海洋氮循环微生物研究进展

1、海洋氮循环细菌研究进展王晓姗 刘杰* 青岛科技大学生物工程与技术系，青岛 266042摘要：氮素循环是海洋生态系统中物质循环的重要组成局部，其中微生物起着至关重要的推动作用，相关内容一直为国际研究的热点。本文在简述氮循环各环节概念的根底上，着重对海洋生物固氮、硝化、反硝化细菌等方面研究进行了综述，并对今后的研究方向进行了一些展望。关键词：海洋氮循环；固氮细菌；硝化细菌；反硝化细菌Research Progress in Marine Nitrogen Cycling bacteriaWANG Xiaoshan LIU Jie*(Qingdao University of Science and

2、 Technology, Department of Biological Engineering and Technology, 266042)Abstract: Nitrogen cycle in marine ecosystems is an important part of material cycles, in which some microorganisms play a vital role in promoting it. Researches about nitrogen cycle in ocean are still a focus point now. In thi

3、s paper, some research progresses about microorganisms of marine nitrogen fixation, nitrification, denitrification were reviewed , and meanwhile, some research perspectives about nitrogen cycle were put forward.Key words: Marine nitrogen cycle; Nitrogen-fixing bacteria; Nitrite-oxidizing bacteria; D

4、enitrobacteria在整个生物地球化学物质循环当中，各类微生物是碳、氮、硫、磷等元素循环的关键促进者。其中仅氮素循环中的微生物作用就涉及到生物固氮、铵化、脱氨、硝化、反硝化等8个环节，理论研究与实际应用极为重要。在当今人们全面向海洋研究进军的同时，我们仍然对海洋中参与氮素循环的微生物种类及其作用机制缺乏了解。从目前国际对海洋氮循环微生物研究情况来看，大多集中在固氮、硝化、反硝化细菌方面。1、海洋氮循环的过程与作用氮素循环是整个生物圈物质与能量循环的关键组成，也是海洋生态系统物质循环的重要组成局部，对维持海洋生态平衡和修复意义重大1。该循环是一个涉及生物、物理、化学等多种要素的复杂的多相

5、生物地球化学过程，其中以微生物所推动的氮素循环过程主要包括：固氮作用、氨化作用、硝化及反硝化作用等。固氮作用是指固氮原核微生物将大气中的氮气转化为可直接被生物体利用有效氮的过程，是海洋氮素的主要来源，在整个氮素循环中最为重要；氨化作用是某些微生物将有机氮化物被分解生成氨或铵的过程，是海洋再生生产力的重要物质根底；硝化作用是指亚硝化细菌和硝化细菌将氨态氮氧化成亚硝酸盐或硝酸盐的过程；反硝化作用也称脱氮作用是由反硝化细菌复原硝酸盐或亚硝酸盐并释放N2O、NO或N2的过程，是海洋固定氮素重返大气层的主要环节。基金工程： 科技部国家科技根底条件平台建设工程No.2005DKA21209第一作者简介：王

6、晓姗1984-，女，硕士研究生。研究方向：海洋环境微生物。E-mail: kiki0222163 * 通讯 刘杰，硕士生导师。 E-mail: jieliu206yahoo 早在20世纪60年代，Menzel等人2就曾对百慕大马尾藻海域氮循环的年变化进行过初步研究。自20世纪80年代起，人们将海洋资源的可持续开发与利用作为资源与环境科学的主要开展战略之一3，同时国际上也将海洋氮、磷等营养元素的生物地球化学循环列为研究重点4,5。近几十年来，伴随着海洋生态与环境问题的日益突出，人们对氮循环各环节在海洋物质循环、生态平衡、环境污染、新生产力估算等方面的重要作用愈加重视,并开展了广泛的研究615。国

7、内研究者也相继在近海各类海域进行了相关的研究3, 1622。2、生物固氮与海洋固氮细菌 在整个海洋生态系统中，生物固氮是海洋氮素的主要来源，也是限制海洋水生生物群落生长的重要因子。因其可利用性影响到海洋CO2的吸收与平衡23,24，所以生物固氮作用的强弱不仅可以预测海洋初级生产力水平的上下25，同时也可作为寻求寡营养盐环境中维持海洋生物高生产力水平的途径24；另外，固氮微生物也是海洋生态环境变化的重要指示生物26。尽管全球生物固氮研究已有一百多年的历史，但直至20世纪80年代，随着对固氮微生物资源、固氮生态学、以及固氮机理等研究的不断深入，人们才逐渐发现，海洋、湖泊等水环境中的固氮微生物对生态

8、系统群落结构的演替、营养元素的循环以及全球气候的变化均有重要影响27。 与陆地固氮微生物类似，海洋中能够固氮的也均为原核微生物(Procaryotes)，包括蓝细菌类又称藻类、光合细菌类和异养细菌类表1。对海洋固氮微生物群落的研究说明，不同海洋环境中的固氮细菌具有十分丰富的多样性，固氮方式也多种多样27,28,29。表1 海洋固氮细菌主要类群Tab.1 The main group of marine nitrogen-fixing bacteria蓝细菌类光合细菌类异养固氮细菌类TrichodesmiumRhodospirillumAzotobacterOscillatoriaChromat

9、iumClostridiumPelagothrixChromatiumEnterobacterKatagnymeneBeggiatoaFlavobacteriumCyanotheceBacillusMicrocystisVibrioSynechococcusDesulfovibrioSynechocystisPseudomonasKlebsiella从固氮蓝细菌来看，目前约有30余种，其中属于浮游性蓝藻的束毛藻属(Trichodesmium)是海洋中分布最广、固氮量最大的一类海洋蓝细菌。该属中的薛氏束毛藻(T. thiebautii)和红海束毛藻(T. erythraeum)已证实为海洋生物固

10、氮的主要奉献者30,31。美国等国家在对形成赤潮的浮游蓝藻进行卫星遥感监测的同时，也对其它新发现的海洋固氮蓝细菌从分子生物学和遗传多样性等方面进行了研究23,32,33；Jonathan等34曾以nifH基因序列分析为根底，对海洋中已发现的主要固氮细菌类群进行过聚类比拟分析，同时做出了蓝细菌类群、-protebacteria 类群和-protebacteria类群的 nifH系统发育进化树； Zehr等35的研究发现，许多固氮蓝细菌在亚热带的北太平洋海域具有活泼的固氮酶基因nifH表达活性。这种新固氮蓝细菌的发现以及特定海域大量固氮基因活泼表达，意味着传统的海洋生物固氮观念、群体调控及模型结构

11、等理论有待需要重新评价23。海洋中非产氧固氮光合细菌类，如红螺菌科(Rhodospirillaceae )、着色菌科(Chromatiaceae )等，它们中的一些种主要是与其它生物进行联合固氮作用。目前对这类固氮细菌研究报道的还比拟少，有些分类地位尚不确定。然而其中某些种类不仅可以固氮，而且在海洋中的生物量巨大，同时也可以利用铵盐或具有同化、异化复原硝酸盐和亚硝酸盐的能力，因此推断它们在海洋氮循环中的奉献不容低估27。海洋中异养固氮细菌类包括好氧、微需氧、兼性厌氧和专性厌氧型，如：固氮菌属(Azotobacter)、梭菌属(Clostridium)、产气肠杆菌属(Enterobacter)、

12、黄杆菌属(Flavobacterium)、芽胞杆菌属(Bacillus)、弧菌属(Vibrio)、脱硫弧菌属(Desulfovibrio)、假单胞菌属(Pseudomonas)、克氏杆菌属(Klebstella)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)等属中的一些种，它们主要是进行自生或联合固氮作用。这些异养型固氮细菌在某些联合、附生固氮体系中占有重要地位，例如：南非Beachwood红树林海榄雌(Avicennia marina)根际存在大量异养固氮细菌与蓝绿藻形成联合固氮体系36；温带海洋海草植物大叶藻(Zostera sp.)根际中也存在具有联合固氮优势的大量硫复原细菌 37；在珊瑚礁生态

13、系统中，既有珊瑚和固氮细菌属的附着固氮作用，也存在藻类与异养固氮细菌的附生或联合固氮作用38。目前具有明显固氮能力的海洋弧菌为Vibrio diazotrophicus 和Vibrio natriegens；然而Shien W等39的研究说明, 至少还有其它三、四种尚未被命名的海洋固氮弧菌不仅在近海水域及沉积物中广泛存在，而且也能从某些海洋无脊椎动物的体表、体内以及海草根圈中找到，因而推测它们可能是海洋生态系中数量最多、分布最广的异养性固氮微生物类群。另外，还有学者在海洋桡足类动物中发现有固氮酶基因表达40,41的现象。3、氨化作用与海洋氨化细菌氨化作用是指某些微生物分解含氮有机物并将其矿化为

14、氨的过程，是海洋生物尤其是深海生物获取氮源的另一条途径42。这类微生物种类较多，其中以细菌氨化细菌最为活泼，广泛分布在于各类水生环境中43。海洋中氨化细菌主要分布于弧菌属(Vibrio)、梭菌属(Clostridium)、变形杆菌属(Proteus)、沙雷氏菌属(Serratia)、假单胞菌属(Pseudomonas)、芽孢杆菌属(Bacillus)等中。4、硝化作用与海洋硝化细菌从微生物角度，硝化作用是由亚硝化细菌和硝化细菌两个生理群连续作用完成的，前者将氨态氮转化为亚硝酸，后者将亚硝酸氧化为硝酸。海洋中的硝化作用在整个氮循环中是不可缺少的一环，但硝化作用所产生亚硝酸盐或硝酸盐的过度积累，却

15、是导致海水富营养化、诱发赤潮、破环海洋生态平衡的主要原因之一44。硝化细菌两个生理菌群均属于化能自养型，其中多数种类是以氨或亚硝酸盐为能源的专性好氧化能自养菌，其代时长，生长慢，在整个硝化过程极易受溶解氧、温度、盐度、光照等外界因素的影响45,46。但也有许多研究发现，特定海洋环境中存在异养硝化细菌47和厌氧氨氧化细菌48, 49, 50 从系统发育角度，硝化细菌两生理群分属于Proteobacteria的、和 4个亚类51。表2表2 海洋硝化、亚硝化细菌主要类群Tab.2 The main group of marine nitrate , nitrite bacteria-Proteoba

16、cteria-Proteobacteria-Proteobacteria-Proteobacteria亚硝化细菌NitrosospiraNitrosococcusNitrosovibrioNitrosolobusNitrosomonas硝化细菌NitrobacterNitrococcusNitrospina其中亚硝化球菌属(Nitrosococcus)的代表种为海洋亚硝化球菌(Nitrosococcus oceani)和嗜盐亚硝化球菌(Nitrosococcus haolphilus)；亚硝化螺菌属(Nitrosospira)、亚硝化弧菌属(Nitrosovibrio)、亚硝化叶菌属(Nitr

17、osolobus)和亚硝化单胞菌属(Nitrosomonas)的代表种分别为：南极亚硝化螺菌(Nitrosospira brieusis)、纤细亚硝酸弧菌(Nitrosovibrio tenuis)、多形亚硝化叶菌(Nitrosolobus multiformis)和欧洲亚硝化单胞菌(Nitrosomonas europaea)。其中亚硝化叶菌属、亚硝化弧菌属和亚硝化螺菌属因具有很高的16S rRNA基因序列同源性，现已归为亚硝化螺菌属52。另外，海洋亚硝化球菌Nitrosococcus oceani已完成全基因组测序53。硝酸细菌包括：硝化杆菌属(Nitrobacter)、硝化球菌属(Nit

18、rococcus)和硝化刺菌属(Nitrospina)，它们分属于Proteobacteria的、和亚类，代表种分别为：维氏硝化杆菌(Nitrobacter winogradskyi)、纤细硝化刺菌(Nitrospina gracilis)、活动硝化球菌(Nitrococcus mobils)。现已证明海洋中与好氧硝化作用两个步骤有关的主要细菌分别是亚硝化单胞菌属(Nitrosomonas)、亚硝化球菌属(Nitrosococcus)和硝化杆菌属(Nitrobacter)54。另外，对海洋硝化细菌群体的研究说明，其群落具有较低多样性和稳定性。例如：Mills等55采用T-RFLP、SSU rR

19、NA基因、硝化功能基因amoA分析等方法，对墨西哥东北海湾浅海区海洋沉积物中的硝化和反硝化细菌群落特征进行了研究，结果说明：硝化细菌的多样性较低，且均为的硝化细菌菌株；Hunter等56采用SSU rRNA基因、nosZ和amoA基因序列平行分析法，在对南大西洋海湾大陆架沉积物中碳循环和氮循环相关微生物群落多样性研究中发现，硝化细菌群落的多样性和稳定性均相对较低。5、反硝化作用与海洋反硝化细菌反硝化作用是海洋氮循环中的一个重要生物过程, 是固定氮素重返大气层的主要环节，故在整个氮循环中占有重要地位。海洋反硝化过程受到温度、盐度、pH、营养盐、碳氮比等许多环境因素的影响与制约22,57,58。反

20、硝化作用的实质是硝酸盐的生物复原过程，它包括同化性的硝酸盐复原作用将NO3一或NO2复原为NH4+和异化性硝酸盐复原作用将NO3一或NO2复原为NO、N2O和N2。我们常说的反硝化作用主要是指异化性反硝化作用，其过程为：NO3NO2NON2ON2四步，分别由硝酸复原酶(nitrate reductase)、亚硝酸复原酶(nitrite reductase)、氧化氮复原酶(nitric oxide reductase)和氧化亚氮复原酶(nitrous oxide reductase)进行催化59，其中由亚硝酸盐转化为氧化氮的过程是有别于其他硝酸盐代谢的标志性反响。在海洋环境中，反硝化作用一方面减

21、少了初级生产者的可利用氮，另一方面可减轻因硝态氮过多所造成的海水富营养化程度及对生物的毒害作用60，因此倍受重视。海洋等水环境中的反硝化细菌种类繁多，但在分类学上却没有专门的类群61，主要包括节杆菌属(Arthrobacter)、无色杆菌属(Achromobacter)、不动杆菌属(Acinetobacter)、产碱杆菌属(Alcaligenes)、芽孢杆菌属(Bacillus)、短芽孢杆菌属(Brevibacillus)、纤维微杆菌属(Cellulosimicrobium)、色杆菌属(Chromobacterium)、盐单胞菌属(Halomonas)、盐芽孢杆菌属(Halobacillus)

22、、微球菌属(Micrococcus)、微杆菌属(Microbacterium)、螺旋菌属(Spirillum)、海单胞菌属(Oceanimonas)、副球菌属(Paracoccus)、动性球菌属(Planococcus)、动性杆菌属(Planomicrobium)、寡养单胞菌属(Stenotrophomonas)、假单胞菌属(Pseudomonas)以及鞘氨醇杆菌属(Sphingobacterium)等属中的一些种。其中最普遍存在的是Bacillus和Pseudomonas属。其他反硝化菌属的出现频率相对较低，只在某些特殊环境中崭居优势62。反硝化细菌在生理特性上也具有多样性，包括异养型和自养

23、型63,64，其中Rhodopseudomona sphaeroides是目前唯一被确认具有反硝化能力的光合细菌。反硝化过去曾被认为只有在厌氧或缺氧条件下才能实现，但近几十年来好氧反硝化作用的发现不断被报道，且已筛选出一些好氧反硝化细菌65,66。20世纪80年代，Robertson等67曾报道过好氧反硝化细菌和反硝化酶系的存在，并证实泛养硫球菌Thiosphaera pantotropha 现更名为脱氮副球菌Paracoccus denitrifications68)为好氧反硝化菌。现今，越来越多的研究说明细菌好氧反硝化作用的存在，并发现了一些在有氧条件下具有较高反硝化速率的细菌，如产碱菌属

24、(Alcaligenes)69、克雷伯菌属(Klebsiella)70、丛毛单胞菌属(Comamonas)71、假单胞菌属(Pseudomonas)72、苍白杆菌属(Ochrobactrum)73、红球菌属(Rhodococcus)74、嗜冷杆菌属(Psychrobacter)和动胶菌属(Zoogloea)73。另外，已发现兼有固氮和脱氮能力的反硝化菌株普遍存在于Rhodobacter、Hyphomicrobium、Azoarcus和Psedumonas等属中75。目前，有关反硝化细菌分子生态学研究主要集中在反硝化酶系统及其基因方面。编码四种反硝化酶的关键基因分别是nar、nir、nor和no

25、s76，其中研究和应用较多的是亚硝酸复原酶基因nirK和nirS，常被选做分子探针和引物设计的模板用于海底沉积物反硝化微生物体系与种群结构的分析77,78。近年来，以反硝化酶基因为根底的分子生态学方法研究海洋反硝化细菌种群丰度、组成与分布的报道比拟多，例如：Santoro等79曾研究了加利福尼亚州亨廷顿海滩含水层内的反硝化微生物类群，通过对nirK和nirS基因的测序分析发现，在不同盐度和不同硝酸盐浓度的采样点，反硝化细菌的多样性十分丰富，且存在一些新的反硝化细菌类群；Brettar等80采用SSCP法对波罗的海中心水域以硫化物为电子供体自养反硝化进行了分析，并获得了与自养反硝化菌Thiomi

26、crospira denitrificans在遗传和生理上具有一定近缘关系的-proteobacteria菌群，推测该菌群与波罗的海中心水域的碳储量密切相关；Rosch等81采用T-RFLP法对反硝化和固氮细菌群落特征进行了分析评估，通过16S rRNA基因，nifH和nosZ基因分析了环境中细菌的种群结构，研究说明环境中不可培养反硝化和固氮细菌可能发挥着比人们预想中更为主要的作用；Flores-Mireles等82在对墨西哥Balandra湾红树林根际固氮和反硝化细菌的nifH、nirS和nirK三个基因分子特征研究中发现，它们与菌株或其他环境中菌株相似度较高，其中以nifH基因的多样性最高

27、。Liu Xueduan等77研究了墨西哥太平洋沿岸缺氧区反硝化微生物群落的组成和结构，通过对nirS和nirK基因的序列分析，发现有26的细菌nirS基因与粪产碱杆菌和铜绿假单胞菌的nirS基因相似性较高，有3到31细菌的nirK基因与假单胞菌G-179菌株、Bradyrhizobium japonicum、Blastobacter denitrificans和Alcaligenes xylosoxidans的nirK基因高度相似。 6、展望鉴于氮循环细菌在海洋物质循环、生态平衡、环境污染与修复等中的重要性及研究现状，作者认为今后应在以下几个方面开展深入研究：1特征海域氮循环有关细菌丰度、群

28、体与遗传多样性和优势类群的研究。2海洋氮循环各环节微生物之间的关系及影响因素的研究。3加强对异养硝化细菌和好氧反硝化细菌的理论与应用研究。4氮循环细菌研究方法的进一步优化。参考文献：1Carpenter E J，Capone D G. Nitrogen in the Marine Environment M. New York:Academic Press ,1983. 900.2Menzel D W，Rther J H. The annual cycle of primary production in the Sargasso Sea off Bermuda. Deep-Sea Resea

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