生物药物的提取纯化技术

1、第七章 生物药物的提取纯化技术 n第一节 概 述 n第二节 预处理及固液分离技术 n第三节 沉 淀 n第四节 萃取(Extraction) n第五节 吸附(Sorption) n第六节 亲和层析n第七节 新型层析分离纯化装置及介质 生物药物的稳定性受pH、温度、离子强度、提取过程所使用的溶剂和表面活性剂、金属离子等方面的影响，生物药物对剪切力也很敏感，分子量越大，稳定性就越差。因此，在分离纯化过程中，条件应当越温和。许多生物药物组分的浓度非常低，但生物药物产品的纯度却要求很高，含量要达到95甚至98以上，最好是结晶态产品。另外，生物药物还应具有正常的颜色、稳定性和溶解速率。第一节第一节 概概

2、述述一一. . 生物药物的特点生物药物的特点 生物药物的提取和纯化可分为5个主要步骤：预处理、固液分离、浓缩、纯化和产品定型(干燥，制丸，挤压，造粒，制片)。每一步骤都可采用各种单元操作。在提取纯化过程中，要尽可能减少操作步骤，因为每一操作步骤都不可避免带来损失。生物药物提取工艺流程的基本模式如图7-1所示。 二、提取纯化的单元操作和基本工艺流程二、提取纯化的单元操作和基本工艺流程根据主要分离因素排列的单元操作分离范围见表7-1。 分离纯化技术的特点之一是各种技术相互交叉，新型的分离纯化方法不断涌现。如沉淀技术和亲和技术相结合，形成了亲和沉淀技术；超滤和亲和技术相结合，形成了亲和超滤技术；萃取

3、与载体膜相结合，形成了液膜载体萃取法。这些新方法取长补短，使分离纯化过程更加科学合理、快速有效、经济实用。三、提取纯化单元操作技术的特点三、提取纯化单元操作技术的特点 生物药物提取纯化技术的另一特点是注重新材料的研制开发，如膜分离介质，层析介质，亲和配基，新型萃取剂等在最近几十年来发展非常快。提取纯化设备方面推陈出新，在设备的计算机控制及生产自动化、连续化及GMP规范化等方面取得了很大的成就。 膜过滤技术发展很快，分为微滤、超滤和纳滤，不仅用于细胞的分离，还用于蛋白质的浓缩。超滤技术的主要特点是节能，对生物大分子类药物无破坏作用。液-液萃取广泛应用于抗生素及小分子量药物的提取。溶剂选择的余地大

4、，且易实现大规模生产。高速离心式液体萃取机是目前效率最高，使用最广的装置。液-液萃取技术还衍生出许多新的萃取技术，如双水相萃取，亲和萃取，超临界萃取等。双水相萃取蛋白质类药物是大规模提取高纯度蛋白质类药物的有效技术。而超临界萃取利用超临界流体的物理特性，即通过压力和温度的改变控制溶质在溶剂中的分子扩散能力，控制溶质的溶解度，从而实现分离。 层析(色谱)技术是最近几十年来发展最快的纯化技术。层析装置的种类很多，且分离纯化机理也各不相同，适应于许多药物产品的分离纯化。离子交换色谱是应用最广，且易于实现大规模生产的方法。应用于抗生素、氨基酸、核苷酸、蛋白质的提取和纯化。分子筛层析根据分子量大小不同的

5、原理，适应于蛋白质类药物的纯化。层析分离技术的最高层次当属基于分子识别的技术，如亲和层析。这一技术已衍生出一大批新的技术，如免疫亲和层析、染料亲和层析、金属离子螯合层析。疏水性层析是基于分子的疏水性能来分离纯化的。 高效液相色谱法本是分析化学的常用手段，现已将其扩展到生物药物的分离纯化的应用中。有些设备不仅可进行分析，也可进行分离纯化，在新药开发的过程中，缩短了分离纯化所需时间。与层析技术同步发展的各种分离介质是层析分离的技术保障，商品化的预装柱、缓冲剂、计算机程序控制使操作变得简单易学。置换层析与洗脱层析不同，是指吸附在层析柱上的一种组分被另一种置换剂(与层析上的介质的亲和力大于原被吸附的组

6、分)置换出来的层析技术。该技术有上样量高，分辨率高的特点。被分离的样品在分离过程中还有浓缩作用。总之，随着科技的发展，新的分离、提取、纯化技术将不断得到改进。 1994年开始了各项GMP验证，其中工艺论证是一个不可缺少的组成部分。产品的纯化是生产过程中关键的一步。这涉及到药物的质量。所谓工艺验证，就是通过系统的方法得到关于生产工艺的书面材料，证明并保证生产过程能始终如一地生产出特定的高质量的产品。提取纯化处理工艺验证的范围包括：厂房设施、工程仪表、机械设备、生产环境、工艺条件、计算机软件、介质、原材料、半成品、成品、操作人员素质和测试方法等。 四、提取纯化的工艺论证四、提取纯化的工艺论证 以上

7、各个部分都要有验证材料或试验数据，根据这些材料和数据写出验证报告。当工艺的某一部分有较大变动 (大修、工艺条件变化)时，要进行重新验证（再验证）。再验证是针对某一部分的行动，而不是整个工艺过程的验证，因此比较简单、快速、易行。验证的实施过程包括以下步骤：提出验证要求、组织验证小组、制定验证方案、实施验证试验、写出验证报告和再验证。 一些药物(如抗癌药)往往对生物活细胞具有毒性，因此必须对中试或大生产的全过程设置屏蔽防护装置。其基本要求是：人员进出口要加以控制；在工作场所保持负压(一级、二级或三级生物密封室)；空气的排放必须通过HEPA过滤器；对有烟雾产生的设备要有附加的屏蔽防护装置；有适当的个

8、人防护措施；生产过程中所排放的废物要有生物学或化学的除污方法；对工作人员进行医疗监测；环境监测。 五、生物药物生产的屏蔽防护技术五、生物药物生产的屏蔽防护技术( (Containment technology)Containment technology) 生物药物纯化工艺技术要求高，应尽可能选用高质量的设备，并要求有清洁的各级GMP厂房。纯化方法的设计应考虑到尽可能去除污染病毒、核酸、宿主细胞杂蛋白、糖及其他杂质，要防止纯化过程中带入有害物质。六、纯化工艺过程的质量控制 关于纯度的要求，可视产品的来源、用途和用法而制定，例如经反复多次使用的真核细胞表达的制品，要求纯度达到98以上；多次使用的

9、原核细胞表达的制品要达95以上；外用制品的纯度可降低要求。 纯化工艺的每一步均应测定纯度，计算提纯倍数和收率等。纯化工艺过程中应尽量避免加入对人体有害的物质，若不得不加入，应设法除尽；并在最终产品中检测残留量，残留量应远远低于危害剂量，还要考虑到多次使用的积蓄作用。 指发酵液不经预处理，或仅通过简单的预处理。可采用树脂吸附法、柱式流化床吸附法等。由于可不必先分离菌丝体和固形物，因而可简化分离过程，提高产品收率，减少吸附剂的损耗，缩短操作时间。 第二节第二节 预处理及固液分离技术预处理及固液分离技术一一. . 直接从发酵液中提取产品直接从发酵液中提取产品(一)细胞破碎方法分类 可分为两大类：机械

10、破碎和非机械方法破碎。对液相物料，机械破碎法有超声波、机械搅拌和压力法。对固相物料，机械破碎法有研磨法和压力法。非机械破碎法分为脱水(空气干燥、真空干燥、冷冻干燥和有机溶剂干燥)和裂解(物理法、化学法和酶法)两类。裂解法又分为渗透压突变法、冷冻和解冻法等。化学法有阴阳离子洗涤剂处理法、抗生素处理法和甘氨酸处理法。酶法可用溶菌酶等有关的酶制剂处理，或用噬菌体裂解、抗生素处理等。二. 细胞破碎(Cell disruption) 高压均质器法：是当前较为理想的大规模破碎细胞的方法。可破碎酵母菌、大肠杆菌、假单胞菌、杆菌，甚至黑曲霉菌。将细胞悬浮液在高压下通入一个孔径可调的排放孔中，菌体从高压环境转到

11、低压环境，细胞就容易破碎。高压均质器的操作参数较简单，主要是操作压力、温度以及通过高压均质器的次数。但机理却颇为复杂。( (二二) )破碎技术破碎技术( (微生物细胞破碎微生物细胞破碎) ) 工业上所用的高压均质器的操作压力一般为55MPa，菌悬液一次通过均质器的细胞破碎率在1267。细胞破碎率与细胞的种类有关。 可分为离心过滤、离心沉降、离心分离3种类型，所使用的设备有过滤式离心机、沉降式离心机和分离机。过滤式离心机可用于处理悬浮固体颗粒较大、固体含量较高的场合。沉降式离心机用于分离固体浓度较低的固液分离。分离机用于分离两种互不相溶的、密度有微小差异的乳浊液或含微量固体微粒的乳浊液。 三三.

12、 . 离心离心 离心技术在生物制药研究及生产中应用极广，如从培养液中分离收集细胞，去除细胞碎片，收集沉淀物，从含蛋白质的液体中除去蛋白质吸附剂，也包括用超速离心法分离溶解的大分子。 膜分离的基本原理是：膜作为一种有选择性的障碍物，允许某些组分通过，而不许其他组分通过，因此将料液分成透过液和保留液两部分。膜分离技术在分离物质过程中不涉及相变，无二次污染。可分批操作，也可连续操作，易于自动化和扩大生产规模，分离效率较高。膜分离的缺点是膜易污染，使膜的性能降低。合成材料制成的膜在耐热、耐化学腐蚀等方面尚需改进，膜分离技术需要与其他分离技术结合起来使用。( (一一) )膜分离原理及特点膜分离原理及特点

13、四、膜分离技术四、膜分离技术 按照膜的孔径大小，可将膜分为：微滤膜(0.02514 m)；超滤膜 (0.0010.02 m)；反渗透膜0.000l0.001m)；纳米膜(平均直径2 nm)。 (二)膜分离材料及装置 膜可以是完全可透的，也可以是半透性的；有的膜是独立存在于流体间的，也有的膜是附着于支撑物或载体上的微孔隙中。膜还必须具有高度的渗透选择性。 用于生物制药工业中的膜材料要求耐温性能要好、耐酸碱处理、有较好的生物相容性（即要求膜对蛋白质和酶等生物大分子不产生变性，无抗原性）。 按照膜的结构分为对称性膜、不对称膜和复合膜。 按照膜的材料可分为合成聚合物膜、无机材料膜和不锈钢膜。如常用的微

14、滤膜材料有醋酸纤维酯和硝酸纤维酯、再生纤维素和聚四氟乙烯等，超滤膜材料有聚砜、聚醚砜、聚偏二氟乙烯、硝酸纤维酯(或醋酸纤维酯)、尼龙、丙烯腈-氯乙烯共聚物膜。此外还有不锈钢膜。(三三)膜过滤操作膜过滤操作主要的膜分离过程如下表 微滤器、超滤器和反渗透器的主要类型有平板式、管式、中空纤维式和螺旋卷绕式4种。 当溶液中欲被分离的蛋白质不受阻碍地通过超滤膜的孔隙时，如果在膜的一侧结合着亲和配基，该蛋白质就会与配基结合，因而结聚在膜的这一侧。不与配基结合的其他物质就将穿过孔而被带走。再用适宜的洗脱剂将该蛋白质洗脱下来。 ( (四四) )亲和超滤亲和超滤 1原理原理 决定超滤亲和纯化效率及质量的主要因素

15、是：目的物的代表性分子量、大分子配基及超滤膜的截留分子产量。超滤膜的孔径应适宜，并要求分布均匀，以防止漏出配基。要便于蛋白质及杂质的自由通过。大分子配基吸附到膜上，会降低过滤速度，有的配基还会沉淀到膜的表面。在膜的表面引入电荷可以防止这种情况的发生。 亲和配基和目标组分的结合方式有两种：(1)(1)将含有目标物的溶液与配基在超滤器内混合，或单独在混合槽内混合：(2)(2)将含有目的物的溶液及含有配基的溶液用泵分别送至膜的两侧，当蛋白质通过膜到达膜的另一侧(配基所在地)时，与配基结合。第1种方法较为常用，适应于相对较清的发酵液，或发酵液预先经过预超滤。2 2亲和结合的方式亲和结合的方式 蛋白质和

16、酶粗制品的脱盐的方法除了离子交换法、凝胶过滤外，还有透析和渗滤。 五五. . 渗滤渗滤( (DiafiltrationDiafiltration) )技术和透技术和透析析( (Dialysis)Dialysis) 渗滤是利用超滤器，选择性地使低分子量的溶质及水分子通过超滤膜，而保留分子量较大的溶质。在操作过程中，要不断补充同体积的去离子水，使原溶液中的产品得到纯化。其特点是：原溶液的体积保持恒定，目标物的浓度也保持恒定。 超滤是在外压作用下进行的，而透析是在常压下依靠小分子物质的扩散运动来完成的。透析装置有：透析袋、旋转透析器、平面透析器、连续透析器、浅流透析器、微管透析器。 泡沫分离的原理是

17、：将气体通入含多种组分的溶液中，由于这些组分的表面活性有差异，因此在溶液的表面，某些组分将形成泡沫，泡沫的稳定性取决于操作条件及溶液的生物学特性。泡沫中含有更多的表面活性成分，故泡沫的组分种类及其含量与溶液中的不相同。这样，溶液中的不同组分就得以分离。 六、泡沫分离六、泡沫分离 在泡沫分离过程中，要选择好操作条件，以保持酶蛋白的天然结构不变，活力不降低。 泡沫分离法的特点是分离所用的机械结构简单，可连续操作，容易放大，费用也不高。 泡沫分离的目的，一方面提高酶蛋白的富集率(泡沫中蛋白质的浓度/最初溶液中蛋白质的浓度)，另一方面提高酶蛋白的提取率(泡沫中蛋白质的质量/最初的蛋白质质量)，或使多组

18、分混合物中某一组分的分配系数最大。 影响蛋白质沉淀的因素有蛋白质的溶解性、蛋白质及沉淀剂的浓度、溶液pH、离子强度、温度和混合物中其他成分的浓度。沉淀剂的状态(固态或饱和溶液)，沉淀剂的加入速度、混合的时间及混合程度、沉淀物的分离提取等因素也必须考虑。 沉淀一般只能达到初步纯化的目的。技术较为成熟，在大规模生产中广泛应用。 第三节第三节 沉沉 淀淀一、沉一、沉 淀淀 去除沉淀的经典操作是用洗涤法，利用溶解度的差异将目的物与杂质分离。如果沉淀剂和目的物在溶解性相似，可考虑用超滤方法或层析的方法将它们分离。 常用的分离沉淀方法有：沉淀、悬浮法、离心法、过滤法或错流膜过滤。( (二二) )盐析剂用量

19、的确定盐析剂用量的确定 生产中所需的硫酸铵饱和度，需通过实验决定。( (一一) )盐析剂的选择盐析剂的选择 常用的盐析剂包括硫酸铵、硫酸钠、硫酸镁、氯化钠等。最常用的是硫酸铵。二二. . 盐析盐析 pH值的操作：从酶的溶解度考虑，盐析操作的pH值常选择在酶的等电点附近。但从酶的稳定性方面来考虑，有些酶在等电点时稳定性较差，因此要选择最佳的pH值。一般要求在酶最稳定的pH值的前提下，再考虑最适宜于酶沉淀的pH值。在操作时，一旦确定最佳pH值后，在添加硫酸铵之前，加入酸或碱，调节好酶液的pH值，要尽量避免pH值忽高忽低，以免破坏酶的稳定性。在添加硫酸铵时，要注意搅拌，并注意硫酸铵的加入速度。一般是

20、由少到多，缓慢加入，硫酸铵尽可能磨成细粉。( (三三) )盐析操作盐析操作 酶液的静置：加完硫酸铵后，酶液要静置一段时间，使酶蛋白完全沉淀下来，酶静置后，就不要再搅拌。 温度的控制：有些酶在较高温度下稳定性能较好，可在常温下进行盐析操作，而对于大多数酶，尽可能在低温下进行盐析操作。 用有机溶剂处理时，尽可能用稀的有机溶剂沉淀，而且一定要在低温下进行，最好在0以下。用有机溶剂沉淀得到的酶蛋白，不要放置过久，要尽快加水溶解。( (一一) )有机溶剂的选择有机溶剂的选择 可用于酶蛋白质沉淀的有机溶剂包括醇类物质等。( (二二) )有机溶剂沉淀操作有机溶剂沉淀操作三、有机溶剂沉淀三、有机溶剂沉淀 许多

21、食用级和药用级酶制剂，常用酒精作为沉淀剂。酒精用量应根据实验来确定。沉淀宜在低温下进行，一般取15以下，但温度太低，会使滤液中溶解度较低的蛋白质也沉淀下来。沉淀时的pH值，尽可能接近酶的等电点附近。酒精是蛋白质的变性剂，酒精浓度太高时，易引起变性。加酒精后，在酶沉淀之前，变性更加厉害，因此酒精最好在沉淀还未发生之前加完。酒精不能一次性全部加完，应分批加入，加入时应不断搅拌。加入一定量的高岭土或硅藻土，作为酶沉淀的载体，便于离心收集。离心分离结束后，应立即加水或缓冲液将酶沉淀物溶解，及时降低沉淀物内的酒精浓度，以防酶的变性。( (三三) )影响酒精沉淀收率的主要因素影响酒精沉淀收率的主要因素 将

22、配基与可溶性载体偶联后形成载体-配基复合物(亲和沉淀剂)，该复合物与生物分子结合，在一定的条件下可沉淀出来(即通过诱导沉淀)。 (一)原理四、亲和沉淀四、亲和沉淀(Affinity precipitation) 配基-载体复合物可选择性地与蛋白质结合。配基包括：酶的基质、辅酶、免疫配基及有机染料等。溶液中的pH、离子强度及蛋白质浓度等条件对亲和结合的影响力并不大。只有竞争性的配基会降低产物与原配基的亲和结合力，甚至使亲和结合发生逆转。 引导产生沉淀的方法有：离子交联、加入带相反电荷的聚合物、加入带相反电荷的疏水基团、改变pH、诱导产生疏水性沉淀、温度诱导沉淀。 亲和沉淀的收率取决于亲和反应的效

23、率，也取决于沉淀性能。亲和反应之后，如果沉淀效果不好，可加入某些天然的多聚物促进沉淀。 亲和结合：将亲和配基加到含有目的物蛋白质的溶液中，调节好有关沉淀的条件，使之有利于亲和结合。( (二二) )亲和沉淀的操作亲和沉淀的操作 洗涤：如果是在未经处理的粗制液中发生亲和沉淀，可能会发生某些非特异性的结合，一些无关的物质会陷于其中，因此在分离目的物之前，要洗涤沉淀。其做法是：加入适当的清洗剂重新溶解沉淀，再沉淀；或在专一性洗脱之前，彻底洗涤沉淀。 配基-载体复合物与目的蛋白质的分离：分离结束之后，要确保回收目的物蛋白质和配基-载体复合物，目的蛋白质要达到一定的纯度，收率要高，要重新利用配基-载体复合

24、物。配基的价格较为昂贵时，多加入些天然载体可使配基-载体复合物的循环使用效率提高以减少配基的损失。 常用的沉淀技术还有用聚合物絮凝剂沉淀法、金属离子沉淀法、等电点沉淀法等。五、其他沉淀技术五、其他沉淀技术 萃取指物质在两相之间的传质过程。最常见的是液液萃取，用有机溶剂作为萃取剂，萃取水溶液中的某种组分。原溶剂和萃取剂一般是互不混溶的。根据溶质在这两个互不混溶的液相中分配系数的差别，而实现将溶质浓缩到萃取剂中。萃取是通过溶质在两相之间的竞争性溶解(分配)而实现的。萃取多用于小分子的生物药物，如抗生素和核苷酸，但也可萃取生物大分子，如双水相萃取技术萃取蛋白质。( (一一) )定义和原理定义和原理第

25、四节第四节 萃取萃取(Extraction)一、概述一、概述 pH值影响分配系数，因而对萃取的收率影响很大。影响萃取操作的因素主要有：1 1pHpH值值二、萃取操作的影响因素二、萃取操作的影响因素 一般来说，低温萃取速度较慢，可适当提高温度；但是由于萃取剂多为有机溶剂，在高温下，产品的稳定性较差而受破坏，故萃取尽可能在低温或常温下进行。温度还影响分配系数。2 2温温 度度 加入盐析剂，可使溶质水中的溶解度降低而易于转入到溶剂中去。盐析剂的加入，也能减少有机溶剂在水中的溶解度。3 3盐盐 析析 萃取剂的选择依据主要是对所要萃取的组分有较大的溶解度，还应具有良好的选择性。 三、溶剂的选择三、溶剂的

26、选择 选择性可用分离因数来表示。根据相似相溶原理，应选择与目的物结构相近的溶剂。在工业上还要求价格低廉，挥发性小，毒性小，来源广等特点。此外，还要考虑对产品的选择性能，与原溶剂相不相混溶，两相有较大的密度差，产品对萃取剂的敏感程度，萃取剂应易于回收。 在萃取时要尽量避免乳浊液的形成。可通过过滤和离心分散法、加热、稀释、加电解质、吸附、顶替、转型等方法破坏乳浊液。 在生产中，应尽量避免采用强毒性溶剂，常用的溶剂有乙醇、丙酮、乙酸乙酯、乙酸丁酯、甲醇、丁醇。 萃取操作流程分单级萃取和多级萃取。多级萃取中又有多级错流萃取和多级逆流萃取。 工业上萃取操作包括3个步骤：混合：料液和萃取剂充分混合，形成具

27、有很大比表面积的乳浊液产物，自料液转入萃取剂中；分离：将乳浊液分成萃取相和萃余相；提取及回收：产品提取及回收萃取剂，有时也要从萃余相中回收萃取剂。四、四、 萃萃 取取 方方 式式 双水相系统一般是指将两种亲水性的聚合物都加在水溶液中，当超过某一浓度时，就会产生两相，两种聚合物分别溶于互不相溶的两相中。典型的两相系统如表7-11所示。 ( (一一) )双水相的形成双水相的形成 双水相萃取法的一个重要优点是可直接从细胞破碎匀浆中萃取蛋白质，而无需分离细胞碎片。因而可直接萃取，达到固液分离和纯化的目的。五、双水相萃取五、双水相萃取 影响物质分配平衡的主要因素有：聚合物及成盐的浓度，聚合物的平均相对分

28、子质量，体系的pH值及其他盐的种类及浓度，菌体或细胞的种类及含量，体系温度等。 ( (二二) )影响物质分配平衡的因素影响物质分配平衡的因素 将一些小分子配基共价连接到形成相的多聚物之上，在双水相系统中，配基如聚集于上层，目的物蛋白质就通过形成生物特异性复合物而转移到上层，从而达到纯化该种蛋白质的目的。( (三三) )双水相亲和分配纯化生物分子双水相亲和分配纯化生物分子 亲和分配双水相萃取技术可用于酶及蛋白质的分离纯化，还可分离某些特定的细胞。 许多配基都可用于亲和分配，包括酶、抗原及抗体、激素及其相对应的接收体等。常用的聚合物有聚乙二醇、葡聚糖和变性淀粉等，其中使用最多的是聚乙二醇。 反胶束

29、是表面活性剂分散于连续有机相中自发形成的纳米尺度的一种聚集体。反胶束溶液是透明的、热力学稳定的系统。六、反胶束提取纯化技术六、反胶束提取纯化技术 影响反胶束萃取蛋白质的主要因素有：水相pH值、离子强度、温度、亲和表面活性剂。 反胶束系统作为液液萃取方法，更具有选择性。这种方法的优点是使热敏性的、亲水的蛋白质在一种近似于水相的环境中提取出来，使蛋白质活性不受到损失。 在反胶束萃取蛋白质的研究中，常用的是阴离子表面活性剂。 超临界流体萃取技术的优点是节能，可使用生理惰性溶剂在低温下分离组分，目前这一新技术的应用虽然还不普遍，但潜在应用前景很广。七、超七、超 临临 界界 萃萃 取取 技技 术术 广义

30、的吸附是有选择性地将一种或多种溶质从流动相中转移到固定相中的过程。利用固定相和流动相之间的相互作用将组分分离开来。吸附的机理可分为5类：分子大小、范德华力、极性、离子交换、亲和。在此主要介绍层析、吸附(Adsorption)和离子交换技术。 第五节第五节 吸吸 附附( (Sorption)Sorption) 层析也称为色谱，利用各组分与固定相亲和力或相互作用方面的差别实现分离。层析技术广泛用于生物药物的分离和纯化，主要涉及液-固柱层析系统。液-固层析滞留分子的机理有吸附、离子交换、亲和、分配、凝胶过滤等。主要的层析技术如表7-13所示。( (一一) )层析原理层析原理一、层析的基本知识一、层析

31、的基本知识 在填充床中进行层析，是最为常见的层析操作。层析柱内填充层析材料，含有样品的液体(尽可以浓缩)加到柱顶部(这称为顺上柱)，然后加入洗脱剂，在重力或压力作用下，向下流动，流经填充床层析柱内的固定相，根据组分与固定相之间的相互作用力，目的物分子在固定相和流动相中分配，因而在每一相中均停留一定的时间。在固定相中停留时间短的分子将很快地被流动相带走，而在固定相中停留时间长的分子在柱中流动较慢。不同种类的分子因它们在不同相中分配的差别，而被分离成不同的区带。因此，层析是利用不同组分在层析介质中迁移速度的差别而进行分离纯化的。其基本原理如图7-20所示。 层析柱的操作取决于许多因素，如所用的介质

32、、洗脱剂的空柱流速、柱的孔隙率、介质的可渗透性能、组分在固定相和流动相中的分配系数、处理量等因素。 不同组分所形成的区带相隔越远，这说明层析柱的选择性能越好；但是当组分在柱中向下移动时，往往会产生扩散，表现为区带变宽，在一定长度的色谱柱内所产生的区带越窄，色谱系统的效率也就越高。( (二二) )层析的两个基本问题：区带分离层析的两个基本问题：区带分离和峰形变宽和峰形变宽 选择性和效率是相辅相成的：效率高的色谱系统，即使其选择性较差，也能对被分离的组分进行很好的分离(即区带之间不会重叠)。同样道理，选择性好的系统，即使它的效率较差，也能使物质得到良好的分离。( (四四) ) 层析流动相的操作方式

33、层析流动相的操作方式 层析分离照操作方法主要有迎头法、置换法和洗脱法。目前主要以洗脱法为主。( (三三) ) 层析的分辨率层析的分辨率 分辨率可定义为两个被分离的区带之间的宽度与区带的宽度之比值。若两个被分离的区带之间的宽度越大，每个组分区带的宽度越小，则分辨率越高，分离效果越好。 柱式层析系统的组成主要是蠕动泵、层析柱、检测器、记录仪和部分收集器。实验室所用的多为玻璃柱，工业所用的层析柱用金属或聚丙烯材料制成。层析用介质种类很多，如表7-14所示。( (五五) )层析装置和操作层析装置和操作 层析操作包括：装柱、加样、洗涤、洗脱和再生。 装柱质量的好坏，对层析分离的效果影响很大；尽可能清液上

34、柱；洗脱前一般要用清水或缓冲液将杂质洗涤下来；要根据被吸附物的特点(如组分的溶解度，吸附剂的性质，洗脱溶剂的极性等)来选择合适的洗脱剂，然后采取恒定洗脱法、逐次洗脱法或梯度洗脱法进行洗脱；目的物洗下后，要用再生剂处理层析介质。 离子交换色谱利用溶液中各种带电粒子与离子交换剂之间结合力的差异进行物质分离的操作技术。二、离子交换技术二、离子交换技术 离子交换法 常见的离子交换剂分为离子交换树脂、大孔离子交换树脂、离子交换纤维素和葡聚糖凝胶离子交换剂等。各种交换剂均可按其可解离的交换基团分为阳离子交换剂(强酸、中强酸、弱酸)和阴离子交换剂(强碱、中强碱性和弱碱性)两大类。 离子交换法广泛用于提取抗生

35、素、氨基酸、核苷酸、有机酸及生物大分子。 在生物制药工业中，发酵培养液中同时存在着多种离子，目的物离子与树脂的亲和力越大，就越容易被树脂吸附。离子的化合价与水合半径、溶液的酸碱度都会影响交换的选择性。 将大网格离子交换树脂的功能团去掉，仅保留多孔的骨架后，其性质就可和活性炭、硅胶等吸附剂相似，这种称为大网格聚合物吸附剂。大网格吸附剂是一种非离子型共聚物，它能够借助范德华力从溶液中吸附各种有机物质。三大网格聚合物吸附三大网格聚合物吸附 大网格吸附剂的吸附能力，不但与树脂的化学结构和物理性能有关，而且与溶质及溶液的性质有关。根据“类似物容易吸附类似物“的原则，一般非极性吸附剂适宜于从极性溶剂(如水

36、)中吸附非极性物质；反之亦然；而中等极性的吸附剂则对上述两种情况，都具有吸附能力。 大网格吸附剂具有孔隙小，选择性好，解吸容易，机械强度好，可反复使用和流体阻力较小的优点。可以用于弱电解质或非电解质或非离子型的物质。 凝胶过滤又称为凝胶扩散层析、排阻层析、分子筛层析等。凝胶层析柱中装有多孔填料，如交联聚苯乙烯；多孔玻璃、多孔硅胶、交联葡聚糖等，这些固体载体，具有细微的孔，其孔径大小可准确控制，溶剂分子可以自由出入，溶质分子根据分子大小，在孔中的扩散情况则很不相同。大分子只能进入较大的孔内，小分子不仅能进入大孔内，而且也能进入小孔内，由于大分子由于所经过的路程较短，先被溶剂带出，而小分子溶质后被

37、洗脱下来。另外，分子形状及溶质与凝胶之间存在的非特异性吸附作用也影响洗脱结果。(一)凝胶层析的基本原理四、凝胶过滤四、凝胶过滤( (GelmtrationGelmtration) )层层 析析(色谱）色谱）分子筛分子筛 凝胶过滤法凝胶过滤法 用交联葡聚糖凝胶可分离相对分子质量数百到数十万的物质，用琼脂糖凝胶可分离相对分子质量为数十万到上亿的物质。粘度高的溶液会显著影响分辨率，凝胶还容易受到蛋白质的阻塞。 凝胶材料有葡聚糖、琼脂糖、聚丙烯酰胺、微孔玻璃等。 凝胶过滤和层析的放大方法较为简单。首先要对实验室所取得的纯化方案进行优化。再放大时，先要保持柱床高度、线性流速及上样浓度不变，然后增加上样量

38、，增加体积流速和柱的直径。( (二二) )凝胶过滤及层析的放大凝胶过滤及层析的放大 选择凝胶基质时要考虑的因素有：操作模式、分辨率(通常基质的颗粒直径越小，分辨率越高)及基质的稳定性能。 亲和层析的主要过程是：(1)(1)配基固定化，即选择合适的配基与不溶性的载体偶联，或共价结合成具有特异亲和性的分离介质；(2)(2)吸附样品，用亲和层析介质选择性地吸附生物活性物质，杂质不能被吸附而在洗涤时被去除；(3)(3)样品解吸(洗脱)，选择适宜的条件，使被吸附在亲和介质上的生物活性物质解吸下来。第六节第六节 亲亲 和和 层层 析析一亲和层析概述一亲和层析概述亲亲 和和 层层 析析 生物亲和层析包括下列

39、类型：疏水反应层析、金属螯合亲和层析、免疫亲和层析、共价亲和层析、固定化染料亲和层析、特殊基团亲和层析、亲和分配、亲和电泳、亚基交换层析、高压亲和层析、定量亲和层析、膜亲和层析、置换亲和层析。1 1亲和层析技术的类型亲和层析技术的类型 载体是与配基亲和结合的层析介质，在亲和层析中的作用是使配基固定化，同时提供形成亲和对的两物质特异性结合的空间环境。常用的载体有纤维素、琼脂糖凝胶、葡聚糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶，多孔玻璃珠等。2 2亲和层析载体亲和层析载体( (Matrix)Matrix)和配和配基基( (LigandLigand) ) 在亲和层析中起可逆结合的特异性物质称为配基。按照亲和层析的原理

40、，亲和层析的任何一方都可作为配基，一般用小分子量的亲和配基分离蛋白质，但也可以反过来，用固定化配基专一性的蛋白质来纯化小分子量的配基。 (2) (2)抗体与抗原、病毒、细胞； 在生物亲和层析中，可利用下述生物亲和关系进行分离纯化。也可将配基分为两大类：通用配基和特殊配基。特殊配基包括以下一些类型：(1)(1)酶与底物或底物类似物、酶的抑制剂、辅助因子(如辅酶，金属离子)； 通用配基包括蛋白质A-Sepharose CL-4B、conA-Sepharose、小扁豆外源性凝集素、小麦芽外源性凝集素等。 (3) (3)激素、维生素与受体蛋白和载体蛋白； (4) (4) 外源凝集素(Lectin)与多

41、糖化合物、糖蛋白、细胞表面受体蛋白、细胞； (5) (5) 核酸与互补碱基链段、组蛋白、核酸聚合酶及核酸结合蛋白。 配基的偶联是采用化学合成的方法，将配基与载体结合在一起。不同的配基种类有不同的方法。有时，可在载体和配基之间插入一个“接枝”或称“手臂”，以消除空间障碍，对提高吸附容量有利。 亲和层析选择性非常好，因此可减少提纯步骤。但是亲和介质一般价格昂贵，处理量不大，大规模应用较少，在实验室制备时，一般只是在纯化的后期使用。3 3亲和层析的优缺点亲和层析的优缺点 基本原理是生物大分子中的功能团与层析剂上的互补结构形成可逆性的共价键。二、共价亲和层析二、共价亲和层析 具有共价反应活性的二硫键层

42、析剂可用葡聚糖凝胶或琼脂糖凝胶为载体。现已有商品化供应的层析介质。 基于疏水特性的吸附功能，是疏水层析技术的基础。将一系列长度不同的碳氢化合物接到琼脂糖载体上，从而得到一系列相应的疏水性琼脂糖层析介质，可用它们从粗提取液中分离纯化某些可溶性蛋白质。 三、疏三、疏 水水 层层 析析 理想的疏水配基应当是亲水性的，并且是生物惰性的，不应当产生非特异性的二次吸附。琼脂糖最常用。 盐析离子的存在会增强蛋白质吸附在碳氢化合物接枝的琼脂糖上，而盐溶离子则可用来洗脱被强烈吸附的蛋白质。在高浓度盐析离子(如硫酸铵)存在下进行吸附是目前最常见的操作方法。通过逐步降低盐浓度而洗脱。当洗脱液表面张力降低到蛋白质的表

43、面张力时，蛋白质就开始洗脱下来。在水相环境中，温度和pH对吸附和洗脱都有影响。 疏水层析可用于蛋白质纯化。疏水层析可用于蛋白质纯化。 蛋白质分子能够与金属离子发生亲和反应，并与之结合，可用于吸附纯化蛋白质。 四、固定化金属离子亲和层析四、固定化金属离子亲和层析 固定化金属离子亲和层析柱的制法：将柱子浸没于某种金属离子(如Cu2+、Zn2+、Ni2+、CO2+)缓冲溶液中，直至螯合到固定相上的金属离子和溶液中的金属离子达到平衡。固相载体，通常是硅或多聚物(如交联化的琼脂糖、葡聚糖)，与配位体(如亚氨基二乙酸，IDA)共价连接。当在缓冲溶液中，浸泡平衡后，经洗涤，可将含有生物活性物质的样品上柱，与

44、固定化的金属-配基复合物有亲和力的分子都将被滞留，其余则流出柱外。 若要将蛋白质从柱上洗脱下来，则可通过改变盐的浓度、改变pH，或由竞争性的试剂将蛋白质置换下来，这些方式的机理都是通过降低固定化金属离子和蛋白质之间的亲和常数。可采用分级洗脱或梯度洗脱方式。 IMAC方法的主要优点是：可用不同的金属离子固定到螯合载体上，因此可用一种更强的螯合剂将所使用的螯合剂洗脱下来，从而实现再生。螯合剂较稳定，金属的结合特性不会大幅下降。通过选择适宜的金属离子，可选用不同的分离方法；将不同的金属离子固定到柱上，可实现蛋白质和配基之间的不同的吸附特征。在大多数情况下，从IMAC柱上洗脱下来的蛋白质，仍然具有生物

45、活性。 抗原和抗体的作用具有高度的专一性，并且它们的结合亲和力极强。因此用适当的方法将抗原或抗体结合到层析剂上，便可用来有效地分离和纯化各自互补的免疫物质。 五、免五、免 疫疫 亲亲 和和 层层 析析 免疫亲和层析有时也称为抗体亲和层析，该技术常用蛋白A和蛋白G对于各种来源的免疫球蛋白IgG的Fc区域的高度亲和和高度专一性的结合为基础。用这些蛋白作为配基与载体(如琼脂糖)结合来制备层析载体。 一些有机染料如蒽醌化合物和偶氮化合物具有类似于NAD+的结构，因此一些需要核苷酸类物质为辅酶的酶，对这些染料有一定的亲和力，如果这些染料作为配基共价偶联到纤维素或琼脂糖等多糖载体上，就能制得染料亲和层析柱

46、。亲和染料层析已成功地分离纯化了许多酶。六、染六、染 料料 配配 基基 层层 析析 凝集素是一类能与糖的残基专一性结合的蛋白质，所发生的结合反应是可逆的。它们能与多糖、糖蛋白及红细胞和肿瘤细胞凝集体产生专一性的结合。与固定化凝集素结合的物质可用竞争性的结合试剂或离子浓度梯度洗脱下来。 七、凝七、凝 集集 素素 亲亲 和和 层层 析析 置换层析是指吸附在层析柱上的一种组分被另一种组分或试剂置换出层析柱的技术。首先用起始缓冲液平衡，再用同样的缓冲液溶解或充分透析平衡的样品上柱；然后再由同样的缓冲液配制的置换剂溶液进行置换洗脱。由于置换剂对层析柱中固定相的亲和性大于被分离样品的亲和性，当加入置换剂后

47、，置换剂的前沿迫使样品最后的后沿组分解吸附，这一被解吸附的组分又去置换前面的亲和性弱的组分。这样不同的组分由于其对固定相亲和能力的不同，在对吸附部位的竞争和相互的置换中，按照各组分对固定相的亲和力的大小而被分离并形成相互毗邻的无拖尾的纯组分峰区带。 八、八、 置置 换换 层层 析析 置换剂在被分离样品的后面移动，推动着样品区带以相同的速度向前移动。在置换层析中，样品的分离是由于被吸附的组分之间对固定相吸附部位直接竞争作用的结果。这种直接的竞争导致各组分按照它们对固定相亲和性的大小形成一置换序列，并且在置换剂的推动下，以相同的速度向下移动。理想的置换洗脱图谱中，每一组分不是形成钟罩形的洗脱曲线，

48、而是形成矩形的平台洗脱峰。相毗邻的各组分的平台洗脱峰组成了一个台阶式的层析图谱。图图7-257-25是置换层析原理图是置换层析原理图。 置换层析所使用的层析系统与洗脱层析的相同。如可用吸附层析、离子交换层析、反向层析等。整个操作过程包括层析柱的平衡，上样，加置换剂置换，分步收集，层析柱再生。 置换层析允许的上样量可以比传统的常规层析高得多，而且样品组分是以浓缩的状态被分离的。 这种技术将蛋白质等物质的等电点特性与离子交换色谱的特性结合在一起，实现分离。首先假定用阴离子交换剂分离某种蛋白质，当介质的pH值低于其等电点时，不与阴离子交换剂发生交换，而是随着洗脱液向下移动。当环境的pH值高于蛋白质等

49、电点时，才可与离子交换剂结合。在洗脱过程中，环境的pH值是不断下降的，当pH下降至蛋白质的等电点之下时，蛋白质又重新脱离交换剂而被洗脱，移至pH大于等电点时又重新结合，这样不断重复，直至蛋白质从柱下流出。 1 1、原、原 理理九、色九、色 谱谱 聚聚 焦焦 当某种蛋白质在柱上随洗脱液下移至等电点处时，其移动速度明显减慢。如果此时再加入另一份含有相同蛋白质组分的样品，该蛋白质将以洗脱液的速度下移，直至追到上一次进样的、正在慢速移动的、靠近等电点处的蛋白质处，从而实现聚焦。第二个样品的加入时间要掌握好，必须在第一个样品的蛋白质峰还未洗脱之前加入，否则就不能聚焦。 pH梯度的形成：色谱聚焦系统的pH

50、梯度，是利用离子交换剂本身的带电基团的缓冲作用自动形成的。如选用阴离子交换剂，色谱柱先用起始缓冲液平衡到pH 9，洗脱液的pH选定为6，加入洗脱液，开始加洗脱液时，流出液的pH值接近于9，随着洗脱液的加入，流出液的pH值逐步下降，最后柱内完全被洗脱液所平衡，流出液的pH达到6。 多缓冲交换剂：用于色谱聚焦的交换剂是一种专门开发的交换剂，商品通常是以悬浮液形式提供。缓冲剂也是专门开发的两性电解质缓冲剂，由分子量大小不同的多种组分的多羧基多氨基化合物组成。与这两种多缓冲剂相匹配的多缓冲交换剂通常以无菌的液体形式提供，用前加以稀释。2 2交换剂和缓冲液体系交换剂和缓冲液体系3、操作步骤 在含蛋白质的

51、溶液中，应用100500MPa的高压可使多聚体蛋白质解离成亚基，且不会使其失活。但是当压力高于600MPa以上时，蛋白质则会产生不可逆失活。十、高十、高 压压 亲亲 和和 层层 析析 大规模纯化蛋白质的初步阶段，处理量大，但分辨率要求不高，并不要求立即就采用层析技术，可先用分步沉淀、盐析或有机溶剂沉淀等方法。如果蛋白质的数量不多，含量较低的样品，也可用分辨率和处理量中等的离子交换色谱技术，必要的话，也可采用高分辨率、低容量的亲和层析技术和等电聚焦。十一、合理设计层析方案十一、合理设计层析方案 免疫亲和层析和反相层析易使蛋白质变性，不能用于纯化活性蛋白质，离子交换色谱法是较为普遍使用的分离活性蛋

52、白质的方法。对于很敏感的蛋白质，在分离纯化时，分离纯化步骤尽可能少，且不要频繁变换缓冲剂。1 1保留蛋白质的生物活性需注意的问题保留蛋白质的生物活性需注意的问题 在设计蛋白质纯化步骤时，要充分利用各种蛋白质之间性质的差别。以下所列出的是最重要的一些特性： 2 2利用蛋白质的差别来设计分离利用蛋白质的差别来设计分离步骤步骤 (1) (1) 电荷电荷 蛋白质中带电氨基酸的比例各不相同，在一定的pH下，净电荷也不同。因此可以利用这一性质采用离子交换色谱法分离纯化蛋白质。蛋白质带的电荷与离子交换树脂上的固定载体所带电荷相反，蛋白质与载体的结合强度取决于蛋白质上电荷的数量。对于大规模(100g蛋白质)分

53、离纯化，常采用纤维素为基质的树脂，流速较快，柱床体积也较大，但此法的分辨率不高。欲得到高分辨率的纯化结果，可用琼脂糖为基质的树脂，但其处理量较小。 如果蛋白质的量小于10mg，则可采用快速蛋白液相层析法。有预装柱配套，柱的直径小，分辨率很高。如果两种蛋白质在某一pH值带有相同的电荷，但是在另一个不同的pH值，则带不同的电荷。因此在一个分离纯化过程中，常常分为若干个离子交换步骤。这又分为几种情况，如可使用同一种树脂，但可设定不同的平衡时的pH值，或使用两种相反电荷的树脂，例如，第一种树脂结合有带负电的羧甲基基团(CM)，另一种带有正电的二乙氨乙基基团(DEAE)。 利用蛋白质之间等电点的差别，可

54、开发一些分离纯化方法。如层析聚焦法，这是一种离子交换技术，蛋白质结合到阴离子交换剂上，然后通过连续地降低缓冲液的pH值，将蛋白质根据其等电点的顺序依次洗脱。这是一种分辨率及容量相当高的分离技术，可用于初步纯化蛋白质的进一步纯化。另一种技术是等电点聚焦，此法的处理容量不大，但分辨率很高，适于分离蛋白质混合物。 (2) (2) 分子大小分子大小 超滤技术及分子排阻层析就是依据蛋白质分子大小的性质而设计的。分子排阻法的分辨率不算高，但是如果目的物蛋白质与其他杂蛋白质的分子量相差很大，则此法的分辨率还可以。因为受柱体积的影响，此法的分离容量也不高。凝胶电泳也是基于蛋白质的大小，小分子蛋白质移动速度快，

55、该技术分辨蛋白质的能力很强，但蛋白质易失活，故常用于蛋白质的分析。 (3) (3) 专一性结合专一性结合 许多蛋白质通过与某些成分结合而具有生物功能，如酶与基质结合，有时与活化剂或抑制剂结合，激素与受体结合，抗体与抗原结合。许多亲和层析技术就是利用上述特性。 依据目标蛋白质与低分子量化合物相互反应(如酶与基质或基质类似物)的亲和方法专一性一般不强，因为配基可与混合物中的若干种蛋白质结合。更新颖的亲和分离方法是使用双功能NAD+衍生物，更有选择性地亲和结合脱氢酶。 (4) (4) 特殊性质特殊性质 利用某些蛋白质的热稳定性，先将样品加热处理，耐热性能不好的杂蛋白变性沉淀，而耐热的仍留在溶液中。也

56、可利用蛋白质在极端pH的环境下稳定的性能，对于这种情况，可将样品调至低pH或高pH，保温一段时间，杂蛋白就可以沉淀下来。 最后值得一提的是，如果需要的话，也可为一些蛋白质设计出一些特殊的性质，以帮助它们的纯化。如在蛋白质上加入一段聚精氨酸或聚赖氨酸，以增加其电荷，使该蛋白质在离子交换层析上得到纯化。或者将一段聚合组氨酸引入到固定化金属亲和层析上。 在纯化的初步阶段，可通过测定在280nm处的吸光度确定其含量。在纯化的后期阶段，可用更为准确的方法。3 3测定和数据处理测定和数据处理 层析技术在重组蛋白的分离纯化方面发挥了越来越大的作用。但层析技术并不能解决所有的分离纯化问题，层析技术必须和其他技

57、术相结合，并讲究分离纯化步骤的合理安排，才能得到好的分离纯化效果。常见的安排如下： 4 4重组蛋白质分离纯化的操作顺序重组蛋白质分离纯化的操作顺序盐析凝胶过滤离子交换有机溶剂沉淀亲和吸附染料配基吸附等有机溶剂沉淀离子交换盐析凝胶过滤有机溶剂沉淀亲和吸附盐析凝胶过滤亲和吸附盐析凝胶过滤也可按以下方法选择组合： 大分子产物的分离纯化一般需要较长的时间。决定纯化时间的因素有很多，但最主要的可能是大多数提取纯化过程都是利用物质的扩散性能；酶是一种热敏性的产品，在分离操作过程中，一般都要保持在0左右，低温有利于酶活力的保存，但会延长分离纯化的时间； 5 5纯纯 化化 所所 需需 时时 间间 为了操作者的安全，大多数国家对于含有外源基因的重组细胞的贮存和处理都有明确的法律规定，只要含有外源DNA的细胞是存活的，这些细胞都要放置在有特殊安全措施的密封装置内，当这些细胞被杀灭或适当处理后，才能对细胞提取物进一步加工。6 6重组蛋白质的特殊提取精制技术重组蛋白质的特殊提取精制技术 重组蛋白质一般用于临床实