3,5二硝基水杨酸(DNS)法测定还原糖

1、3,5-二硝基水杨酸比色法标准曲线的制作1.实验原理还原糖的测定是糖定量测定的基本方法。还原糖是指含有自由醛基或酮基的糖类，单糖都是还原糖，双糖和多糖不一定是还原糖，其中乳糖10257RP麦芽糖是还原糖，蔗糖和淀粉是非还原糖。COOE还原糖在碱性条件下加热被氧化成糖酸及其它产物，3,5-二硝基水杨酸则被还原为棕红色的3-氨基-5-硝基水杨酸。在一定范围内，还原糖的量与棕红色物质颜色的深浅成正比关系，利用分光光度计，在540nm波长下测定光密度值，查对标准曲线并计算，便可求出样品中还原糖和总糖的含量。由于多糖水解为单糖时，每断裂一个糖苷键需加入一分子水，所以在计算多糖含量时应乘以0.9。加热还惊

2、糖»碱tt2实验材料、主要仪器和试剂2.1实验材料主要用到这些实验材料：红曲黄色素发酵液、钠虑膜浓缩后红曲黄色素液、旋转蒸发后红曲黄色素液。2.2主要仪器本实验用到的实验仪器有:1) 具塞玻璃刻度比色管：25mLxl9；2) 烧杯：100mLx4；3) 二角瓶：lOOmLxl；4) 容量瓶：100mLx3,50mLx3；5) 刻度吸管：1mLx4；2mLx3；lOmLxl；6) 沸水浴；7)冰浴；8)扭力天平；9)UV2802SH型紫外可见分光光度计尤尼柯(上海)仪器有限公司；2.3实验试剂1) lmg/mL葡萄糖标准液准确称取8O°C烘至恒重的分析纯葡萄糖lOOmg,置于

3、小烧杯中，加少量蒸馏水溶解后，转移到lOOmL容量瓶中，用蒸馏水定容至lOOmL,混匀，4C冰箱中保存备用。2) 3,5-二硝基水杨酸(DNS)试剂将6.3gDNS和262mL2MNaOH溶液，加到500mL含有l85g酒石酸钾钠的热水溶液中，再加5g结晶酚和5g亚硫酸钠，搅拌溶解，冷却后加蒸馏水定容至lOOOmL，贮于棕色瓶中备用。3实验步骤制作葡萄糖标准曲线取7支25mL具塞刻度试管编号，按表l分别加入浓度为lmg/mL的葡萄糖标准液、蒸馏水和3,5-二硝基水杨酸(DNS)试剂，配成不同葡萄糖含量的反应液。表1葡萄糖标准曲线制作管号1mg/mL葡萄糖标准液蒸馏水(mL)DNS(mL)葡萄糖

4、含量(mg)光密度值(OD540nm)(mL)0021.5010.21.81.50.220.41.61.50.430.61.41.50.640.81.21.50.851.01.01.51.061.20.81.51.2将各管摇匀，在沸水浴中准确加热5min，取出，冰浴冷却至室温，用蒸馏水定容至25mL，加塞后颠倒混匀，在分光光度计上进行比色。调波长540nm,用0号管调零点，测出16号管的光密度值。以光密度值为纵坐标，葡萄糖含量(mg)为横坐标，做出标准曲线。蒽酮比色法测糖一 目的掌握蒽酮比色法测糖的原理和方法二 原理蒽酮比色法是一个快速而简便的定糖方法。蒽酮可以与游离的已糖或多糖中的已糖基、戊

5、糖基及已糖醛酸起反应，反应后溶液呈蓝绿色，在620nm处有最大吸收。本法多用于测定糖原的含量，也可用于测定葡萄糖的含量。三 实验器材及试剂马铃薯干粉可调试移液器或移液管可见分光光度计(723型)电子分析天平水浴锅电炉子蒽酮试剂：取2g蒽酮溶解到80%H2SO4中，以80%H2SO4定容到1000ml,当日配制使用。标准葡萄糖溶液(0.1mg/ml)：100mg葡萄糖溶解到蒸馏水中，定容到1000ml备用。四、操作1. 制作标准曲线取7支干燥洁净的试管，按表1顺序加入试剂，进行测定。以吸光度值为纵坐标，各标准溶液浓度（mg/ml）为横坐标作图得标准曲线。表1蒽酮比色法定糖标准曲线的制作沸水浴中准

6、确煮沸lOmin,取出用流水冷却，室温放lOmin,于620nm处比色葡萄糖浓度（mg/ml）2. 样品含量的测定样品液的制作：精确称取马铃薯干粉O.lg置于锥形瓶中加入30ml沸水沸水浴30min（不时摇动）取出，3000rpm离心lOmin（或过滤）反复洗涤残渣2次合并滤液冷却至室温定容到50ml的锥形瓶中再从中取出1ml,再定容到10ml的容量瓶中样品液的测定：（1）取4支试管，按照表2加样（加蒽酮时需要冰水浴5min冷却）表2蒽酮比色法定糖样品的测定（2）加样冷却完成后置沸水中煮沸lOmin,取出流水冷却放置lOmin,620nm处比色测量各管OD值。（3）以l号试管作为调零管，2、3

7、、4号管的OD值取平均后从标准曲线上查出样品液相应的含糖量。3结果计算：CxVxlOO%m，式中W：糖的质量分数（）C：从标准曲线中查出的糖质量分数（mg/ml）V：样品稀释后的体积（ml）m：样品的质量（ml）一 目的掌握蒽酮比色法测糖的原理和方法二 原理蒽酮比色法是一个快速而简便的定糖方法。蒽酮可以与游离的已糖或多糖中的已糖基、戊糖基及已糖醛酸起反应，反应后溶液呈蓝绿色，在620nm处有最大吸收。本法多用于测定糖原的含量，也可用于测定葡萄糖的含量。三 实验器材及试剂马铃薯干粉可调试移液器或移液管可见分光光度计（723型）电子分析天平水浴锅电炉子蒽酮试剂：取2g蒽酮溶解到80%H2SO4中，

8、以80%H2SO4定容到1000ml,当日配制使用。标准葡萄糖溶液（0.1mg/ml）：100mg葡萄糖溶解到蒸馏水中，定容到1000ml备用。四、操作1. 制作标准曲线取7支干燥洁净的试管，按表1顺序加入试剂，进行测定。以吸光度值为纵坐标，各标准溶液浓度（mg/ml）为横坐标作图得标准曲线。表1蒽酮比色法定糖标准曲线的制作沸水浴中准确煮沸10min,取出用流水冷却，室温放10min,于620nm处比色葡萄糖浓度（mg/ml）2. 样品含量的测定样品液的制作：精确称取马铃薯干粉0.1g置于锥形瓶中一-加入30ml沸水一-沸水浴30min（不时摇动）一一取出，3000rpm离心10min（或过滤

9、）反复洗涤残渣2次合并滤液冷却至室温定容到50ml的锥形瓶中再从中取出1ml,再定容到10ml的容量瓶中样品液的测定：（1）取4支试管，按照表2加样（加蒽酮时需要冰水浴5min冷却）表2蒽酮比色法定糖样品的测定（2）加样冷却完成后置沸水中煮沸10min,取出流水冷却放置10min,620nm处比色测量各管0D值。（3）以1号试管作为调零管，2、3、4号管的0D值取平均后从标准曲线上查出样品液相应的含糖量。3结果计算：CxVw=x100%m，式中W:糖的质量分数（）C：从标准曲线中查出的糖质量分数（mg/ml）V:样品稀释后的体积（ml）m：样品的质量（ml）原理植物在个体发育的各个时期，代谢活

10、动也发生相应的变化，碳水化合物的代谢也不例外，其含量也随之发生变化。了解可溶性糖含量的变化，在生理上和实践上都有重要的意义。这里介绍的是蒽酮比色法，糖在硫酸的作用下生成糖醛，糖醛再与蒽酮作用，形成一种绿色的络合物，颜色的深浅与糖含量有关。方法简便，但没有志一性，对于绝大部分的碳水化合物都能与蒽酮反应，产生颜色。仪器药品721型分光光度计分析天平研钵恒温水浴锅烧杯容量瓶三角烧瓶大试管移液管漏斗乙醚草酸钠饱和醋酸铅葡萄糖标准溶液：称取已在80°C烘箱中烘至恒重的葡萄糖100mg,配制成500ml溶液，即得每ml含糖为200pg的标准溶液。蒽酮试剂：称取1g经过纯化的蒽酮，溶解于1000m

11、l稀硫酸中即得。硫酸溶液由760ml浓硫酸（比重1.84）稀释成1000ml而成。操作步骤1可溶性糖的提取称取重约5g的新鲜植物叶子，于研钵中乙醚少许，仔细研磨成均匀的浆状物，倒入烧杯中，用70C热水洗涤研钵，洗液并入烧杯中，再加蒸镏水3040ml。将烧杯放在水浴锅中加热，保持温度70-80C约半小时，冷却后1滴1滴地加入饱和中性醋酸铅，以除去蛋白质，直至加入醋酸铅时不再形成白色沉淀为止。然后将此混合物连同残渣一并洗入100ml容量瓶中，加水至刻度，充分振荡。以干燥漏斗将滤液过滤于一干燥的三角烧瓶中，瓶中事先放有少量（约0.20.4g）草酸钠粉末，以除去滤液中过量的醋酸铅，使生成草酸铅沉淀，再

12、行过滤，所得的透明滤液即为可溶性糖提取液。2显色及比色吸取上述糖提取液1ml,放入一干洁的试管中，加蒽酮试剂5ml混合之，于沸水浴中煮沸10分钟，取出冷却，然后于分光光度计上进行测定，波长为625nm,测得吸光度。从标准曲线上查得滤液中的糖含量（或经直线回归公式计算），然后再行计算样品中含糖百分数。3绘制标准曲线取标准葡萄糖溶液将其释成一系列不同浓度的溶液，浓度分别为每ml含糖0、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100pg。按上述方法分别测得其吸光度，然后绘制A026糖浓度曲线，或进行直线回归求得直线方程。4计算样品中含糖%设V为植物样品稀释后的体积（ml）C为提取液

13、的含糖量（pg/ml）W为植物组织鲜重（g）则得计算式如下：=CxV/（WJ000000）"00%编辑本段蒽酮比色法测定多糖含量a多糖含有几百个或更多残基，但只有一个还原基团，因此它的还原能力极弱，对于他们的测定，应先将它们用酸水解成单糖组分。蒽酮比色法是一种快速而简便的定糖方法，糖类遇浓硫酸脱水生成糠醛及其衍生物，该衍生物与蒽酮发生反应，反应后溶液呈蓝绿色，于620nm处有最大吸收。因此可用此方法测定多糖含量。b试剂2g/L蒽酮试剂：溶解2g蒽酮于1L浓硫酸（98%的浓硫酸）中，当日配制使用。0.01g/L葡萄糖溶液（可加几滴甲苯作防腐剂）0.1g/L糖元溶液c实验器材试管及试管架

14、吸量管（1ml,5ml）恒温水浴箱（100°C）制冰机紫外分光光度计滴管白瓷板制作标准曲线准确称取0.1g葡萄糖（分析纯），溶解并用蒸馏水定容至100ml后，分别取出1ml,2ml,3ml,4ml,5ml分别加入到50的容量瓶中，并用蒸馏水定容到50ml，配成浓度分别为20ug/ml,40ug/ml,60ug/ml,80ug/ml,100ug/ml,各取1ml于试管中，再加入3ml的蒽酮试剂，迅速浸入冰水中冷却，待几支试管均匀加完后，一起浸入100r恒温水浴箱中，为防止水分蒸发，应在试管口上加盖一个玻璃球或者加一个塞子，自温度重新升至100°C起计时，准确保温10min后取出，用流动水冷却，然后，于室温中平衡片刻（约10min左右），在分光光度计上，波长620nm处，用0.5cm厚度的比色杯，以空白管做对照空白（此处的空白是指不加葡萄糖的蒽酮试剂，其他反应条件都一致），进行比色。既得标准曲线。如下表格编号123456体积ml012345浓度ug/ml020406080100d样品测定如上述条件一致，但要记得用除去蛋白质的样品溶液进行测定，否则会影响测定结果