过程DNA聚合酶聚合酶RNA引物引物 领头链的合成是领头链的合成是连续的，而随从连续的，而随从链的合成是不连链的合成是不连续的，为什么？续的，为什么？复

20、复制制过过程程简简图图解螺旋酶解螺旋酶3 55 335DNADNA拓扑异构酶拓扑异构酶DNA聚合酶聚合酶引发体引发体连接酶连接酶DNADNA复制系统复制系统SSPDNA聚合酶聚合酶 I 原核生物基因是环状原核生物基因是环状DNA，双向复制的复制双向复制的复制片段在复制的终止点片段在复制的终止点(ter)处汇合。处汇合。 E.colioriter8232 ori terSV405003、复制的终止 在复制过程中形成的RNA引物，需由RNA酶来水解去除； RNA引物水解后遗留的缺口，由DNA聚合酶（原核生物）或DNA聚合酶（真核生物）催化延长缺口处的DNA，直到剩下最后一个磷酸酯键的缺口。（1）去

21、除引物，填补缺口： 在DNA连接酶的催化下，生成最后一个磷酸酯键，将冈崎片段连接起来，形成完整的DNA长链。 （2）连接冈崎片段5 5 5 RNA酶酶OH P5 DNA-pol dNTP5 5 PATP ADP+Pi5 5 DNA连接酶连接酶 随从链上不连续性片段的连接随从链上不连续性片段的连接拓扑异构酶拓扑异构酶拓扑异构酶拓扑异构酶将两个子代将两个子代DNA环分离环分离 为了保证遗传的稳定，DNA的复制必须具有高保真性。DNA复制时的保真性主要与下列因素有关： 1遵守严格的碱基配对规律； 2DNA聚合酶在复制时对碱基的正确选择； 3对复制过程中出现的错误及时进行校正。 DNA复制的保真性(f

22、idelity)：DNA-pol的核酸外切酶活性和及时校读A：DNA-pol的外切酶活性切除错配碱基；并用其聚合酶活性掺入正确配对的底物。B：碱基配对正确， DNA-pol不表现外切酶活性。（四）真核生物DNA 复制l真核细胞染色体DNA 分子为线性的。比原核细胞DNA 分子大，复制更为复杂。l为多复制子复制（多起点双向复制），在全部染色体复制完成前，各复制子不能再开始新一轮复制。l 真核生物DNA复制起始复合物的组装和激活分属于不同的细胞周期。 端粒（telomere）是指真核生物染色体线性DNA分子末端的结构部分，通常膨大成粒状。l真核生物端粒的形成：在DNA 复制的同时另外还要组装成核小

23、体。功能功能 维持染色体的稳定性维持染色体的稳定性 保证保证DNA复制的完整性复制的完整性端粒的结构特点端粒的结构特点 由末端单链由末端单链DNA序列和蛋白质构成。序列和蛋白质构成。 末端末端DNA序列是多次重复的富含序列是多次重复的富含G、T碱基碱基的短的短 序列。序列。TTTTGGGGTTTTGGGG 线性DNA在复制完成后，其末端由于引物RNA的水解而可能出现缩短。故需要在端粒酶（telomerase）的催化下，进行延长反应。5 3 3 5 5 3 3 5 端粒酶(telomerase)端粒酶是一种端粒酶是一种RNA-蛋白质复合体，它可蛋白质复合体，它可以其以其RNA为模板，通为模板，通

24、过逆转录过程对末端过逆转录过程对末端DNA链进行延长。链进行延长。端粒酶的分子结构端粒酶的分子结构返回返回 端粒酶RNA (human telomerase RNA, hTR) 端粒酶协同蛋白(human telomerase associated protein 1, hTP1) 端粒酶逆转录酶(human telomerase reverse transcriptase, hTRT) 端粒酶的组成返回返回端粒酶的爬行模型（动画演示）端粒酶端粒酶(telomerase)的作用机制的作用机制爬行模型爬行模型返回返回二、逆转录二、逆转录 以RNA 为模板，由RNA 指导的DNA 聚合酶（逆转录E

25、）催化，合成DNA 的过程。返回返回逆转录病毒和逆转录酶逆转录病毒细胞内的逆转录现象：逆转录病毒细胞内的逆转录现象：RNA 模板模板逆转录酶逆转录酶DNA-RNA 杂杂化双链化双链RNA酶酶单链单链DNA逆转录酶逆转录酶双链双链DNA1、逆转录酶的性质寡聚E兼具有三种酶的活力: RNA 指导的DNA 聚合E活力 DNA 指导的DNA 聚合酶活力 RNaseH（核糖核酸酶H）活力 RNaseH：53和35外切酶活力，可除去DNA、RNA 杂交分子中的RNA。2、逆转录病毒逆转录过程 RNA（+）RNA（+）/cDNA（-）DNA（+）/cDNA（-）RNA（+）3、逆转录的生物学意义 逆转录过程

26、的发现，扩充了中心法则。 它有助于人们对RNA 病毒致癌机制的了解，并对防治肿瘤提供了重要线索。 逆转录酶已成为分子生物学和基因工程中常用的一种工具酶，利用它可以从mRNA 合成相应的cDNA，在基因结构研究、氨基酸序列预测以及基因工程中具有十分重要的意义。三、 DNA的损伤和修复1、DNA的损伤 X射线、紫外线照射DNA，引起损伤。如形成胸腺嘧啶二聚体。嘧啶二聚体的形成嘧啶二聚体的形成 UV（二） DNA损伤的修复DNA损伤修复(repair) ：是对已发生分子改变的补偿措施，使其尽可能回复为原有的天然状态。光修复光修复(light repair)切除修复切除修复(excision repa

27、ir)重组修复重组修复(recombination repair)SOS修复修复 修复的主要类型：修复的主要类型：无差错修复无差错修复有差错倾向修复有差错倾向修复1、直接修复（光修复） 可见光（400500nm ）激活光裂合酶，将嘧啶二聚体分开，恢复成单独的嘧啶碱基，对单细胞生物比较重要，高等哺乳动物无光裂合酶。 修复过程由光裂合酶(photolyase)催化完成。光光裂合酶的酶的分子结构分子结构光光直接修复直接修复 这也是一种广泛存在的修复机制，可适用于多种DNA损伤的修复。 切除修复机制的基本过程是将受损的DNA片段切除，然后再以对侧链为模板，重新合成新链进行修复。2、切除修复（复制前修复

28、）（1） 切断：专一性的内切酶在靠近二聚体处切断单链DNA。（2） 修复合成：DNA 聚合酶在断口处进行局部修复合成。（3） 切除：5核酸外切酶切去嘧啶二聚体片段。（4） 连接：连接酶将新合成的DNA 链与原来的DNA 链连在一起。切除修复3、重组修复（动画）当DNA损伤广泛难以继续复制时，由此而诱发出一系列复杂的反应。在E. coli中，各种与修复有关的基因，组成一个称为调节子(regulon)的网络式调控系统。这种修复特异性低，对碱基的识别、选择能力差。通过SOS修复，复制如能继续，细胞是可存活的。然而DNA保留的错误较多，导致较广泛、长期的突变。 4、SOS修复（SOS Repair）： 由自发的或环境的因素引起DNA一级结构的任何异常的改变称为DNA的损伤，也称为突变（mutation）。 常见的DNA的损伤包括碱基脱落、碱基修饰、交联，链的断裂，重组等。 突变的意义（一）突变是进化、分化的分子基础（二）突变导致基因型改变（三）突变导致死亡（四）突变是某些疾病的发病基础突变的分子改变类型突变的分子改变类型 转转换换相相同同类类型型碱碱基基的的取取代代。 颠颠换换不不同同类类型型碱碱基基的的取取代代。 点点突突变变 插插入入增增加加