引物设计原则及PP50设计软件

1、引物设计原则及设计引物设计原则及设计软件软件引物（primers) 引物是人工合成的两段寡核苷酸序列，一个引物与感兴趣区域一端的一条DNA模板链互补，另一个引物与感兴趣区域另一端的另一条DNA模板链互补。3355Sense primerAntisense primerSense primerAntisense primer选择模板序列保守区域选择模板序列保守区域1、引物设计原则 引物长度 碱基分布的均衡性 Tm值 引物二级结构 引物3端 引物5端 引物的内部稳定性 自由能分布引物长度 一般引物的长度为15-30 bp，常用的长度为18-21bp。过长或过短都不合适，为过长会导致其延伸温度大于7

2、4，不适于Taq DNA聚合酶进行反应，长度大于24 核苷的引物并不意味着更高的特异性，而且比短序列杂交慢，从而降低了产量。引物过短会引起错配现象，一般来说引物长度大于16bp是必要的（18bp的序列在人类基因组中只会出现一次）。决定引物退火温度（决定引物退火温度（Tm值）最重要的因素就是引物的长度值）最重要的因素就是引物的长度Tm =（g + C）* 4 +（a + T）* 2 同一碱基连续出现不应超过5个 GC含量一般40-60%，以45-55为宜 GC含量太低导致引物Tm值较低，使用较低的退火温度不利于提高PCR的特异性 GC含量太高也易于引发非特异扩增。碱基分布的均衡性有一些模板本身的

3、有一些模板本身的GC 含量偏低或偏高，导致引物的含量偏低或偏高，导致引物的GC含量不能在上述范围含量不能在上述范围内，这时应尽量使上下游引物的内，这时应尽量使上下游引物的GC 含量以及含量以及Tm 值保持接近值保持接近（上下游引物的（上下游引物的GC含量不能相差太大）含量不能相差太大），以有利于退火温度的选择。，以有利于退火温度的选择。引物Tm值 一般要求：55-65。 应尽可能保证上下游引物Tm值一致，一般差异控制在2 以内。 （引物的退火温度相差小于5一般不会影响PCR的产率，理想情况下一对引物的退火温度是一样的，可以在5580间变化，有说接近72为最佳） 上下游引物Tm值与产物Tm值一般

4、应控制在20 以内。 一般采用较低引物Tm值-5作为PCR退火温度。一对引物的一对引物的GC含量和含量和Tm值应该协调。若是引物存在严重的值应该协调。若是引物存在严重的GC倾向或倾向或AT倾向则可以倾向则可以在引物在引物5端加适量的端加适量的A、T或或G、C尾巴。若尾巴。若G+C含量太低，可在含量太低，可在5端加上一些端加上一些G或或C，若若GC含量太高，可在含量太高，可在5端加上一些端加上一些A或或T。引物二级结构 引物二聚体（引物间不应多于4个连续碱基的同源性或互补性 ） 尽可能避免两个引物分子之间3端有较多碱基互补 发夹结构（引物自身连续互补碱基不能大于3bp ） 尤其是要避免引物3端形

5、成发夹结构，否则将严重影响DNA聚合酶的延伸。（两项结构的能值以不超过4.5为好，引物中间或5端可适当放宽）两引物之间不应该存在互补性，尤应避免两引物之间不应该存在互补性，尤应避免3端的互补重叠以防引物二聚体的形成。一端的互补重叠以防引物二聚体的形成。一般情况下，一对引物间不应多于般情况下，一对引物间不应多于4个连续碱基的同源性或互补性。个连续碱基的同源性或互补性。引物3端 引物的延伸从3端开始，因此3端的几个碱基与模板DNA均需严格配对，不能进行任何修饰，否则不能进行有效的延伸，甚至导致PCR扩增完全失败。 引物3端的碱基一般不用A（3端碱基序列最好是G、C、CG、GC）。另外引物间3端的互

6、补、二聚体或发夹结构也可能导致PCR反应失败。3端的连续端的连续3 3个个G 或或C ，如如GGG或或CCC，会导致引物在会导致引物在G+CG+C富集序列区错误富集序列区错误引发引发引物5端 引物5端可以有与模板DNA不配对碱基（对对PCR 影响不影响不大）大），常在5端引入修饰位点或标记物。 5端加上限制性核酸内切酶位点序列（酶切位点5端加上适当数量的保护碱基）。 5端的某一位点修改某个碱基，人为地在产物中引入该位点的点突变以作研究。 5端标记放射性元素或非放射性物质（如生物素、地高辛等）。双酶切位点，有利于定向克隆，2-3个保护碱基，一般加CG。计算引物Tm 值时并不包括这些序列，但是应该

7、对其进行互补性和内部二级结构的检测。 引物的内部稳定性 过去认为，引物3端应牢牢结合在模板上才能有效地进行延伸，故3端最好为G或C。 现在的观点认为，引物的5端应是相对稳定结构，而3端在碱基配对的情况下最好为低稳定性结构，即3端尽可能选用A或T（有说不适宜用A），少用G或C。 若模板不很清楚，引物若模板不很清楚，引物3端最后一个碱基最好为端最后一个碱基最好为T，其次是其次是G或或C，而而不选不选A，国外资料表明，当末位为国外资料表明，当末位为T时，即使在错配的情况下也能引发链的时，即使在错配的情况下也能引发链的合成，而末位为合成，而末位为A时，错配时引发大大降低，时，错配时引发大大降低，G G

8、或或C居中，可见，模板很清居中，可见，模板很清楚时选楚时选A可以提高特异性可以提高特异性。自由能分布G 值是指DNA 双链形成所需的自由能，该值反映了双链结构内部碱基对的相对稳定性（结合的强弱程度结合的强弱程度）。一般情况下，引物的G值最好呈正弦曲线形状，即5端和中间G值较高，而3端G值相对较低，且不要超过9 （绝对值，一般考虑末端5个碱基的G。此值的大小对扩增有较大的影响，负值大，则3末端稳定性高，扩增效率更高，同时也更易于异位引发。因此在复杂模板的扩增体系中，3末端5聚体的G应大于-9.0kcal/mol） ，如此则有利于正确引发反应而可防止，如此则有利于正确引发反应而可防止错误引发。错误

9、引发。引物的3端的G 值过高，容易在错配位点形成双链结构并引发DNA 聚合反应。（能值越高越容易结合能值越高越容易结合）33末端双链的末端双链的GG是是0 02 2 kcal/molkcal/mol时，时，PCRPCR产量几乎达到百分之百，随产量几乎达到百分之百，随着其绝对值的增加产量逐渐下降，在着其绝对值的增加产量逐渐下降，在6 6时只有时只有40%40%、到、到8 8时少于时少于20%20%、而、而1010时接近于时接近于0 0。引发效率（引物唯一性） 选用的引物序列就应当是唯一的，即在模板中没有重复序列 好的设计工具会提供一个引物异位引发的评价指标，好的设计工具会提供一个引物异位引发的评

10、价指标，如如Oligo 6.0 Oligo 6.0 的的false priming efficiencyfalse priming efficiency，即异位引发即异位引发效率，这个值是由程序根据引物自身二级结构的能量、错效率，这个值是由程序根据引物自身二级结构的能量、错配的类型、错配离配的类型、错配离33末端的距离等因素综合计算而得出，末端的距离等因素综合计算而得出，当此值大于当此值大于200200时便很有可能引发扩增。如所用工具无量时便很有可能引发扩增。如所用工具无量化指标，则可依据经验，当引物与模板在非预期位置退火，化指标，则可依据经验，当引物与模板在非预期位置退火，超过超过70%70

11、%的碱基能互补配对，或引物的碱基能互补配对，或引物3 3末端连续末端连续8 8个或以个或以上碱基配对，则认为有引发的可能。上碱基配对，则认为有引发的可能。2、引物设计软件、引物设计软件 Oligo 6 （引物评价）* Primer Premier （自动搜索）* Vector NTI Suit （综合分析） Primer Express(实时定量PCR引物和探针设计) Omiga Dnastar Primer3 （在线服务）*3、同源序列比较、同源序列比较 NCBINCBI的的BLASTBLAST; ExPASy的Alignment GeneDoc 3.2 Clustal X Vector N

12、TI Omiga，Bioxm ，LaserGene，pcgene等引物同源性分析 用BlastBlast软件进行同源性比较 尽可能选择与非目的基因同源性小的序列作为引物 选择3端与非目的基因不同源的序列作为引物 选择两个引物3端与同一非目的基因不同源的序列作为引物参数设置默认引物长度 - 默认值为25引物对搜索最大值 - 默认值为100核酸浓度 -默认值为250 pM单价离子浓度 - 默认值为50 mM游离Mg2+离子浓度 - 默认值为1.5 mM评分参数Rating parameters 评分参数窗口是用来设定二级结构在引物评分中的权重系数二级结构越稳定引物评分就会越低相对于在引物中间形成的

13、二级结构来说3 末端的二级结构对PCR扩增的影响会更大为了将这一效应计算在内软件将3 末端的二级结构的自由能数值G减去1 这一修正会使3 末端的二级结构显得更加稳定参数设置载入序列Preimer Premier 启动界面Load sequence粘贴序列窗口这一窗口使得一段核酸序列通过选择以四种不同的方式粘贴上去（CTRL-V）基本信息Sequence nameOriginal sequenceUse these two button to translate the DNA seq to a protein seq or a protein seq to a DAN seq 8种密码子偏好Choose a function 引物设计界面First you can design the primer manuallySense st