柱色谱分离快与速柱层析

1、柱色谱分离及快速柱层析色谱柱色谱分离及快速柱层析色谱 Column Chromatographic Separation & Flash Chromatography杜亚伟杜亚伟1595292015-2016学年学年 现代分离工程现代分离工程 课堂汇报课堂汇报化学分离工程（化学工程二级学科）化学分离工程（化学工程二级学科）三级学科三级学科 蒸馏 吸收 萃取 吸附与离子交换 膜分离 蒸发与结晶 干燥 分离过程分类分离过程分类 有相产生或添加的分离过程 蒸馏、萃取、结晶、干燥 有分离介质的分离过程 渗透、微滤、超滤、渗析 采用固体分离剂的分离过程 吸附、色谱分离、离子交换 有外加场的分离过

2、程 离心、电解、电泳、电渗析 色谱分离法分类色谱分离法分类按两相状态按两相状态气相色谱液相色谱超临界流体色谱按分离机理按分离机理吸附色谱分配色谱离子交换色谱排阻色谱按固定相外形按固定相外形薄层色谱柱色谱纸色谱按分离效率按分离效率经典液相色谱高效液相色谱色谱法是一种重要的分离分析方法，它是根据组分在两相中作用能力不色谱法是一种重要的分离分析方法，它是根据组分在两相中作用能力不同而达到分离目的的。同而达到分离目的的。色谱流出曲线色谱流出曲线色谱流出曲线色谱流出曲线：由检测器输出的信号强度对时间作图，所得曲线。色谱峰色谱峰：色谱流出曲线上突起部分。基线基线：色谱柱没有样品组分流出时的流出曲线。峰高峰

3、高：色谱峰顶点与基线之间的垂直距离。从色谱流出曲线中，可得许多重要信息：从色谱流出曲线中，可得许多重要信息：(1) 根据色谱峰的个数，可以判断样品中所含 组分的最少个数；(2) 根据色谱峰的保留值，可以进行定性分析；(3) 根据色谱峰的面积或峰高，可以进行定量分析；(4) 色谱峰的保留值及其区域宽度，是评价色谱柱分离效能的依据；(5) 色谱峰两峰间的距离，是评价固定相（或流动相）选择是否合适的依据。1.标准偏差标准偏差 即0.607倍峰高处色谱峰宽的一半。2.半峰宽半峰宽Y1/2:即峰高一半处对应的峰宽。它与标准偏差的关系为 Y1/2=2.3543.峰底宽度峰底宽度Y:即色谱峰两侧拐点上的切线

4、在基线上截距间的距离。它与标准偏差的关系是 Y = 4 色谱分离中的重要参数色谱分离中的重要参数死时间死时间tM：不被固定相吸附或溶解的物质进入色谱柱时，从进样到出现峰极大值所需的时间称为死时间，它正比于色谱柱的空隙体积。 因为这种物质不被固定相吸附或溶解，故其流动速度将与流动相流动速度相近。测定流动相平均线速时，可用柱长L与tM的比值计算，即 = L/tM保留时间保留时间tR：试样从进样到柱后出现峰极大点时所经过的时间，称为保留时间。某组分的保留时间扣除死时间后，称为该组分的调整保留时间调整保留时间 tR。 tR= tR tM 信号进样tMtRtR色谱分离的热力学性质色谱分离的热力学性质 分

5、配色谱的分离是基于样品组分在固定相和流动相之间反复多次的分配过程，而吸附色谱的分离是基于反复多次的吸附-脱附过程。 这种分离过程经常用样品分子在两相间的分配来描述，而描述这种分配的参数称为分配系数K。它仅与两个变量有关：固定相和温度固定相和温度。K = 溶质在固定相中的浓度溶质在固定相中的浓度/溶质在流动相中的浓度溶质在流动相中的浓度 = Cs / Cm 分配比又称容量因子，它是指在一定温度和压力下，组分在两相间分配达平衡时，分配在固定相和流动相中的物质的量比。即k = 组分在固定相中的物质的量组分在固定相中的物质的量/组分在流动相中的物质的量组分在流动相中的物质的量 = ns / nm k

6、= ns / nm =CsVS / CmVmVm为柱中流动相的体积，近似等于死体积;Vs为柱中固定相的体积 对A、B两组分的选择因子，用下式表示：= tR(A) / tR(B) = k(A) / k(B)= K(A) / K(B) 通过选择因子把实验测量值k与热力学性质的分配系数K直接联系起来，对固定相的选择具有实际意义。 两组分的两组分的K K或或k k值相差越大，则分离得越好。因此两组分具有不同的分配系数是值相差越大，则分离得越好。因此两组分具有不同的分配系数是色谱分离的先决条件。色谱分离的先决条件。塔板理论塔板理论 把色谱柱比作一个精馏塔，沿用精馏塔中塔板的概念来描述组分在两相间的分配行

7、为，同时引入理论塔板数作为衡量柱效率的指标，即色谱柱是由一系列连续的、相等的水平塔板组成。每一块塔板的高度用H表示，称为塔板高度，简称板高。 塔板理论假设：1. 在柱内一小段长度H内，组分可以在两相间迅速达到平衡。这一小段柱长称为理论塔板高度H。2. 以气相色谱为例，载气进入色谱柱不是连续进行的，而是脉动式，每次进气为一个塔板体积（Vm）。3. 所有组分开始时存在于第0号塔板上，而且试样沿轴（纵）向扩散可忽略。4. 分配系数在所有塔板上是常数，与组分在某一塔板上的量无关。理论塔板高度越低，在单位长度色谱柱中就有越高的塔板数，则分离效果就越好。决定理论塔板高度的因素有：固定相的材质、色谱柱的均匀

8、程度、流动相的理化性质以及流动相的流速等。 塔板理论是基于热力学近似的理论，在真实的色谱柱中并不存在一片片相互隔离的塔板，也不能完全满足塔板理论的前提假设。塔板理论虽然能很好地解释色谱峰的峰型、峰高，客观地评价色谱柱地柱效，却不能很好地解释与动力学过程相关的一些现象，如色谱峰峰型的变形、理论塔板数与流动相流速的关系等。 塔板理论塔板理论速率理论速率理论 1956年荷兰学者van Deemter吸收了塔板理论中板高的概念，并充分考虑了组分在两相间的扩散和传质过程，从而在动力学基础上较好地解释了影响板高的各种因素。该理论模型对气相、液相色谱都适用。 van Deemter液液色谱方程： 简化方程为

9、： H = A + B / u + C u u为流动相的线速度；A、B、C为常数，分别代表涡流扩散系数、分子扩散项系数、传质阻力项系数。uDdDdDduDdHsfsmpsmmpmmp)(22222速率理论速率理论涡流扩散项涡流扩散项 A 在填充色谱柱中，当组分随流动相向柱出口迁移时，流动相由于受到固定相颗粒障碍，不断改变流动方向，使组分分子在前进中形成紊乱的类似涡流的流动，故称涡流扩散。涡流扩散。 由于填充物颗粒大小的不同及填充物的不均匀性，使组分在色谱柱中路径长短不一，因而同时进色谱柱的相同组分到达柱口时间并不一致，引起了色谱峰的变宽。色谱峰变宽的程度由下式决定： A = 2dp dp-填充

10、物的平均直径的大小 -填充不规则因子有关分子扩散项分子扩散项 B / u （纵向扩散项）纵向扩散项） 纵向分子扩散是由浓度梯度造成的。组分从柱入口加入，其浓度分布的构型呈“塞子”状。它随着流动相向前推进，由于存在浓度梯度，“塞子”必然自发的向前和向后扩散，造成谱带展宽。分子扩散项系数为 B = 2 Dg -弯曲因子，填充柱 1 空心柱 = 1 Dg-组分在流动相中的扩散系数速率理论速率理论 相对分子质量大的组分Dg小，Dg反比于流动相相对分子质量的平方根，所以采用相对分子质量较大的流动相，可使B项降低； Dg随柱温增高而增加，但反比于柱压。 另外纵向扩散与组分在色谱柱内停留时间有关，流动相流速

11、小，组分停留时间长，纵向扩散就大。因此为降低纵向扩散影响，要加大流动相速度。速率理论速率理论传质阻力项传质阻力项 Cu 对于液液分配色谱，传质阻力系数（C）包含流动相传质阻力系数（Cm）和固定相传质系数（Cs），即 CCmCs 其中Cm又包含流动的流动相中的传质阻力流动相中的传质阻力和滞留的流动相中的传质滞留的流动相中的传质阻力阻力，即 m是由柱和填充的性质决定的因子； sm是一常数，它与颗粒微孔中被流动相所占据部分的分数及容量因子有关。 液液色谱中固定相传质阻力系数（固定相传质阻力系数（CsCs）可用下式表示：mpsmmpmmDdDdC22sfssDdC2快速柱层析色谱快速柱层析色谱- hi

12、gh-performance flash chromatography system 1978年W.C.Still等化学家提出了快速制备色谱这一概念，与传统的柱色谱相比该技术在“一闪间”就可以完成分离纯化，这就是flash一说的由来 Flash色谱的优势：省时 省力 省溶剂紫外检测易判断目标产物 减少点板次数A-触摸屏B-开关C-收集臂D-收集架E-收集托盘F-溶剂托盘G-色谱柱支架H-SNAP色谱柱I-检漏器J-漏液托盘K-样品装卸泵快速柱层析色谱结构快速柱层析色谱结构-Biotage isolera为例为例Flash柱的选择及上样方式柱的选择及上样方式硅胶目数 100200, 200300

13、, 300400 规格 4g、12g、20g、40g、80g、120g etc. 硅胶柱选择原则硅胶柱选择原则 一般柱子最大载样量为该柱子硅胶量的1/20，在实际的应用中还应根据各组份的分离程度和溶解性等来判断具体的上样量。 湿法上样湿法上样 一般样品的溶解性较好时可以采用湿法上样，湿法上样具有方便损失少的特点。但必须注意湿法上样的溶剂必须是淋洗剂中极性较小的溶剂或掺入百分比较少的极性溶剂，否则组份将很容易被洗脱下来。且溶剂量不宜超过柱体积的10%。干法上样干法上样 绝大多数的样品我们都采用干法上样，干法上样所要注意的是，硅胶量和规格的选择。硅胶量控制在是样品的12倍，硅胶规格选择上尽量和柱子

14、的目数一样的200300的硅胶，切记当样品比较难以拌匀拌干时请选择100200目硅胶，主要是因为当你拌样硅胶越多时整个柱子的压力就会上去，以免出现仪器过压现象。Flash正相色谱正相色谱Rf值与柱体积关系值与柱体积关系 选择极性和溶解性都较合适的展开剂，并使目标产物的Rf值保证在0.150.3左右为最好。 左图为某个组份点在某个Rf值出需要多少个CV（柱体积）的溶剂才能洗脱下来。 一般情况下我们在实际的flash应用中应用的柱体积都会多于这个数据，以保证产物的纯度。RfCV0.91.10.81.30.71.40.61.70.52.00.42.50.33.30.25.00.110.0Flash反

15、相柱反相柱 反相原则反相原则 反相填料是在硅胶基质上键合的诸如C4、C8、C18脂肪链的非极性填料。非极性或疏水性化合物被强烈保留，而极性样品被弱保留，更快的通过柱床。“反相”用来描述其色谱过程与正相色谱正好相反。 流动相的选择流动相的选择 常用的流动相为水和乙腈或水和甲醇，偶尔我们也会采用水和四氢呋喃。 在水相中我们一般都会滴加些弱酸弱碱，把整个体系调至偏酸偏碱，以保证组份能起峰。常用的弱酸弱碱是甲酸、三氟乙酸，氨水，碳酸氢铵等，所加的百分比一般与液质体系相同。 反相样品上样反相样品上样 一般采用液相湿法上样，常用溶剂包括水、甲醇、四氢呋喃、乙腈、NN-二甲基甲酰胺、二甲亚砜等。选择最良溶剂

16、溶解，100mg样品溶于1mL最佳。 以Biotage LS为例，最大压力可达15bar，配备750g和1500g硅胶量的SNAP专用分离柱，最多一次可分离超过150g样品；流速最高达到500mL/min，只需30分钟就可以分离多达几十克样品。中试级快速制备色谱中试级快速制备色谱Flash柱分离应用实例柱分离应用实例-1利用利用flashflash柱层析色谱与反相高效液相色谱对微囊藻素进行实验室级别纯化柱层析色谱与反相高效液相色谱对微囊藻素进行实验室级别纯化C. Edwards et al. / J. Chromatogr. A 734 (1996) 163-173前言前言 微囊藻素是由水华藻

17、在淡水以及海洋环境中产生的一类肝毒素类环多肽结构。其通过抑制真核细胞的蛋白磷酸酶在细胞生长、蛋白合成、糖原代谢以及肌肉收缩等方面扮演重要角色。 高效薄层色谱与高电压纸电泳仅能实现微囊藻素微克级别的提纯。其难度在于微囊藻素仅占海藻细胞干重的0.7%，且其极性范围较大。 该工作使用反相该工作使用反相flash柱从水华藻柱从水华藻细胞中提纯克级的微囊藻素。细胞中提纯克级的微囊藻素。微囊藻素结构C. Edwards et al. / J. Chromatogr. A 734 (1996) 163-173Flash柱分离应用实例柱分离应用实例-1实验部分实验部分（1）微囊藻素的萃取）微囊藻素的萃取 浓缩

18、的细胞浮渣物经过甲醇萃取、离心、萃取、旋干除溶剂得提取物。 提取物通过flash柱以提取物:甲醇:水（1:1:1.8）洗脱剂进行分离。（2）浓缩、纯化微囊藻素）浓缩、纯化微囊藻素 使用Biotage Flash 75 S system，压力为137.8107 Pa，97.5 cm 色谱柱内装载两种固定相：球形Hyperprep C18或不规则Bondapak C18填料。 流速：100 ml/min。 甲醇浓度0 - 100% 梯度洗脱。 238 nm分光光度计检测。 HPLC进行纯度分析。（ 3）去盐和浓缩）去盐和浓缩Flash柱分离应用实例柱分离应用实例-1C. Edwards et al

19、. / J. Chromatogr. A 734 (1996) 163-173Flash柱分离应用实例柱分离应用实例-1Microcystins are numbered and those previously characterised include 5=MC-LR. 8=MC-LY, 13=MC-LW and 14=MC-LF.C. Edwards et al. / J. Chromatogr. A 734 (1996) 163-173Flash柱分离应用实例柱分离应用实例-1Absorbance (238 nm) of fractions eluted from (a) Hyperp

20、rep C18 and (b) Bondapak C18 using a step gradient with proportion of methanol in increments of 10%C. Edwards et al. / J. Chromatogr. A 734 (1996) 163-173Flash柱分离应用实例柱分离应用实例-1C. Edwards et al. / J. Chromatogr. A 734 (1996) 163-173Flash柱分离应用实例柱分离应用实例-1根据各馏分成分，将馏分合并为3份。再用分析液相进行检测反相柱：Shandon Hyperprep

21、C18 流动相：0.1%乙酸铵（A）,乙腈（B）检测器：Waters 490检测器，238, 214 和 254 nm三波长 Method 1: fractions eluted from the flash column which were found to contain more polar microcystins were pooled to give fraction 1. The components were separated with a mobile phase A-B (80:20).Method 2: flash fractions containing mainl

22、y MCLR (5) were pooled to give fraction 2. This was separated using a mobile phase A-B (78:22) with a step increase to 25% B after 12 rain to ensure elution of MC-LY (8).Method 3: fractions containing the hydrophobic microcystins were pooled and separated using a mobile phase A-B (76:24) with a step

23、 increase to 30% B after 8 min.C. Edwards et al. / J. Chromatogr. A 734 (1996) 163-173Flash fractions were pooled to give three main fractions which were analysed by reversed-phase HPLC with diode-array detection: (a) fraction 1 containing predominantly an uncharacterised microcystin (2); (b) fracti

24、on 2 contained predominantly MC-LR (5) and MC-LY (8); (c) fraction 3 contained hydrophobic microcystins 12, 13, 14 and 15 and an uncharacterised microcystin (1).Flash柱分离应用实例柱分离应用实例-1C. Edwards et al. / J. Chromatogr. A 734 (1996) 163-173Analysis of purified MC-LR (5) by reversed-phase HPLC with diod

25、e-array detection showed a purity of 98%.Flash柱分离应用实例柱分离应用实例-1制备液相进一步分离制备液相进一步分离C. Edwards et al. / J. Chromatogr. A 734 (1996) 163-173Flash柱分离应用实例柱分离应用实例-2利用Flash层析色谱进行二乙烯三胺五乙酸（DTPA）中的乙脂成分的制备级分离J Radioanal Nucl Chem (2015) 305:329336J Radioanal Nucl Chem (2015) 305:329336前言前言 DTPA是一种在放射性事故造成人体内放射污染

26、时常用的促排剂。Ca-DTPA 和 Zn-DTPA被FDA批准进入战略国家储备（Strategic National Stockpile）防止职业辐射、核能事故、潜在核弹危机造成的体内放射污染。 临床发现，与对照组相比，注射DTPA和五取代-乙脂化DTPA（C2E5）的混合物可以降低50%肝脏钚含量；与两种制剂独立用药，混合物提高了30%的效果。基于C2E5针对人群开发更为高效迅速的口服和经皮渗透给药途径也被研究。 为了研究C2E5的酯键断裂行为，需要不同DTPA不同酯化物的标准品。所谓该工作通过C18Flash对DTPA值化物进行分离。Flash柱分离应用实例柱分离应用实例-2Flash柱填

27、料柱填料：孔径60 A、粒径4060 m，230400目的C18 键合硅胶不同的酸性条件下的酯化：不同的酸性条件下的酯化：Reaction 1：大量制备C2E1Reaction 2：大量制备C2E2Reaction 3：反应无盐酸参与，其他条件同Reaction 2，大量制备C2E3和C2E4Flash柱分离应用实例柱分离应用实例-2J Radioanal Nucl Chem (2015) 305:329336Reaction 1（A）和Reaction 2 （B）混合物HPLC分析，乙腈/水，有机相5%到95%线性梯度J Radioanal Nucl Chem (2015) 305:3293

28、36Reaction 1和Reaction 2 混合物flash柱分离后C2E1(C)和C2E2(D)，洗脱剂乙腈:水=25:75J Radioanal Nucl Chem (2015) 305:329336Reaction 3 混合物HPLC分析，乙腈/水，有机相5%到95%线性梯度J Radioanal Nucl Chem (2015) 305:329336Reaction 3混合物flash柱分离后的C2E3(B)和C2E4(C)，洗脱剂乙腈:水=25:75J Radioanal Nucl Chem (2015) 305:329336Flash柱分离应用实例柱分离应用实例-3Fitoterapia 82 (2011) 155161Flash柱分离应用实例柱分离应用实例-3比较Flash柱(0.1-10 bar