第4讲新品种培育技术 2

1、第三篇 新品种培育技术第7章 细胞融合与体细胞杂交骡子：雄驴和雌马交配所产的杂种叫驴骡。雌驴和雄马交配所产的杂种叫马骡。狼狗：狗与狼的杂交后代。杂交斑马：由斑马和马科动物杂交产物狮虎：狮子和老虎的杂交产物。豹狮：美洲豹与狮子的后代。不亲和性不亲和性：在有性生殖过程中，由于生物个体的细胞或组织水平上的不协调而使受精或接合不能正常进行，或是受精后不能产生后代的现象。例如：生殖细胞不能融合，或受精卵不能发育，或子代无繁殖能力等。不亲和性是稳定物种的重要机理之。种间不亲和性：异种、异属生物个体之间的生殖不亲和现象常由染色体组的不同所造成种内不亲和性：种内个体间的不亲和现象往往是受不亲和基因所制约。杂交

2、杂交：通过不同的基因型的个体之间的交配而取得某些双亲基因重新组合的个体。杂交优势：两个遗传基础不同的植物或动物进行杂交，其杂交后代所表现出的各种性状均优于杂交双亲，比如抗逆性强、早熟高产、品质优良等一般情况下，种间、种内杂交通过生殖细胞相互融合而达到。由体细胞相互融合达到这一结果的过程称为体细胞杂交。远源杂交 远缘杂交：不同种属之间，或是地理上远缘的种内亚种之间个体的交配称为远缘杂交。 由于种属间存在着隔离机制，致使远缘杂交常表现不亲和或获得的远缘杂种表现不育。 体细胞杂交是解决远源杂交不亲和性的有力手段之一，更好地利用自然界基因资源，培育新物种。部分野生品种的块茎、果实虽不能食用，但它们的植

3、株具有较强的抗病虫害、抗盐碱性和耐寒能力。因此，用野生马铃薯和番茄分别与马铃薯、番茄作物杂交，培育出了生存能力较强的杂交系植物。杂交玉米等杂交植物比它们的亲本更为健壮，产量更高。自然（Nature）2008年11月23日：中美科学家发现杂交植物比其亲本生长更好的一个原因：负责光合作用和淀粉代谢的基因在白天要更为活跃。杂交拟南芥（中间）比其亲本（左和右）要大 问题：有没有可能培育出地下结土豆，地上结番茄的超级植物？1978年德国科学家梅歇尔斯将番茄与马铃薯进行体细胞杂交育成薯番茄“泡马豆”（po(tato)(to)mato）。马铃薯与番茄两种原生质体的融合率达4050。本节主要内容1.细胞融合2

4、.体细胞杂交及其在育种中的应用关键问题：细胞融合的原理、方法与关键环节第一部分 细胞融合一 定义与意义 细胞融合（Cell fusion）是指使用人工方法使两个或两个以上的细胞合并形成一个细胞的技术。 对于植物也叫“原生质体融合”。亲本细胞是体细胞，也叫“体细胞杂交（somatic cellhybridization）”。 由于它不仅能产生同种细胞融合，也能产生种间细胞的融合，因此细胞融合技术在创造新细胞、培育新品种方面意义重大。植物：体细胞杂交培育新品种动物：单克隆抗体生产（动物细胞生物制药讲授）二 细胞融合的分类1.材料：原生质体（去除了细胞壁的裸露的细胞）、动物细胞2.从亲本来源：（1）

5、同核体（Homokaryon）：基因型相同的细胞融合成的融合细胞称为。（2）异核体（Heterokaryon）：来自不同基因型的融合细胞。3.从融合效果：（1）对称融合（Symmetric fusion）：两个完整的细胞间的融合（2）不对称融合（Asymmetric fusion）：利用物理或化学方法使某亲本的核或细胞质失活后再与另外一个完整细胞进行融合。三 发展历史自发融合现象最初在动物细胞中发现。1858年发现正常组织、发炎组织以及肿瘤组织中的多核细胞情况。动物体内的破骨细胞也是自发融合形成的多核细胞。1962年日本学者发现一种叫日本血凝性病毒(HVJ)能引起艾氏腹水瘤细胞融合成多核细胞的

6、现象。20世纪70年代初，华裔加籍科学家高国楠发现聚乙二醇(PEG)能促使植物原生质体融合，开拓了植物细胞融合的研究。20世纪80年代，齐默曼（Zimmerman）等建立电场诱导细胞融合方法。四 细胞融合原理细胞膜磷脂分子扰动出现通道细胞桥主要环节（1）亲本选择（单细胞或原生质体制备）（2）两原生质体或细胞互相靠近，粘附（3）质膜融合形成细胞桥（4）胞质渗透（5）细胞核融合（6）融合细胞筛选原生质体及其制备（1）定义：去除细胞壁后裸露的细胞称之为原生质体（protoplast）。（2）特点：无细胞壁，可以方便地进行遗传操作、人工诱变、细胞器转移、细胞融合等操作。具有全能性，能再生细胞壁。（3）

7、制备与纯化酶解法的建立1960年，英国科金第一次采用酶方法从番茄幼苗大量制备出原生质体。使植物细胞融合技术得以建立。植物细胞的细胞壁主要成分是纤维素（纤维素微纤丝Cellulose microfibrils ）、果胶（pectin）、多糖（glycan）。果胶酶、纤维素酶等处理植物组织，可以破坏胞间层和去掉细胞的纤维素外壁，得到游离的裸露原生质体。4 分离、鉴定与活力分析（1）分离飘浮法：常用的飘浮剂有蔗糖、Percoll、Ficoll等。 Percoll是经过聚乙烯吡咯烷酮 (polyvinyl pyrolidone, PVP) 处理的硅胶颗粒混悬液，对细胞无毒性和刺激性。Percoll混悬

8、液的硅胶颗粒大小不一，经过高速离心后，可形成一个连续密度梯度，将比重不同的细胞分离纯化。 离心法：低速离心，收集沉淀。（2）鉴定与活力分析低渗爆破：爆破后是无形的。渗透压调节剂：葡萄糖、甘露醇、山梨醇等。染色发法：有活力的原生质体吸收不同染料显示与死亡细胞不同的颜色来分析。FDA（二乙酸荧光素）能自由地穿越细胞质膜，在活细胞内，FDA被酯酶裂解即发荧光（荧光素），由于荧光素不能自由通过质膜，因而可以在荧光显微镜下通过具荧光的细胞的观察确定细胞活性。关键：细胞核的融合若是没发生细胞核的融合，仅发生了细胞质的融合，则可能成为嵌合细胞。含有多个核的异核细胞合并后形成的单核细胞称为合核细胞。细胞核的合

9、并发生在有丝分裂过程中。但是这种有丝分裂只有当两个核的DNA合成基本同步时才能发生：两个核同时进行有丝分裂，形成一个纺锤体，全部染色体都排列在一个赤道板上，结果伴随着细胞分裂就形成了单核的子细胞，其细胞核中含有双亲细胞的染色体。五 细胞融合方法1. 生物法病毒诱导细胞融合：研究最早的细胞融合诱导方法。主要是由于病毒会与宿主细胞膜直接融合，同时进入两个细胞就会打破两个细胞膜的隔阂，引发细胞质的交流，进而达到细胞融合的目的。原因可能是病毒的磷脂外衣与动物细胞膜相似，病毒外壳上的某些糖蛋白有促进细胞融合的功能。仙台病毒、疱疹病毒、牛痘病毒和副黏液病毒等。仙台病毒（HAJ）是两层磷脂组成的外膜包裹着R

10、NA与蛋白质的复合体。因HAJ病毒毒力弱，易被灭活而常采用。缺点：要提前大量培养病毒，并且灭活后才能作为融合剂使用，操作繁琐，而且一旦灭活不充分的话，病毒还可能感染操作者与亲本细胞。因此，目前已经很少使用病毒诱导法进行细胞融合。（1）足够量的病毒颗粒附着在细胞膜上起搭桥作用，使细胞聚集在一起。（2）通过病毒与原生质体或细胞膜的作用使两个细胞膜间相渗透，胞质互相融合。粘结部位质膜被破坏，不同细胞间形成通道，细胞质流通并融合（病毒也随之进入细胞质）。（3）有丝分裂，细胞核融合，形成杂种细胞。2 化学法 可以采用的化学诱导剂包括： NaNO3、高pH的高浓度Ca2+离子、聚乙二醇 （PEG）、溶菌酶

11、、明胶、抗体、植物凝血素伴刀豆球蛋白A等。 细胞膜电荷平衡被打破。离子、聚乙二醇（1）NaNO3诱导融合1909年，凯斯特（Kuster）发现机械分离的发生了质壁分离的洋葱表皮细胞原生质体在NaNO3溶液中可以恢复并伴随着细胞融合。1972年，卡尔森（Carlson）利用NaNO3诱导融合了粉兰烟草和郎氏烟草原生质体，培育出世界第一株体细胞杂种。NaNO3的钠离子可以中和原生质体表面负电荷，引起原生质体聚集，促进细胞融合。NaNO3对原生质体无损害，但融合效率低，一般小于4%。（2）高pH的高浓度Ca2+离子诱导融合1973年，凯勒（Keller）和梅尔切斯（Melchers）发现采用强碱性（

12、例如pH10.5）的高浓度钙离子溶液（50mmol/LCaCl22H2O）在37下处理两个品系的烟草叶肉原生质体，很容易促使融合，融合率可以达到10%。 钙离子中和原生质体膜或细胞膜表面电荷，使彼此紧密接触，决定质膜的稳定性和可塑性；高pH能改变质膜的表面电荷，利于细胞融合。（3）PEG诱导聚乙二醇(Polyethylene glycol,PEG)是一种多聚化合物，分子式为H(OHCH2-CH2)nOH)。常用的PEG平均分子量在20020,000之间，分子量1,000以下者为液体，1,000以上者为固体。PEG分子具有轻微的负极性，可以与具有正极性基团的水分子、蛋白质、碳水化合物形成氢键，在

13、相邻的原生质体间起到分子桥的作用，使原生质体接触。当PEG分子被洗脱时，膜电荷发生紊乱而重新分配。此时，一种原生质体上带正电的基团可能与另外一个原生质体中带负电的基团相连，导致原生质体融合。（4）高Ca2+和pH诱导PEG结合诱导 在高Ca2+和pH溶液的作用下，将与质膜结合的PEG分子洗脱，将进一步加剧电荷平衡失调，从而提高融合的几率。因此，PEG结合高pH的高浓度Ca2+离子诱导融合方法成为一种较常用的细胞融合方法 优点：基于PEG的诱导融合优点是融合成本低，勿需特殊设备；融合子产生的异核率较高；融合过程不受物种限制。 缺点：是融合过程繁琐，PEG可能对细胞有毒害。细胞融合例子1甘蓝与大白

14、菜的化学诱导融合3 物理法电融合诱导法（Electrofusion）：利用电场来诱导细胞彼此连接成串，再施加瞬间强脉冲促使质膜发生可逆性电击穿，促进细胞融合的技术。原理：在直流电脉冲的刺激下，细胞膜或原生质体质膜表面的电荷和氧化还原电位发生改变，使异种细胞或原生质体粘合并发生质膜瞬间破裂，进而连接，直到闭和成完整的膜形成融合体。优点：融合率高、重复性与可控制性强。缺点：可能会造成不可恢复的细胞损伤。BLS细胞融合仪（1）聚集：在直流电脉冲的诱导下，极化产生偶极子，彼此靠近，定向排列成串球状。（2）细胞膜融合：在直流电脉冲的诱导下，原生质体膜两侧产生电势，正负电荷相吸，细胞膜变薄，触发膜的穿孔（

15、质膜瞬间破裂）。（3）异核体：膜之间形成通道，细胞质等得以交换、融合。（4）融合细胞：细胞核融合。细胞融合举例2薄荷的电诱导融合亲本：E33、E47两个薄荷亲本原生质体（5-9105），0.7M山梨醇。仪器：Eppendorf电转仪、融合杯（-250微升，-50微升）观察：DAPI染色：4，6-联脒-2-苯基吲哚是一种常用的荧光染料，与DNA的双链紧密结合。结合后产生的荧光基团的吸收峰是358 而散射峰是461nm，正好UV（紫外光）的激发波长正好是356nm。染色标记细胞核的位置。参数： 电压：1.5-3V，超过2V破裂，选1.5V。脉冲电压：0-300V。脉冲时间：30-60S，每次增加1

16、0S，40S最佳。六 融合细胞筛选 因融合的随机性而成为细胞融合的关键而必需的技术。 1筛选的原因与必要性 细胞融合是一个随机的物理过程，经融合后细胞将以多种形式出现，需要通过培养和筛选，除去不需要的细胞，分离出需要的杂种细胞，从而解决融合细胞的选择问题。 问题：A与B融合过程中，你能预见有哪些 形式的细胞吗？ A-B，A-A，B-B， A-A-A，B-B-B，A-A-B,B-B-A等多聚体。 未融合的A，B。2杂种细胞筛选方法（1）细胞形态大小差异（2）选择性培养基筛选法：利用原生质体对培养基成分要求与反应的差异选择杂种细胞的方法。例如：利用抗性标记、酶缺陷型、激素需求差异等。亲本原生质体生长要求外源激素，而有的杂种细胞由于双亲互补作用会产生内激素，从而使杂种细胞能在无激素的培养基上生长。（3）再生后杂种与亲本形态、性质差异细胞融合例子3：利用抗性标记进行第二部分体细胞杂交及其在育种中的应用一 体细胞杂交育种的意义1利于克服有性不亲和性，实现远源遗传重组。2问题：与基因工程改造相比有什么优点？植物的抗逆性多为多基因控制，因此易于实现多基因控制性状。 3利于实现细胞质遗传形状的重组。