生物分离工程 第4章-细胞的破碎-

1、第四章第四章细胞的破碎细胞的破碎2生物分离过程的一般流程生物分离过程的一般流程原料液原料液预处理和固液分离预处理和固液分离细胞胞内产物细胞胞内产物路线一路线一路线二路线二细胞破碎细胞破碎碎片分离碎片分离路线一路线一A A路线一路线一B B清液胞外产物清液胞外产物粗分离粗分离( (盐析、萃取、超过滤等盐析、萃取、超过滤等) )纯化纯化( (层析、电泳层析、电泳) )脱盐脱盐( (凝胶过滤、超过滤凝胶过滤、超过滤) )浓缩浓缩( (超过滤超过滤) )精制精制( (结晶、干燥结晶、干燥) )包含体包含体溶解溶解( (加盐酸胍、脲加盐酸胍、脲) )复性复性3常见的细胞壁结构细胞破碎技术本章的主要内容4

2、概述概述不同类型细胞生产目标产物的类型：不同类型细胞生产目标产物的类型：l动物细胞多分泌到动物细胞多分泌到细胞外细胞外培养液培养液l植物细胞多为植物细胞多为胞内胞内产物产物l微生物（细菌微生物（细菌/酵母酵母/霉菌等）霉菌等）胞内、胞外胞内、胞外 5概述概述(大多数情况下，大多数情况下，抗生素，胞外酶，一些多糖，抗生素，胞外酶，一些多糖，及氨基酸及氨基酸等目标产物存在于发酵液中。等目标产物存在于发酵液中。(有些目标产物存在于生物体中。有些目标产物存在于生物体中。l尤其是由尤其是由基因工程菌基因工程菌产生的大多数蛋白质是产生的大多数蛋白质是在细胞内沉积。在细胞内沉积。l脂类物质脂类物质和一些和一

3、些抗生素抗生素包含在生物体中。包含在生物体中。对于胞内产物需要收集菌体或细胞进行破碎。对于胞内产物需要收集菌体或细胞进行破碎。6酶酶来源来源应用范围应用范围L-天冬酰氨酶天冬酰氨酶Eruinia CaratovoraEscherichia Coli治疗急性淋巴癌治疗急性淋巴癌过氧化氢酶过氧化氢酶Aspergillus niger牛奶灭菌后牛奶灭菌后H2O2的清除的清除胆固醇氧化酶胆固醇氧化酶Nocardia hodochrous胆固醇浆液分析胆固醇浆液分析-半乳糖苷酶半乳糖苷酶Kluyveromyces fragilisSaccharomyces lactis在牛奶在牛奶/乳清中乳糖的水解乳清

4、中乳糖的水解作用作用葡萄糖氧化酶葡萄糖氧化酶Aspergillus nigerPenicilluim notatum葡萄糖浆液分析葡萄糖浆液分析食品中氧的清除食品中氧的清除葡萄糖葡萄糖-6-磷酸脱氢酶磷酸脱氢酶Yeast临床分析临床分析蔗糖酶蔗糖酶Saccharomyces Cerevisiae糖果、蜜饯糖果、蜜饯青霉素酰化酶青霉素酰化酶Escherichia Coli苄青霉素的脱酰作用苄青霉素的脱酰作用表表1 胞内酶举例胞内酶举例细胞破碎的必要性7药物名药物名宿主宿主用途用途胰岛素胰岛素大肠杆菌大肠杆菌治疗糖尿病治疗糖尿病人生长激素（人生长激素（HGH）大肠杆菌大肠杆菌治疗侏儒病治疗侏儒病-

5、干扰素干扰素大肠杆菌大肠杆菌治疗毛状细胞白血治疗毛状细胞白血病和卡波济肉瘤病和卡波济肉瘤表表2 几种由大肠杆菌表达的胞内重组药物几种由大肠杆菌表达的胞内重组药物8n细胞破碎细胞破碎（cell disruptioncell disruption）技术是指利用技术是指利用外力外力破坏细破坏细胞膜和细胞壁，使细胞内容物包括目的产物成分释放出来胞膜和细胞壁，使细胞内容物包括目的产物成分释放出来的技术。的技术。n细胞破碎技术是分离纯化细胞内合成的细胞破碎技术是分离纯化细胞内合成的非分泌型非分泌型生化物质生化物质（产品）的基础。（产品）的基础。n随着随着重组重组DNADNA技术和组织培养技术技术和组织培养

6、技术上的重大进展，以前认上的重大进展，以前认为很难获得的蛋白质现在可以大规模生产。为很难获得的蛋白质现在可以大规模生产。n为了研究细胞的破碎，提高其破碎率，有必要了解各种微为了研究细胞的破碎，提高其破碎率，有必要了解各种微生物细胞壁的组成和结构。生物细胞壁的组成和结构。9Z微生物细胞和植物细胞外层均为细胞壁，细胞微生物细胞和植物细胞外层均为细胞壁，细胞壁里面是细胞膜，动物细胞没有细胞壁，仅有壁里面是细胞膜，动物细胞没有细胞壁，仅有细胞膜。细胞膜。Z通常细胞壁较坚韧，细胞膜脆弱，易受渗透压通常细胞壁较坚韧，细胞膜脆弱，易受渗透压冲击而破碎，因此冲击而破碎，因此细胞破碎的阻力主要来自于细胞破碎的阻

7、力主要来自于细胞壁。细胞壁。Z不同细胞壁的结构和组成不完全相同，故细胞不同细胞壁的结构和组成不完全相同，故细胞壁的机械强度不同，细胞破碎的难易程度也就壁的机械强度不同，细胞破碎的难易程度也就不同。不同。第一节第一节 细胞壁的组成与结构细胞壁的组成与结构10细胞壁的组成与结构微生物微生物革兰氏阳性革兰氏阳性细菌细菌革兰氏阴性革兰氏阴性细菌细菌酵母菌酵母菌霉菌霉菌壁厚壁厚/nm20801013100300100250层次层次单层单层多层多层多层多层多层多层主要组成主要组成肽聚糖肽聚糖（4090）、）、多糖、胞壁多糖、胞壁酸、蛋白质、酸、蛋白质、脂多糖（脂多糖（14）肽聚糖（肽聚糖（510）脂蛋白、

8、脂蛋白、脂脂多糖多糖（1122）磷脂、蛋白磷脂、蛋白质质葡聚糖葡聚糖（3040）甘露聚糖甘露聚糖（30）、）、蛋白质（蛋白质（68）、）、脂类（脂类（8.513.5）多聚糖多聚糖（8090）脂类、蛋白质脂类、蛋白质11细菌细胞壁结构细菌细胞壁结构Z 几乎所有细菌的细胞壁都是几乎所有细菌的细胞壁都是由由肽聚糖肽聚糖组成，它是难溶性组成，它是难溶性的聚糖链；的聚糖链；Z 相邻聚糖链上的短肽又交叉相邻聚糖链上的短肽又交叉相联，构成了细胞壁的三维相联，构成了细胞壁的三维网状结构，网状结构，包围在细胞周围；包围在细胞周围；Z 使细胞具有一定的形状和强使细胞具有一定的形状和强度。度。12细菌细胞壁结构细菌

9、细胞壁结构u破碎细菌的主要阻力是来自于破碎细菌的主要阻力是来自于肽聚糖的网状结构，肽聚糖的网状结构，其网结构的致密程度和强度取决于聚糖链上所存其网结构的致密程度和强度取决于聚糖链上所存在的肽键的数量和其交联的程度。在的肽键的数量和其交联的程度。网状结构越致网状结构越致密，破碎的难度越大。密，破碎的难度越大。u革兰氏阴性菌的细胞壁结构与革兰氏阳性菌有很革兰氏阴性菌的细胞壁结构与革兰氏阳性菌有很大不同。大不同。革兰氏阴性细菌网状结构不及革兰氏阳革兰氏阴性细菌网状结构不及革兰氏阳性细菌的坚固。性细菌的坚固。u革兰氏阴性菌典型的生物是革兰氏阴性菌典型的生物是大肠杆菌大肠杆菌，通过这种，通过这种细胞生产

10、了很多细胞重组的产物。细胞生产了很多细胞重组的产物。13 图图1 革兰氏菌细胞壁结构图革兰氏菌细胞壁结构图 （a）革兰氏阳性菌）革兰氏阳性菌 （b）革兰氏阴性菌）革兰氏阴性菌14 酵母的细胞壁结构酵母的细胞壁结构u最里层是由最里层是由葡聚糖葡聚糖的细纤维组成，它构成了的细纤维组成，它构成了细胞壁的刚性骨架，使细胞具有一定的形状；细胞壁的刚性骨架，使细胞具有一定的形状；u上面的是一层上面的是一层糖蛋白糖蛋白；u最外层是最外层是甘露聚糖甘露聚糖，由，由1,61,6- -磷酸二酯键连接磷酸二酯键连接成网状。在该层的内部，有甘露聚糖成网状。在该层的内部，有甘露聚糖- -酶的复酶的复合物。合物。u破碎酵

11、母细胞壁的阻力主要决定于壁结构交破碎酵母细胞壁的阻力主要决定于壁结构交联的紧密程度和它的厚度。联的紧密程度和它的厚度。15 图图2 酵母细胞壁的结构示意图酵母细胞壁的结构示意图M甘露聚糖；甘露聚糖； P磷酸二酯键；磷酸二酯键； G葡聚糖葡聚糖16霉菌的细胞壁霉菌的细胞壁l霉菌的霉菌的细胞壁较厚细胞壁较厚，主要由，主要由多糖多糖组成，其次还组成，其次还含有较少量的蛋白质和脂类。含有较少量的蛋白质和脂类。l不同的霉菌，细胞壁的组成有很大的不同，其不同的霉菌，细胞壁的组成有很大的不同，其中大多数霉菌的多糖壁是由几丁质和葡聚糖构中大多数霉菌的多糖壁是由几丁质和葡聚糖构成，少数含纤维素。成，少数含纤维素

12、。l与酵母和细菌的细胞壁一样，与酵母和细菌的细胞壁一样，霉菌细胞壁的强霉菌细胞壁的强度和聚合物的网状结构有关度和聚合物的网状结构有关，不仅如此，它，不仅如此，它还还含有几丁质或纤维素的纤维状结构，所以强度含有几丁质或纤维素的纤维状结构，所以强度有所提高。有所提高。17l红面包霉菌红面包霉菌细胞壁具有同心圆层细胞壁具有同心圆层状结构主要存在三种聚合物状结构主要存在三种聚合物l最外层最外层(a)(a)是是- -和和- -葡聚糖的葡聚糖的混合物，混合物，l第第2 2层层(b)(b)是糖蛋白的网状结构是糖蛋白的网状结构l第第3 3层层(c)(c)主要是蛋白质，主要是蛋白质，l最内层最内层(d)(d)主

13、要是几丁质。主要是几丁质。红面包霉菌细胞壁的结构示意图红面包霉菌细胞壁的结构示意图18 微生物细胞壁的形状、强度取决于细胞壁的微生物细胞壁的形状、强度取决于细胞壁的组成组成以及它们之间相互以及它们之间相互关联的程度关联的程度。 内因：连接细胞壁网状结构的共价键。内因：连接细胞壁网状结构的共价键。 外因：各类微生物的遗传信息、培养条件、外因：各类微生物的遗传信息、培养条件、菌龄、外界环境等。菌龄、外界环境等。19植物细胞壁的结构植物细胞壁的结构l对于已生长结束的植物细胞壁可分为对于已生长结束的植物细胞壁可分为初生壁和次生初生壁和次生壁两部分。壁两部分。l初生壁初生壁是细胞生长期形成的。初生壁一般

14、是细胞生长期形成的。初生壁一般较薄较薄（1 13m3m），富有弹性。），富有弹性。l初生壁初生壁由多糖和蛋白质构成，多糖主要成分为纤维由多糖和蛋白质构成，多糖主要成分为纤维素、半纤维素和果胶类物质。纤维素是长链素、半纤维素和果胶类物质。纤维素是长链D-D-葡聚葡聚糖，许多这样的长链形成微纤丝。糖，许多这样的长链形成微纤丝。l它是构成细胞壁的骨架，它是构成细胞壁的骨架，细胞壁的机械强度主要来细胞壁的机械强度主要来自于微纤丝。自于微纤丝。20植物次生细胞壁植物次生细胞壁 某些植物细胞，当生长停止后，在细胞质和初生某些植物细胞，当生长停止后，在细胞质和初生细胞壁之间形成了次生细胞壁。次生壁一般较厚细

15、胞壁之间形成了次生细胞壁。次生壁一般较厚(4(4mm以上以上) )，常有三层组成。，常有三层组成。n在次生壁中，纤维素和半纤维素含量比初生壁增在次生壁中，纤维素和半纤维素含量比初生壁增加很多，纤维素的微纤丝排列得更紧密和有规则，加很多，纤维素的微纤丝排列得更紧密和有规则，而且存在木质素的沉积。而且存在木质素的沉积。 因此因此次生壁的形成提高了细胞壁的坚硬性，次生壁的形成提高了细胞壁的坚硬性，使植物细胞具有很高的机械强度。使植物细胞具有很高的机械强度。21n不同种类的细胞结构差别很大，破碎的不同种类的细胞结构差别很大，破碎的难易程度也不同，由难到易的大致排列难易程度也不同，由难到易的大致排列顺序

16、为：顺序为：植物细胞真菌（如酵母菌）植物细胞真菌（如酵母菌）革兰氏阳性细菌革兰氏阴性细菌革兰氏阳性细菌革兰氏阴性细菌动物细胞。动物细胞。22第二节第二节 细胞破碎技术细胞破碎技术n目的：目的：释放细胞内含物释放细胞内含物。n分类：分类：按照是否存在外加作用力按照是否存在外加作用力分为机械法和非机械法。分为机械法和非机械法。 问题：问题： 破碎率是否越高越好？破碎率是否越高越好？以大肠杆菌为以大肠杆菌为宿主的药物多宿主的药物多为胞内产物为胞内产物23研研 磨磨24机械破碎机械破碎捣碎法研磨法匀浆法超声法 物理破碎物理破碎温度差破碎法压力差破碎法化学破碎化学破碎有机溶剂：表面活性剂：酸碱酶促破碎酶

17、促破碎自溶法外加酶制剂法通过机械运动产生的剪切通过机械运动产生的剪切力，使组织、细胞破碎。力，使组织、细胞破碎。通过各种物理因素的作用，通过各种物理因素的作用，使组织、细胞的外层结构破使组织、细胞的外层结构破坏，而使细胞破碎。坏，而使细胞破碎。通过各种化学试剂对细胞通过各种化学试剂对细胞膜的作用，而使细胞破碎膜的作用，而使细胞破碎通过细胞本身的酶系或外通过细胞本身的酶系或外加酶制剂的催化作用，使加酶制剂的催化作用，使细胞外层结构受到破坏，细胞外层结构受到破坏，而达到细胞破碎而达到细胞破碎细胞破碎方法分类细胞破碎方法分类25细胞破碎方法原理细胞破碎方法原理分分 类类作作 用用 机机 理理适适 应

18、应 性性机机械械法法珠磨法珠磨法固体剪切作用固体剪切作用可达可达较高破碎率较高破碎率，可较大规模操作可较大规模操作，大分，大分子目的产物子目的产物易失活易失活，浆液分离困难浆液分离困难高压匀浆法高压匀浆法液体剪切作用液体剪切作用可达可达较高破碎率较高破碎率，可大规模操作可大规模操作，不适合，不适合丝状菌和革兰氏阳性菌丝状菌和革兰氏阳性菌超声破碎法超声破碎法液体剪切作用液体剪切作用对酵母菌效果较差，破碎过程升温剧烈，对酵母菌效果较差，破碎过程升温剧烈，不适合大规模操作不适合大规模操作X-pressX-press法法固体剪切作用固体剪切作用破碎率高，活性保留率高，对冷冻敏感目破碎率高，活性保留率高

19、，对冷冻敏感目的产物不适合的产物不适合非非机机械械法法酶溶法酶溶法酶分解作用酶分解作用具有高度专一性，条件温和，浆液易分离，具有高度专一性，条件温和，浆液易分离，溶酶价格高，通用性差溶酶价格高，通用性差化学渗透法化学渗透法改变细胞膜的渗透性改变细胞膜的渗透性具一定选择性，浆液易分离，但释放率较具一定选择性，浆液易分离，但释放率较低，低，通用性差通用性差渗透压法渗透压法渗透压剧烈改变渗透压剧烈改变破碎率较低破碎率较低，常与其他方法结合使用，常与其他方法结合使用冻结融化法冻结融化法反复冻结反复冻结- -融化融化破碎率较低破碎率较低，不适合对冷冻敏感目的产物，不适合对冷冻敏感目的产物干燥法干燥法改变

20、细胞膜渗透性改变细胞膜渗透性条件变化剧烈，条件变化剧烈，易引起大分子物质失活易引起大分子物质失活26其他新的细胞破碎方法：其他新的细胞破碎方法： 激光破碎法激光破碎法 冷冻冷冻-喷射法喷射法 高速相向流撞击法高速相向流撞击法27细胞细胞声波声波搅拌搅拌液压液压冷冻压力冷冻压力动物细胞动物细胞7777革兰氏阴性芽孢杆菌和球革兰氏阴性芽孢杆菌和球菌菌6566革兰氏阳性芽孢杆菌革兰氏阳性芽孢杆菌5(4)54酵母酵母3.5342.5革兰氏阳性球菌革兰氏阳性球菌3.5(2)32.5孢子孢子2(1)21菌丝菌丝16(1)5表表3 细胞对破碎的敏感度细胞对破碎的敏感度注：上述数字表示相对敏感度，括号则表示数

21、字不确切。注：上述数字表示相对敏感度，括号则表示数字不确切。28细胞破碎机理图细胞破碎机理图29一机械法机械破碎法又可分为机械破碎法又可分为高压匀浆破碎法（高压匀浆破碎法（homogenizationhomogenization）高速珠研磨破碎法（高速珠研磨破碎法（bead grindingbead grinding）超声波破碎法（超声波破碎法（ultrasonicationultrasonication）30采用采用高压匀浆器高压匀浆器（由（由高压泵和匀浆阀高压泵和匀浆阀组成）。组成）。1.高压匀浆法高压匀浆法（High-pressure homogenization）细胞悬浮液自高压室针细

22、胞悬浮液自高压室针形阀喷出时，形阀喷出时，每秒速度每秒速度高达几百米高达几百米，高速喷出，高速喷出的浆液又射到静止的撞的浆液又射到静止的撞击环上，被迫改变方向击环上，被迫改变方向从出口管流出。细胞在从出口管流出。细胞在这一系列高速运动过程这一系列高速运动过程中经历了中经历了高速剪切、碰高速剪切、碰撞及压力骤降，造成细撞及压力骤降，造成细胞破碎。胞破碎。31高压匀浆阀结构示意图高压匀浆阀结构示意图进液口进液口出液口出液口阀座阀座碰撞环碰撞环阀杆阀杆高压匀浆器高压匀浆器32高压匀浆器高压匀浆器3334大、中、小型高压匀浆器大、中、小型高压匀浆器35高压匀浆器的种类高压匀浆器的种类高压匀浆器的种类较

23、多高压匀浆器的种类较多：pWABWAB公司的公司的AVP GaulinAVP Gaulin 31MR 31MR型型pBran and luebbeBran and luebbe 公司公司SHL40SHL40型型p意大利意大利Niro SoaviNiro Soavi高压匀浆机高压匀浆机36高压匀浆法使用时注意事项高压匀浆法使用时注意事项u高压匀浆器的操作温度上升约高压匀浆器的操作温度上升约- -/10MPa/10MPa为了为了控制温度的升高，可在进口处用控制温度的升高，可在进口处用干冰调节干冰调节温度，使出口温度调节在温度，使出口温度调节在2020左右。左右。u可以采用可以采用单次单次通过匀浆器

24、或通过匀浆器或多次多次循环通过等方循环通过等方式。式。u在工业规模的细胞破碎中，对于酵母等在工业规模的细胞破碎中，对于酵母等难破碎难破碎的及的及浓度高浓度高或处于或处于生长静止期生长静止期的细胞，常采用的细胞，常采用多次循环多次循环的操作方法。的操作方法。37高压匀浆法适用的范围高压匀浆法适用的范围是大规模细胞破碎的常用方法是大规模细胞破碎的常用方法高压匀浆法适用的范围：高压匀浆法适用的范围：酵母和大多数细菌细胞的破碎；酵母和大多数细菌细胞的破碎；料液细胞浓度可以很高，料液细胞浓度可以很高，20%20%左右。左右。不宜使用高压匀浆法的情况不宜使用高压匀浆法的情况：易造成堵塞的易造成堵塞的团状或

25、丝状真菌团状或丝状真菌，较小较小的革兰氏的革兰氏阳性菌阳性菌，含有含有包含体包含体的基因工程菌（因包含体坚硬，易损伤匀浆的基因工程菌（因包含体坚硬，易损伤匀浆阀）阀）38影响高压匀浆器细胞破碎因素影响高压匀浆器细胞破碎因素被破碎的细胞分率符合如下公式：被破碎的细胞分率符合如下公式： ln1/(1-R)=KNPln1/(1-R)=KNP (15-1) (15-1) 式中式中 R R 破碎率，为破碎率，为NN次循环后，蛋白次循环后，蛋白质的释放量质的释放量RnRn与最大释放量与最大释放量RmRm之比；之比； K K 与温度有关的速度常数；与温度有关的速度常数； P P 操作压力，操作压力，MPaM

26、Pa； 与微生物种类有关的常数。与微生物种类有关的常数。39影响破碎的主要因素压力压力温度温度 有研究表明，当悬浮液中酵母浓度在有研究表明，当悬浮液中酵母浓度在450-450-750kg/m750kg/m3 3时，时，温度温度由由30300 0C C提高到提高到50500 0C C，破碎率，破碎率约提高约提高1.51.5倍。倍。通过均浆器阀的次数通过均浆器阀的次数 40图图7细胞浓度及压力大小对破碎率的影响细胞浓度及压力大小对破碎率的影响 匀浆次数匀浆次数图图8 匀浆次数对破碎效果的影响匀浆次数对破碎效果的影响 41l升高压力升高压力有利于破碎有利于破碎减少细胞的循环次数，甚至一次通过匀浆阀就

27、可达到几减少细胞的循环次数，甚至一次通过匀浆阀就可达到几乎完全的破碎，这样就乎完全的破碎，这样就可避免细胞碎片不至过小可避免细胞碎片不至过小。但但p p大到一定值时对匀浆器的磨损增加，也有实验表明大到一定值时对匀浆器的磨损增加，也有实验表明p p超生一定值时，超生一定值时，R R增加但很慢。增加但很慢。在工业生产中，通常采用的压力为在工业生产中，通常采用的压力为555570Mpa70Mpa。l破碎性能还随破碎性能还随菌体种类菌体种类和和生长环境生长环境的不同而不同的不同而不同大肠杆菌的细胞比酵母细胞容易大肠杆菌的细胞比酵母细胞容易破碎；破碎；生长在简单的合成培养基上的大肠杆菌生长在简单的合成培

28、养基上的大肠杆菌比生长在复杂培养基比生长在复杂培养基上容易破碎。上容易破碎。影响高压匀浆器细胞破碎因素影响高压匀浆器细胞破碎因素42X-Press挤压机挤压机l改进的高压方法：将浓缩的菌体悬液冷却至改进的高压方法：将浓缩的菌体悬液冷却至- -2525至至-30-30形成形成冰晶体冰晶体，利用，利用500MPa500MPa以上的以上的高压冲击高压冲击，冷冻细胞从高压阀小孔中挤出。，冷冻细胞从高压阀小孔中挤出。l细胞破碎是由于冰晶体在受压时的相变，包埋细胞破碎是由于冰晶体在受压时的相变，包埋在冰中的细胞变形所引起的。在冰中的细胞变形所引起的。l主要用于实验室中主要用于实验室中。l优点是适用的范围广

29、，破碎率高，细胞碎片的优点是适用的范围广，破碎率高，细胞碎片的粉碎程度低以及活性的保留率高。粉碎程度低以及活性的保留率高。l对冷冻对冷冻- -融解敏感的生化物质不适用。融解敏感的生化物质不适用。43X-Press挤压机挤压机442. 珠磨法 bead millu珠磨是常用的方法u细胞悬浮液与极细的玻璃小细胞悬浮液与极细的玻璃小珠、石英砂、氧化铝等珠、石英砂、氧化铝等研磨研磨剂剂（直径小于（直径小于1mm1mm）一起快速）一起快速搅拌或研磨，研磨剂、珠子搅拌或研磨，研磨剂、珠子与细胞之间的互相剪切、碰与细胞之间的互相剪切、碰撞，使细胞破碎，释放出内撞，使细胞破碎，释放出内含物。含物。u在工业规模

30、的破碎中，常采在工业规模的破碎中，常采用高速珠磨机用高速珠磨机WSK卧式高效全能珠磨机45高速珠磨机工作原理l磨室内放置玻璃小珠，装在同心轴上的园盘搅拌器磨室内放置玻璃小珠，装在同心轴上的园盘搅拌器高速旋转，使细胞悬浮液和玻离小珠相互搅动；高速旋转，使细胞悬浮液和玻离小珠相互搅动；l细胞破碎是由细胞破碎是由剪切力层之间的碰撞和磨料滚动剪切力层之间的碰撞和磨料滚动引起引起l在出口处，旋转园盘和出口平板之间的狭缝很小，在出口处，旋转园盘和出口平板之间的狭缝很小，可阻挡玻离小珠，使不被料液带出。可阻挡玻离小珠，使不被料液带出。l由于操作过程中会产生热量，故磨室还装有由于操作过程中会产生热量，故磨室还

31、装有冷却夹冷却夹套，以冷却细胞悬浮液和玻离小珠。套，以冷却细胞悬浮液和玻离小珠。但在大型设备但在大型设备中，采用夹套冷却带走热量是一个需要考虑的问题中，采用夹套冷却带走热量是一个需要考虑的问题。46高速珠磨机高速珠磨机47Netzsch LM-20型珠磨机A-具有冷却夹套的圆筒形磨室B-具有冷却装置的搅拌轴和圆盘C-环形震动侠缝分离器D-变速马达1和2料液进出口3和4 搅拌冷却剂进出口5和6磨室冷却剂进出口l园盘以两种位置交错地安装在轴上，l一种处于径向，一种与轴倾斜，l径向盘使磨料沿径向运动，倾斜盘则产生轴向运动。l由于交错的运动，提高了破碎效率。48珠磨机破碎作用方程u破碎作用是相对于时间

32、的一级反应速度过程，破碎作用是相对于时间的一级反应速度过程，符合下列公式：符合下列公式： ln1/(1-R)=Kt 15-2ln1/(1-R)=Kt 15-2 uR R 破碎率；破碎率；K K一一 一级反应速度常数；一级反应速度常数；t t一一 时间。时间。uK K与搅拌与搅拌转速转速、细胞悬浮液、细胞悬浮液浓度浓度和循环和循环速度速度、玻璃小珠、玻璃小珠装量装量和珠体和珠体直径直径，以及，以及温度温度等相关。等相关。49 破碎的速率和效率与操作参数有关如：破碎的速率和效率与操作参数有关如：珠体的大小珠体的大小、珠体的装量珠体的装量、细胞浓度细胞浓度、操操作温度作温度、料液性质、搅拌器转速与构

33、型等。、料液性质、搅拌器转速与构型等。 此外，与搅拌器的设计和研磨腔的结此外，与搅拌器的设计和研磨腔的结构也有关系，如转盘外缘速度等。构也有关系，如转盘外缘速度等。50 一般来说，一般来说，磨珠越小，细胞破碎速度越磨珠越小，细胞破碎速度越快，但太小易于漂浮，并难以保留在研磨快，但太小易于漂浮，并难以保留在研磨机的腔体中机的腔体中。通常实验室规模，。通常实验室规模，珠体直径珠体直径为为0.2mm0.2mm较好，工业规模不得小于较好，工业规模不得小于0.4mm0.4mm。 不同的不同的细胞类别细胞类别及所需提取的酶在细及所需提取的酶在细胞中的胞中的位置位置等也是应考虑的因素。等也是应考虑的因素。5

34、1 有研究表明，减小有研究表明，减小磨珠直径磨珠直径起先会起先会提高卡乐酵母蛋白质的释放速度，但磨提高卡乐酵母蛋白质的释放速度，但磨珠再小一些，蛋白质的释放速度反而稍珠再小一些，蛋白质的释放速度反而稍有下降。有下降。 egeg. .从酵母细胞中提取从酵母细胞中提取D-D-葡萄糖葡萄糖-6-6-磷酸脱氢酶，最好使用磷酸脱氢酶，最好使用0.55-0.85mm0.55-0.85mm大小大小的玻璃珠，而在提取的玻璃珠，而在提取-D-D-葡萄糖苷酶时，葡萄糖苷酶时，则最好使用较大尺寸（如则最好使用较大尺寸（如1mm1mm直径）磨珠。直径）磨珠。52 在一定范围内，增加珠体装填量可以提在一定范围内，增加珠

35、体装填量可以提高细胞破碎率高细胞破碎率。但超过某一限度时，反不。但超过某一限度时，反不利于细胞破碎和蛋白质的释放。利于细胞破碎和蛋白质的释放。 为消除这种影响，必须提高搅拌器的功为消除这种影响，必须提高搅拌器的功率，这样又会增大释放的热量，给破碎带率，这样又会增大释放的热量，给破碎带来困难。来困难。 一般研磨机腔体内的填充密度控制在一般研磨机腔体内的填充密度控制在80%-90%80%-90%，并随珠体大小变化。，并随珠体大小变化。53 细胞浓度细胞浓度对悬浮液的流变特性具有影响，对悬浮液的流变特性具有影响，最佳的细胞浓度应用实验来确定。一般用最佳的细胞浓度应用实验来确定。一般用NetzschN

36、etzsch LM20 LM20研磨机破碎时，细胞浓度控制研磨机破碎时，细胞浓度控制在在40%40%左右。左右。54 Currie Currie等人的研究表明，等人的研究表明，操作温度控制操作温度控制在在5-405-400 0C C范围内对破碎物的影响较小。范围内对破碎物的影响较小。 常采用常采用冷却夹套冷却夹套和和搅拌轴搅拌轴的方式来调节的方式来调节磨室的温度。磨室的温度。n采用夹套冷却的方式实现温控采用夹套冷却的方式实现温控, ,效果较好效果较好; ;n能耗与细胞破碎率成正比能耗与细胞破碎率成正比; ;55 珠磨法的破碎率一般控制在珠磨法的破碎率一般控制在80%以下以下,原因：原因：降低能

37、耗、减少大分子目的产物的降低能耗、减少大分子目的产物的失活、减少由于高破碎率产生的细胞小碎失活、减少由于高破碎率产生的细胞小碎片不易分离而给后续操作带来的困难。片不易分离而给后续操作带来的困难。56n实验室规模的细胞破碎设备有实验室规模的细胞破碎设备有Mickle高速高速组织捣碎机、组织捣碎机、 Braun匀浆器。匀浆器。n中试规模的细胞破碎可采用胶质磨处理。中试规模的细胞破碎可采用胶质磨处理。n在工业规模中，可采用高速珠磨机（瑞士在工业规模中，可采用高速珠磨机（瑞士WAB公司和德国西门子机械公司制造）。公司和德国西门子机械公司制造）。57几种常见珠磨器几种常见珠磨器5859胶体磨胶体磨德国进

38、口珠磨机德国进口珠磨机60高压匀浆法与高速珠磨法的比较高压匀浆法与高速珠磨法的比较项目项目高压匀浆法高压匀浆法高速珠磨法高速珠磨法操作参数操作参数少少多，液体损耗大多，液体损耗大连续操作时连续操作时配备热换器进行级配备热换器进行级间冷却间冷却兼具破碎和冷却，兼具破碎和冷却，减少产物失活减少产物失活达到较高破碎率达到较高破碎率需循环需循环2-42-4次次一次操作一次操作适用范围适用范围团状、丝状真菌、团状、丝状真菌、较小革兰阳性菌不较小革兰阳性菌不宜，宜，包含体不宜包含体不宜几乎所有几乎所有的微生物的微生物细胞，包括含有包细胞，包括含有包含体的基因工程菌含体的基因工程菌的破壁的破壁613. 超声

39、波破碎l超声波破碎法（超声波破碎法（UltrasonicationUltrasonication) )利用超声波利用超声波振荡器发射的振荡器发射的15-25kHz15-25kHz的超声波探头处理细胞的超声波探头处理细胞悬浮液。悬浮液。l超声波振荡器以可分为超声波振荡器以可分为槽式和探头槽式和探头直接插入介直接插入介质两种型式，一般破碎效果后者比前者好。质两种型式，一般破碎效果后者比前者好。l超声波的细胞破碎效率与细胞种类、浓度和超超声波的细胞破碎效率与细胞种类、浓度和超声波的声频、声能有关。声波的声频、声能有关。62超声波破碎的机理JY92-II D超声波超声波细胞粉碎机细胞粉碎机(一般认为在

40、超声波作用下液体发生一般认为在超声波作用下液体发生空化作用空化作用（cavitationcavitation),),(液体中液体中局部空穴局部空穴的形成、增大和闭合产生极大的形成、增大和闭合产生极大的冲击波和剪切力，引起的粘滞性旋涡在细胞的冲击波和剪切力，引起的粘滞性旋涡在细胞上造成了剪切力，使细胞内液体发生流动，从上造成了剪切力，使细胞内液体发生流动，从而使细胞破碎。而使细胞破碎。(操作过程操作过程产生大量的热产生大量的热，因此操作需在，因此操作需在冰水冰水或或外部冷却的容器中进行。外部冷却的容器中进行。63n空化现象空化现象：在强声波作用下，引在强声波作用下，引起气泡形成，胀大和破碎的现象

41、。起气泡形成，胀大和破碎的现象。锡箔纸测试空化强度与空化密度锡箔纸测试空化强度与空化密度看得到的空化现象看得到的空化现象64 振幅振幅 细胞悬浮液的黏度细胞悬浮液的黏度 表面张力表面张力 被处理悬浮液的体积被处理悬浮液的体积 珠粒的体积和直径珠粒的体积和直径 探头的形状和材料探头的形状和材料 细胞悬浮液的流速细胞悬浮液的流速影响参数影响参数65超声波破碎的适用范围超声波破碎是超声波破碎是很强烈很强烈的破碎方法，适用于多数的破碎方法，适用于多数微生物的破碎。微生物的破碎。一般一般杆菌杆菌比球菌易破碎，比球菌易破碎，G-G-细菌细菌比比G+G+细菌易破细菌易破碎，对酵母菌的效果较差。碎，对酵母菌的

42、效果较差。优点：优点：操作简便，液量损失少。操作简便，液量损失少。缺点：缺点：超声波产生的化学自由基团能使某些敏超声波产生的化学自由基团能使某些敏感性活性物质感性活性物质失活失活；大容量时能量利用率极低；大容量时能量利用率极低；噪声大；噪声大；对冷却的要求相当苛刻对冷却的要求相当苛刻，所以，所以不易放不易放大，但大，但。66图图10 USB600型微电脑控制超声波细胞粉碎机型微电脑控制超声波细胞粉碎机图图9 超声波细胞破碎仪的结构示意图超声波细胞破碎仪的结构示意图67技术技术原理原理效果效果 成本成本举例举例匀浆法匀浆法(孔型孔型)须使细胞通过的小须使细胞通过的小孔，使细胞受到剪孔，使细胞受到

43、剪切力而破碎切力而破碎剧烈剧烈 适中适中细胞悬浮液细胞悬浮液大规模大规模处理处理珠磨破碎珠磨破碎法法细胞被玻璃珠或铁细胞被玻璃珠或铁珠捣碎珠捣碎剧烈剧烈 便宜便宜细胞悬浮液和植物细胞悬浮液和植物细胞的细胞的大规模大规模处理处理超声波法超声波法用超声波的空穴作用超声波的空穴作用使细胞破碎用使细胞破碎适中适中 昂贵昂贵细胞悬浮液细胞悬浮液小规模小规模处理处理研磨法研磨法细胞被研磨物磨碎细胞被研磨物磨碎适中适中 便宜便宜匀浆法匀浆法(片型片型)细胞被搅拌器劈碎细胞被搅拌器劈碎适中适中 适中适中动物组织及动物细动物组织及动物细胞胞不同机械破碎方法的比较68二、非机械破碎方法二、非机械破碎方法酶溶破碎法

44、（酶溶破碎法（enzyme lysisenzyme lysis）化学破碎法（化学破碎法（chemical treatmentchemical treatment）去垢剂破碎法（去垢剂破碎法（detergentsdetergents）渗透压冲击破碎法（渗透压冲击破碎法（osmotic shockosmotic shock）冻融破碎法（冻融破碎法（freezing and thawingfreezing and thawing）69非机械方法很多1 酶解2 化学法溶胞3 物理法n渗透压冲击n冻结和融化n干燥法其中酶法和化学法溶胞酶法和化学法溶胞应用最广。二70 1 酶解（酶溶法 Enymatic

45、lysis)酶解是利用溶解细胞壁的酶处理菌体细胞，使细胞壁受到破坏后，再利用渗透压冲击等方法破坏细胞膜。1）外加酶法常用的溶酶常用的溶酶溶菌酶、溶菌酶、-1，3-葡聚糖酶、葡聚糖酶、-1，6-葡聚糖酶、葡聚糖酶、蛋白酶、蛋白酶、甘露糖酶、甘露糖酶、糖苷酶、糖苷酶、肽键内切酶、肽键内切酶、壳多糖酶等壳多糖酶等71外加酶法n酶解法的特点是酶解法的特点是专一性强专一性强，因此在选择酶系统时，必，因此在选择酶系统时，必须根据细胞的结构和化学组成来选择。须根据细胞的结构和化学组成来选择。l溶菌酶溶菌酶（lysozymelysozyme) )能专一性地分解细胞壁上能专一性地分解细胞壁上肽聚糖肽聚糖分分子的

46、子的-1,4-1,4糖苷键，因此主要用于糖苷键，因此主要用于细菌细菌类细胞壁的裂类细胞壁的裂解。革兰氏阳性菌悬浮液中加入溶菌酶，很快就产生解。革兰氏阳性菌悬浮液中加入溶菌酶，很快就产生溶壁现象。但对于溶壁现象。但对于革兰氏阴性菌，单独采用溶菌酶无革兰氏阴性菌，单独采用溶菌酶无效果，必须与螯合剂效果，必须与螯合剂EDTAEDTA一起使用一起使用。l放线菌放线菌的细胞壁结构类似于革兰氏阳性菌，以肽聚糖的细胞壁结构类似于革兰氏阳性菌，以肽聚糖为主要成分，所以也能采用溶菌酶，为主要成分，所以也能采用溶菌酶，l酵母和霉菌酵母和霉菌由于细胞壁的组分主要是纤维素、葡聚糖、由于细胞壁的组分主要是纤维素、葡聚糖

47、、几丁质等，常用几丁质等，常用蜗牛酶、纤维素酶、多糖酶蜗牛酶、纤维素酶、多糖酶等。等。l植物植物细胞壁的主要成分是纤维素，常采用纤维素酶和细胞壁的主要成分是纤维素，常采用纤维素酶和半纤维素酶裂解。半纤维素酶裂解。72外加酶法有时采用几种有时采用几种酶的混合物酶的混合物会产生更好的效果，加会产生更好的效果，加入时需确定相应的次序。入时需确定相应的次序。 对酵母细胞采用酶法破碎时，先加入对酵母细胞采用酶法破碎时，先加入蛋白酶蛋白酶作作用蛋白质用蛋白质- -甘露聚糖结构，使二者溶解，再加入甘露聚糖结构，使二者溶解，再加入葡聚糖酶葡聚糖酶作用裸露的葡聚糖层，最后只剩下原生作用裸露的葡聚糖层，最后只剩下

48、原生质体，这时若缓冲液的渗透压变化，则细胞膜破质体，这时若缓冲液的渗透压变化，则细胞膜破裂，释出胞内产物。裂，释出胞内产物。73蜗牛酶蜗牛酶-从蜗牛的嗦囊和消化道中制备的从蜗牛的嗦囊和消化道中制备的混合酶，含有纤维素酶、果胶酶、淀粉混合酶，含有纤维素酶、果胶酶、淀粉酶、蛋白酶等酶、蛋白酶等20多种。多种。74酶解法的特点 优点：u发生酶解的条件温和u能选择性地释放产物u胞内核酸等泄出量少，细胞外形较完整缺点：缺点：溶酶价格高；溶酶价格高；溶酶法通用性差（不同菌种需选择不同的酶溶酶法通用性差（不同菌种需选择不同的酶) )产物抑制的存在（甘露糖对蛋白酶有抑制作用，产物抑制的存在（甘露糖对蛋白酶有抑

49、制作用，葡聚糖抑制葡聚糖酶。葡聚糖抑制葡聚糖酶。 ）。）。 75酶解-自溶作用 l 自溶作用是酶解的另一种方法，自溶作用是酶解的另一种方法，利用生物体自利用生物体自身产生的酶来溶胞，而不需外加其他的酶身产生的酶来溶胞，而不需外加其他的酶。l在微生物代谢过程中，大多数都能产生一种能在微生物代谢过程中，大多数都能产生一种能水解细胞壁上聚合物的酶，以便生长过程继续水解细胞壁上聚合物的酶，以便生长过程继续下去。下去。l自溶作用：改变其生长环境（温度、缓自溶作用：改变其生长环境（温度、缓冲液），可以诱发产生过剩的这种酶或激发产冲液），可以诱发产生过剩的这种酶或激发产生其它的自溶酶，以达到自溶目的。生其它

50、的自溶酶，以达到自溶目的。l缺点是：易引起所需蛋白质的变性，自溶后细缺点是：易引起所需蛋白质的变性，自溶后细胞悬浮液粘度增大，过滤速度下降。胞悬浮液粘度增大，过滤速度下降。76egeg. .谷氨酸生产菌（如乳糖发酵短杆菌）谷氨酸生产菌（如乳糖发酵短杆菌） 加入加入pH10pH10的缓冲液（的缓冲液（0.028mol/LNa0.028mol/LNa2 2COCO3 3 0.018mol/LNaHCO 0.018mol/LNaHCO3 3 ），配），配3%3%的细胞悬浮液，的细胞悬浮液，加热至加热至70700 0C C，保温搅拌，保温搅拌20min20min，菌体即自溶菌体即自溶。77某些化学试剂

51、，如有机溶剂、变性剂、表面活性剂、某些化学试剂，如有机溶剂、变性剂、表面活性剂、抗生素、金属螯合剂等，可以改变细胞壁或膜的通透抗生素、金属螯合剂等，可以改变细胞壁或膜的通透性（渗透性），从而使胞内物质有选择地渗透出来。性（渗透性），从而使胞内物质有选择地渗透出来。2 化学渗透法化学渗透法（Chemical permeation）该法取决于化学试剂的类型以及细胞壁膜的结构与组成。该法取决于化学试剂的类型以及细胞壁膜的结构与组成。 78n酸酸处理可以使蛋白质水解成氨基酸，通常采用6mol/L HCl。n碱碱能溶解细胞壁上脂类物质或使某些组分从细胞内渗漏出来。成本低，反应激烈，不具选择性成本低，反应

52、激烈，不具选择性。（1）酸、碱处理法）酸、碱处理法79细胞破碎常用的表面活性剂：细胞破碎常用的表面活性剂：十二烷基硫酸钠（十二烷基硫酸钠（SDSSDS，阴离子型）；。，阴离子型）；。非离子型如非离子型如Triton X-100Triton X-100和吐温（和吐温（TweenTween）等）等对疏水性物质具有很强的亲和力，能结合并溶解对疏水性物质具有很强的亲和力，能结合并溶解磷脂磷脂，破坏，破坏内膜的磷脂双分子层，使某些胞内物质释放出来。内膜的磷脂双分子层，使某些胞内物质释放出来。（2 2）表面活性剂）表面活性剂无论表面活性剂是阴离子、阳离子还是非离子型，无论表面活性剂是阴离子、阳离子还是非离

53、子型，都是都是两性两性的，既能和水作用也能和脂作用，的，既能和水作用也能和脂作用，能与细胞壁上的能与细胞壁上的脂蛋白脂蛋白结合，形成微泡，使膜的通结合，形成微泡，使膜的通透性增加或溶解透性增加或溶解80能分解细胞壁中的能分解细胞壁中的磷脂磷脂，使细胞结构破坏，胞内物，使细胞结构破坏，胞内物质被释放出来。质被释放出来。有机溶剂可采用丁酯、丁醇、丙酮、氯仿和有机溶剂可采用丁酯、丁醇、丙酮、氯仿和甲苯甲苯等等 （3 3）有机溶剂）有机溶剂（4 4）EDTAEDTA螯合剂螯合剂处理处理G-G-细菌细菌，对细胞壁外层有破坏作用。，对细胞壁外层有破坏作用。G-G-细菌的壁外层结构通常靠二价阳离子细菌的壁外

54、层结构通常靠二价阳离子CaCa2+2+或或MgMg2+2+结合脂多糖结合脂多糖和蛋白质来维持，一旦和蛋白质来维持，一旦EDTAEDTA将将CaCa2+2+或或MgMg2+2+螯合，大量的脂多糖螯合，大量的脂多糖分子将脱落，使细胞壁外层膜出现洞穴。分子将脱落，使细胞壁外层膜出现洞穴。81（5 5）变性剂）变性剂盐酸胍（盐酸胍（Guanidine hydrochlorideGuanidine hydrochloride）和脲）和脲（UreaUrea）是常用的变性剂。）是常用的变性剂。变性剂可以削弱溶质分子间的疏水作用，从而使变性剂可以削弱溶质分子间的疏水作用，从而使疏水性化合物溶于水溶液。疏水性化

55、合物溶于水溶液。82（6）温和化学渗透剂温和化学渗透剂 p温和化学渗透剂一般是采用甘氨酸、丙氨酸温和化学渗透剂一般是采用甘氨酸、丙氨酸等分子量较小的等分子量较小的非极性基氨基酸非极性基氨基酸。p其破碎机理可能是因为小分子的甘氨酸、丙其破碎机理可能是因为小分子的甘氨酸、丙氨酸更易渗透到氨酸更易渗透到细胞壁细胞壁中中, ,通过氢键、范德华通过氢键、范德华引力、静电引力等化学亲和力改变细胞壁结引力、静电引力等化学亲和力改变细胞壁结构构, ,从而改变细胞壁和细胞膜的通透性。从而改变细胞壁和细胞膜的通透性。 83u通用性差；通用性差；u时间长，效率低，一般胞内物质释放率不超过时间长，效率低，一般胞内物质

56、释放率不超过50%50%；u有些化学试剂有毒。有些化学试剂有毒。u化学试剂的加入常会给随后产物的纯化带来困难，化学试剂的加入常会给随后产物的纯化带来困难， 并影响最终产物纯度并影响最终产物纯度化学渗透法特点：化学渗透法特点：缺点缺点l对产物释放有一定的选择性对产物释放有一定的选择性，可使一些较小分子，可使一些较小分子量的溶质如多肽和小分子的酶蛋白透过，而核酸等量的溶质如多肽和小分子的酶蛋白透过，而核酸等大分子量的物质仍滞留在胞内；大分子量的物质仍滞留在胞内；l细胞外形完整，碎片少，利于进一步提取；细胞外形完整，碎片少，利于进一步提取；l核酸释放少，浆液粘度低核酸释放少，浆液粘度低，易于固液分离

57、。，易于固液分离。优点优点84细胞类别细胞类别变性变性剂剂清洁剂清洁剂有机溶有机溶剂剂酶酶 抗抗 生素生素生物试生物试剂剂鳌和剂鳌和剂革兰氏阴革兰氏阴性菌性菌*革兰氏阳革兰氏阳性菌性菌*酵母菌酵母菌*植物细胞植物细胞*巨噬细胞巨噬细胞*表表4 不同细胞可采用的化学渗透处理方式不同细胞可采用的化学渗透处理方式表示适用853 3 物理法物理法u渗透压冲击法渗透压冲击法u冻结冻结-融化法融化法u干燥法干燥法u微波加热法微波加热法861）渗透压冲击法 渗透压冲击是较温和的一种破碎方法将细胞放在将细胞放在高渗透压高渗透压的溶液中（如一定浓度的甘油或的溶液中（如一定浓度的甘油或蔗糖溶液），由于渗透压的作用

58、，细胞内水分便向外蔗糖溶液），由于渗透压的作用，细胞内水分便向外渗出，细胞发生收缩，当达到平衡后，将介质快速稀渗出，细胞发生收缩，当达到平衡后，将介质快速稀释，或将细胞转入水或缓冲液中，由于渗透压的突然释，或将细胞转入水或缓冲液中，由于渗透压的突然变化，胞外的水迅速渗入胞内，引起细胞快速膨胀而变化，胞外的水迅速渗入胞内，引起细胞快速膨胀而破裂。破裂。 仅适用于细胞壁较脆弱的细胞或细胞壁预先用酶处理仅适用于细胞壁较脆弱的细胞或细胞壁预先用酶处理或在培养过程中加入某些抑制剂（如抗生素等），使或在培养过程中加入某些抑制剂（如抗生素等），使细胞壁有缺陷，强度减弱。细胞壁有缺陷，强度减弱。87 2）冻结

59、-融化法 将细胞放在低温下冷冻（约将细胞放在低温下冷冻（约-15-15），然后在室温中），然后在室温中融化，反复多次而达到破壁作用。融化，反复多次而达到破壁作用。 一方面能使细胞膜的疏水键结构破裂，从而增加细胞一方面能使细胞膜的疏水键结构破裂，从而增加细胞的亲水性能，的亲水性能， 另一方面胞内水结晶，形成冰晶粒，引起细胞膨胀而另一方面胞内水结晶，形成冰晶粒，引起细胞膨胀而破裂。破裂。 适用于细胞壁较脆弱的菌体，破碎率较低，需反复多适用于细胞壁较脆弱的菌体，破碎率较低，需反复多次，此外，在冻融过程中可能引起某些蛋白质变性。次，此外，在冻融过程中可能引起某些蛋白质变性。 88使细胞结合水分丧失，从

60、而改变细胞的渗透性。当采用丙酮、使细胞结合水分丧失，从而改变细胞的渗透性。当采用丙酮、丁醇或缓冲液等对干燥细胞进行处理时，胞内物质就容易被抽丁醇或缓冲液等对干燥细胞进行处理时，胞内物质就容易被抽提出来。提出来。气流干燥主要适用于酵母菌，一般在气流干燥主要适用于酵母菌，一般在25-3025-30的气流中吹干；的气流中吹干；真空干燥多用于细菌。真空干燥多用于细菌。冷冻干燥适用于不稳定的生化物质冷冻干燥适用于不稳定的生化物质3 3）干燥法）干燥法气流干燥气流干燥真空干燥真空干燥喷雾干燥喷雾干燥冷冻干燥冷冻干燥894 4）微波加热法）微波加热法n机理机理：微波加热导致细胞内微波加热导致细胞内极极性物质