第五章细胞融合与单克隆技术

1、第五章第五章 细胞融合与单克隆抗体细胞融合与单克隆抗体 细胞融合（细胞融合（cell fusion)，又称体细胞杂交（somatic hybridiazation），是指两个或更多个相同或不同细胞通过膜 融合形成单个细胞的过程。一、细胞融合一、细胞融合（一一）、细胞融合的定义、细胞融合的定义 细胞融合实际上包含多个过程：首细胞融合实际上包含多个过程：首先是两个亲本细胞并列，以后膜组织局先是两个亲本细胞并列，以后膜组织局部破坏，最终形成包围融合细胞的连续部破坏，最终形成包围融合细胞的连续胞膜。融合细胞表现的特征性变化，有胞膜。融合细胞表现的特征性变化，有膜成分和胞质成分的交流以及细胞内电膜成分和

2、胞质成分的交流以及细胞内电导率的连续性。导率的连续性。细胞在融合过程中会发生下列细胞在融合过程中会发生下列主要变化主要变化： 呈致密状态的体细胞在促融合剂的作用下，呈致密状态的体细胞在促融合剂的作用下，细细胞膜胞膜的性质发生变化；的性质发生变化； 首先，出现细胞凝集现象；首先，出现细胞凝集现象；然后，部分凝集细胞之间的膜发生粘连；继而，融然后，部分凝集细胞之间的膜发生粘连；继而，融合形成多核细胞；合形成多核细胞； 在培养过程中多核细胞又进行在培养过程中多核细胞又进行核的融合核的融合而成为而成为单核的杂种细胞，而那些不能形成单核的融合细胞单核的杂种细胞，而那些不能形成单核的融合细胞在培养过程中逐

3、渐死亡。在培养过程中逐渐死亡。 由于体外培养的细胞很少会发生自发由于体外培养的细胞很少会发生自发融合（融合频率大约在融合（融合频率大约在10-410-6之间），之间），因此要采用生物、化学或物理的方法人为因此要采用生物、化学或物理的方法人为地促使细胞融合。地促使细胞融合。显微镜下细胞融合过程显微镜下细胞融合过程融合过程中两个细胞膜从彼此接触到破裂形成细胞桥的变化过程图解融合过程中两个细胞膜从彼此接触到破裂形成细胞桥的变化过程图解（二二）、细胞融合研究进展、细胞融合研究进展Muller于1838年观察到脊椎动的肿瘤细胞能在体内自发地融合产生多核的肿瘤细胞多核的肿瘤细胞。Virchow于1858年

4、描述了正常组织、发炎组织以及肿瘤组织中的多核细胞现象多核细胞现象。Luginbuhl于1873年观察到天花病人的血液中也有多核的血多核的血细胞细胞存在。Lange于1875年第一个观察到脊椎动物（蛙类）的血液细胞血液细胞发生融合的过程发生融合的过程。Cienkawski(1876)、Buck(1877)、Geddes(1880)在无脊椎动中发现了细胞合并现象细胞合并现象。1958年日本学者冈田（Okada）发现仙台病毒具有触发动物仙台病毒具有触发动物细胞融合的效应细胞融合的效应。1974年华裔加拿大学者高国楠创立了聚乙二醇（PEG）化学融合法。1975年Kohler和Milstein成功地融合

5、了小鼠B-淋巴细胞和骨髓瘤细胞而产生能分泌预定单克隆抗体的杂交瘤细胞。20世纪80年代出现了电融合技术。几种细胞融合成功的例子几种细胞融合成功的例子植物融合细胞植物融合细胞成长状态对比成长状态对比:右瓶右瓶为地面融为地面融合的细胞合的细胞;左瓶左瓶中为太空中为太空微重力环境下微重力环境下融合的细胞融合的细胞 动物细胞融合实验使用的小白鼠动物细胞融合实验使用的小白鼠 （三三）、动植物细胞的融合过程、动植物细胞的融合过程（四）（四）、细胞融合的意义、细胞融合的意义u理论上说任何细胞，都有可能通过体细胞杂交而成为新的生物资源新的生物资源。这 对于种质资源的开发和利用种质资源的开发和利用具有深远的意义

6、。u融合过程不存在杂交过程中的种性隔离机制的限制，为远缘物种远缘物种间 的遗传物质交换提供了有效途径。u体细胞杂交产生的杂种细胞含有来自双亲的核外遗传系统，在杂种的分 裂和增殖过程中双亲的线粒体DNA亦可发生重组，从而产生新 的核外遗传系统核外遗传系统。u淋巴细胞杂交瘤和单克隆抗体单克隆抗体的制备。二、二、单克隆抗体技术单克隆抗体技术主要组织相容性复合体（一一）、何谓单克隆抗体？、何谓单克隆抗体？ Ig 分子的基本结构：由四肽链组成的，二条相同的分子量较小的轻链（L 链）+二条相同的分子量较大的重链（H 链）组成的。 L链与H链是由二硫键连接形成一个四肽链分子，称为Ig分子的单体的基本结构。抗

7、体的主要类型与结构：抗体的主要类型与结构：抗体由四条抗体由四条蛋白质蛋白质长短链所组成（两长两短）长短链所组成（两长两短）抗体分子上有两个抗体分子上有两个 抗原结合区抗原结合区 （二者相同）（二者相同）抗体与抗原结合是抗体与抗原结合是 专一性专一性 的（的（lock & key）是单一抗体分子，另有是单一抗体分子，另有 IgA（二元体）及（二元体）及IgM（五元体）（五元体） IgG由由4条多肽组成条多肽组成(两条轻链和两条重键两条轻链和两条重键) ，通过二硫键和非共价键相连，其分子结构如通过二硫键和非共价键相连，其分子结构如“Y”型。一端为抗原结合端型。一端为抗原结合端(氨基端氨基端)可可变

8、区变区(V区区)，即氨基酸顺序随免疫的抗原不，即氨基酸顺序随免疫的抗原不同而异，有两个相同的能与抗原结合的部位。同而异，有两个相同的能与抗原结合的部位。另一端另一端(羧基端羧基端)氨基酸顺序排列比较恒定氨基酸顺序排列比较恒定恒定区恒定区(C区区)，可与具有，可与具有Fc受体的细胞相受体的细胞相结合结合(如巨噬细胞、如巨噬细胞、K细胞、肥大细胞等细胞、肥大细胞等)，分别产生不同的效应。分别产生不同的效应。IgG抗体结构模型抗体结构模型（红色部分为（红色部分为CDR区域）区域）一个抗原分子上通常含有数个一个抗原分子上通常含有数个抗原决定簇抗原决定簇每个决定簇至少都可诱生出一种专一性抗体每个决定簇至

9、少都可诱生出一种专一性抗体蛋白质性抗原决定簇含有六个以上氨基酸蛋白质性抗原决定簇含有六个以上氨基酸抗原决定簇抗原决定簇抗原分子上可以诱导出抗体的部位或片段，称之为抗原分子上可以诱导出抗体的部位或片段，称之为 antigenic determinant)或或 (epitope)。存在于抗原分子中决定抗原特异性的特殊化学基团，又称表位（epitope）。抗原决定簇的大小相当于相应抗体的抗原结合部位，一般由58个氨基酸、单糖或核苷酸残基组成。 抗体与抗原的特异性结合抗体与抗原的特异性结合 克隆定义克隆定义 只针对某一抗原决定只针对某一抗原决定簇簇的抗体分子称为单的抗体分子称为单克隆抗体。克隆抗体。

10、由同一抗原诱导而产生的针对多个抗原决由同一抗原诱导而产生的针对多个抗原决定定簇簇的抗体称为多克隆抗体。的抗体称为多克隆抗体。 单克隆抗体技术的核心是用骨髓瘤细胞(myeloma cell)与经特定抗源免疫刺激的B淋巴细胞(antigen stimulated B lymphoblast)融合得到杂交瘤细胞(hybridoma cell)，杂交瘤细胞既能象骨髓瘤细胞那样在体外无限增殖，又具有B淋巴细胞产生特异性抗体的能力。因此，单克隆抗体技术又称为杂交瘤技术杂交瘤技术(hybridoma technology ）。（二）（二）单克隆抗体技术的原单克隆抗体技术的原理理（二）（二）单克隆抗体技术的原

11、理单克隆抗体技术的原理Niels K. Jerne 尼尔斯杰尼 G. Kohler乔治JF科勒 C. Milstein塞萨米尔斯坦 1984年10月15日，三位免疫学家被授予1984年度的诺贝尔医学与生理学奖。杰尼是丹麦免疫学界伟大的理论家, 他提出了三大理论: 抗体形成的自然选择学说、 抗体多样性的发生学说、 免疫系统的网络学说, 开创了免疫学的新纪元, 为现代免疫学的建立奠定了基础, 杰尼也被誉为“现代免疫学之父”。科勒是德国免疫学家, 米尔斯坦是英国分子生物学家, 两人的突出贡献是用杂交瘤技术生成了单克隆抗体, 并阐明了单克隆抗体技术的原理。几个关键问题几个关键问题1.HAT选择原理选择

12、原理（酶缺陷型）（酶缺陷型） HAT系统为次黄嘌呤系统为次黄嘌呤(H)、氨基喋呤、氨基喋呤(A)和胸腺嘧啶核苷和胸腺嘧啶核苷(T)的缩写的缩写。它是根据嘌。它是根据嘌呤和嘧啶生物合成途径设计的分离杂种呤和嘧啶生物合成途径设计的分离杂种细胞特殊的培养基。细胞特殊的培养基。 细胞内核苷酸的生物合成有细胞内核苷酸的生物合成有两条途径两条途径： 一条是一条是主要途径主要途径，该途径中叶酸及其衍生物是必，该途径中叶酸及其衍生物是必不可少的，氨基喋呤可抑制二氢叶酸还原酶活性，不可少的，氨基喋呤可抑制二氢叶酸还原酶活性，从而阻断细胞中从而阻断细胞中DNA的合成；的合成； 另外一条是另外一条是补救途径补救途径

13、，该途径需要两种酶参与。，该途径需要两种酶参与。一种是一种是HGPRT酶酶(次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶酶) ，另一种酶是，另一种酶是TK酶酶(胸腺嘧啶核苷激酶胸腺嘧啶核苷激酶) 。它。它们可以分别利用次黄嘌呤催化产生的肌苷酸及胸们可以分别利用次黄嘌呤催化产生的肌苷酸及胸腺嘧啶核苷催化产生的脱氧胸苷来合成腺嘧啶核苷催化产生的脱氧胸苷来合成DNA。 H、T为应急途径时提供外源核苷酸为应急途径时提供外源核苷酸“前体前体”。核酸合成的主要核酸合成的主要合成：合成：由核糖与磷酸合由核糖与磷酸合成成5-磷酸核糖磷酸核糖(R-5-P)，在磷酸核糖，在磷酸核糖焦磷酸酶的催化焦磷酸酶

14、的催化下，与下，与ATP发生发生作用生成作用生成1-焦磷酸焦磷酸-5-磷酸核糖磷酸核糖(PRPP)，以后，以后PRPP再经过一系再经过一系列反应而生成次列反应而生成次黄嘌呤核苷酸黄嘌呤核苷酸(IMP)。 在氨基喋呤存在时，阻断在氨基喋呤存在时，阻断了核苷酸的从头合成了核苷酸的从头合成IMP的的途径，细胞只能通过途径，细胞只能通过HGPRT使次黄嘌呤酸化形使次黄嘌呤酸化形成次黄苷酸，再依次转化为成次黄苷酸，再依次转化为AMP及及GMP，即通过，即通过“补救补救途径途径”依赖外源来合成核苷依赖外源来合成核苷酸。酸。 因此，一个因此，一个HGPRT或或TK的细胞株不可能在含的细胞株不可能在含HAT的

15、培养液中生长。但这的培养液中生长。但这样的细胞与能提供样的细胞与能提供HGPRT或或TK酶的细胞融合后，杂酶的细胞融合后，杂交细胞能在含交细胞能在含HAT培养液中培养液中存活下来。存活下来。 1.HAT选择原理选择原理 如果融合细胞的亲本之一是一个能在体外如果融合细胞的亲本之一是一个能在体外长期生存的骨髓瘤细胞系，而另一个亲本长期生存的骨髓瘤细胞系，而另一个亲本细胞是体外增殖能力有限的正常细胞。细胞是体外增殖能力有限的正常细胞。 如将长期培养系突变为如将长期培养系突变为HGPRT或或TK酶缺酶缺陷型的细胞系，在和正常细胞融合后，未陷型的细胞系，在和正常细胞融合后，未经融合或自身融合的经融合或自

16、身融合的骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞在在HAT培培养液中死亡；未融合或自身融合的养液中死亡；未融合或自身融合的正常细正常细胞胞在体外生存能力有限最终也死亡。在体外生存能力有限最终也死亡。存活存活下来的只有融合细胞。下来的只有融合细胞。2.骨髓瘤细胞的选择骨髓瘤细胞的选择 每一个每一个 B 细胞只分泌产生一种抗体，若能把此细胞只分泌产生一种抗体，若能把此B细胞由脾脏中挑出来，单独培养成细胞株，则可细胞由脾脏中挑出来，单独培养成细胞株，则可得单一种类的抗体，只会对一种抗原决定簇反应，得单一种类的抗体，只会对一种抗原决定簇反应，其专一性极高。其专一性极高。 大量培养此细胞株，即可有质量一定、纯度均大量培养此

17、细胞株，即可有质量一定、纯度均一的抗体，此即为一的抗体，此即为单克隆抗体单克隆抗体。 但但B细胞在体外增殖能力非常弱或不增殖，故细胞在体外增殖能力非常弱或不增殖，故无法获得大量的单克隆抗体。无法获得大量的单克隆抗体。 骨髓瘤细胞易在培养基中生长；利用细胞融合骨髓瘤细胞易在培养基中生长；利用细胞融合法将骨髓瘤细胞永久生长的特性导入可生产有用法将骨髓瘤细胞永久生长的特性导入可生产有用抗体的抗体的 B 细胞中，则得到可在培养基中永久生长细胞中，则得到可在培养基中永久生长的的 B 细胞株，此即杂交瘤细胞株。细胞株，此即杂交瘤细胞株。 得到的杂交瘤细胞既具有得到的杂交瘤细胞既具有B淋巴细胞产生特异淋巴细

18、胞产生特异性抗体的能力，又具有肿瘤细胞在体外无限增殖性抗体的能力，又具有肿瘤细胞在体外无限增殖的特点，可不断在细胞培养上清液中产生单抗。的特点，可不断在细胞培养上清液中产生单抗。次黄嘌呤鸟嘌呤转磷酸核糖激酶缺陷型（次黄嘌呤鸟嘌呤转磷酸核糖激酶缺陷型（HGPRT-）或）或者胸腺嘧啶核苷激酶缺陷型（者胸腺嘧啶核苷激酶缺陷型（TK-）。）。癌细胞癌细胞可培养生长可培养生长浆细胞浆细胞单克隆抗体单克隆抗体可产生有用抗体的淋巴细胞若与癌细胞融可产生有用抗体的淋巴细胞若与癌细胞融合，则形成稳定而可培养的细胞株。合，则形成稳定而可培养的细胞株。细胞融合细胞融合融合瘤融合瘤两组染色体混合在一起两组染色体混合在

19、一起也可培养生长也可培养生长多用多用BALB/C 小鼠的骨髓瘤细胞。小鼠的骨髓瘤细胞。（三）（三）.细胞材料的准备细胞材料的准备（1）培养基：制备单抗的培养基常用DMEM（小鼠）和RPMI-1640（人）两种；使用前添加胎牛血清或小牛血清、抗生素、谷氨酰胺等。（2）血清：胎牛血清（球蛋白少）；优质血清可支持接种量小于20个细胞/孔的细胞生长。（3）抗生素：青链霉素+庆大霉素+卡拉霉素预防细菌污染；两性霉素+制霉菌素预防霉菌污染；小鼠体内接种清除支原体。（四）免疫动物（四）免疫动物 1.动物选择动物选择 目的目的：是希望是希望B细胞在抗原刺激下分化增殖，细胞在抗原刺激下分化增殖，使之有利于融合成

20、杂交瘤细胞，尤其是能分泌使之有利于融合成杂交瘤细胞，尤其是能分泌特异性抗体的杂交瘤融合细胞频率增加。特异性抗体的杂交瘤融合细胞频率增加。 动物选择应与骨髓瘤细胞来源相同的同一品动物选择应与骨髓瘤细胞来源相同的同一品系动物，多为系动物，多为BALB/c小鼠。小鼠。 2.抗原与载体抗原与载体 抗原可分为抗原可分为可溶性抗原可溶性抗原（蛋白质、核酸、多糖、（蛋白质、核酸、多糖、多肽等）和多肽等）和颗粒性抗原颗粒性抗原（细胞、病毒、细菌等）。（细胞、病毒、细菌等）。 一般颗粒性抗原都有较强的抗原性，免疫时可一般颗粒性抗原都有较强的抗原性，免疫时可不加佐剂；而可溶性抗原免疫时需加佐剂。不加佐剂；而可溶性

21、抗原免疫时需加佐剂。 初次免疫时一般用初次免疫时一般用完全弗氏完全弗氏佐剂佐剂将抗原制成乳将抗原制成乳剂剂，而以后加强免疫时一般用，而以后加强免疫时一般用不完全弗氏不完全弗氏佐剂佐剂制制成乳剂进行免疫。成乳剂进行免疫。 3.免疫途径免疫途径 不同抗原可经不同途径进行免疫，不同抗原可经不同途径进行免疫，主要有主要有腹腔注射、皮下淋巴样器官注腹腔注射、皮下淋巴样器官注射、静脉注射、脾内免疫射、静脉注射、脾内免疫等，最常用等，最常用的途径是的途径是腹腔注射腹腔注射。 a.腹腔注射腹腔注射：几乎适合于所有抗原体，特别适合几乎适合于所有抗原体，特别适合于颗粒性抗原，经腹腔注射免疫时还可使用佐剂。于颗粒性

22、抗原，经腹腔注射免疫时还可使用佐剂。 b.皮下淋巴样器官注射皮下淋巴样器官注射：多适用于可溶性抗原，多适用于可溶性抗原，多点注射有利于提高免疫效果。多点注射有利于提高免疫效果。 c.静脉注射静脉注射：不宜用于大颗粒性抗原，不宜作为不宜用于大颗粒性抗原，不宜作为初次免疫途径，也不宜加入佐剂，以免引起血栓初次免疫途径，也不宜加入佐剂，以免引起血栓或过敏反应。或过敏反应。 d.脾内免疫脾内免疫：适于抗原量特别少的情况下使用，适于抗原量特别少的情况下使用，但脾内免疫多不产生明显的血清抗体，对免疫效但脾内免疫多不产生明显的血清抗体，对免疫效果的判断有一定影响。果的判断有一定影响。（五）亲本细胞的准备（五

23、）亲本细胞的准备 1. 脾细胞的分离脾细胞的分离: 一般动物需经多次加强免疫后才能获得大量的一般动物需经多次加强免疫后才能获得大量的分泌抗体的分泌抗体的B细胞。在末次免疫后细胞。在末次免疫后35天左右即天左右即可可取脾脏或淋巴结细胞分离淋巴细胞取脾脏或淋巴结细胞分离淋巴细胞(大多为大多为B细细胞胞)用于与骨髓癌细胞进行细胞融合。用于与骨髓癌细胞进行细胞融合。 分离脾细胞可用脾内注射培养基轻轻挤压使淋分离脾细胞可用脾内注射培养基轻轻挤压使淋巴细胞逸出的方法，也可用不锈钢网挤压法分离巴细胞逸出的方法，也可用不锈钢网挤压法分离淋巴细胞。淋巴细胞。 2.特异性抗原的富集特异性抗原的富集 分离的脾细胞中

24、含有对抗原具有特异性的分离的脾细胞中含有对抗原具有特异性的B细细胞比例相对较少，可以对抗原特异性的胞比例相对较少，可以对抗原特异性的B细胞进细胞进行行富集富集。 将抗原包被在培养板或其他基质上，然后与将抗原包被在培养板或其他基质上，然后与脾细胞结合，那些表面具有特异性抗体的脾细胞结合，那些表面具有特异性抗体的B细胞细胞与抗原结合使得与抗原结合使得B细胞黏附于培养板或基质上，细胞黏附于培养板或基质上，轻轻洗涤除去不黏附的细胞，留下的细胞为具轻轻洗涤除去不黏附的细胞，留下的细胞为具有特异性抗体的有特异性抗体的B细胞，用于细胞融合。细胞，用于细胞融合。 3. 骨髓癌细胞的准备：骨髓癌细胞的准备： 融

25、合亲本的骨髓瘤细胞，最好是同种的骨髓融合亲本的骨髓瘤细胞，最好是同种的骨髓瘤细胞或浆细胞瘤系。这些细胞具有发达的内瘤细胞或浆细胞瘤系。这些细胞具有发达的内质网，能产生大量所需抗体，但必须是不能产质网，能产生大量所需抗体，但必须是不能产生自身基因编码的抗体，否则杂交细胞会产生生自身基因编码的抗体，否则杂交细胞会产生两种以上的抗体，无法得到单克隆抗体。两种以上的抗体，无法得到单克隆抗体。 瘤细胞系必须是对选择剂敏感的，融合后可瘤细胞系必须是对选择剂敏感的，融合后可以用药物以用药物(选择剂选择剂)把未融合的瘤细胞除去。常把未融合的瘤细胞除去。常用来自用来自BALB/c 小鼠的小鼠的653、Sp/20

26、、NS-1等。等。4. 细胞融合：细胞融合： 一般用一般用PEG诱导诱导B淋巴细胞与骨髓淋巴细胞与骨髓瘤细胞间进行融合，操作在瘤细胞间进行融合，操作在10 min 内完成；内完成；骨髓瘤细胞：脾细胞为骨髓瘤细胞：脾细胞为12：10。 将将富集富集的的对抗原具有特异性的对抗原具有特异性的B细胞或将抗原直接交联到骨髓瘤细细胞或将抗原直接交联到骨髓瘤细胞表面，再与脾细胞共温育，使具胞表面，再与脾细胞共温育，使具有产生特异抗体的有产生特异抗体的B细胞与交联抗细胞与交联抗原的骨髓瘤细胞发生特异性结合，原的骨髓瘤细胞发生特异性结合，然后再进行融合，提高融合的特异然后再进行融合，提高融合的特异性。性。 融合

27、后的细胞以融合后的细胞以12 106个细胞个细胞/ml的浓度接种到的浓度接种到96或或24孔板中培养。孔板中培养。促细胞融合的方法有：促细胞融合的方法有： A.病毒融合剂诱发细胞融合病毒融合剂诱发细胞融合:其中仙台病毒其中仙台病毒(HVJ)是最早用于动物是最早用于动物细胞融合的融合剂。细胞融合的融合剂。 B.化学融合剂诱发细胞融合：化学融合剂诱发细胞融合：其中以聚乙二醇其中以聚乙二醇(PEG)最为常用。最为常用。 C.电融合法：电融合法： 利用直流电脉冲诱导细胞间融合。利用直流电脉冲诱导细胞间融合。A.病毒融合剂诱发细胞融合病毒融合剂诱发细胞融合 最早被采用的包括疱疹病毒、麻疹病毒和最早被采用

28、的包括疱疹病毒、麻疹病毒和致瘤病毒等致瘤病毒等有膜病毒有膜病毒，但使用最广的是灭，但使用最广的是灭活的活的仙台病毒仙台病毒； 病毒被膜含有膜蛋白，其表面有许多具病毒被膜含有膜蛋白，其表面有许多具神神经氨酸酶和凝血活性经氨酸酶和凝血活性的刺起，它们降解细的刺起，它们降解细胞膜上的糖蛋白，使细胞膜局部凝集在病胞膜上的糖蛋白，使细胞膜局部凝集在病毒周围，在高毒周围，在高pH和和Ca2+的条件下，膜上蛋的条件下，膜上蛋白质分子的重新分布，使膜中脂类分子重白质分子的重新分布，使膜中脂类分子重排，从而打开质膜，导致细胞融合。排，从而打开质膜，导致细胞融合。用灭活的病毒诱导的动物细胞融合过程示意图用灭活的病

29、毒诱导的动物细胞融合过程示意图 使用仙台病毒融合悬浮细胞时，将两种亲使用仙台病毒融合悬浮细胞时，将两种亲本细胞的悬液混合在一起离心，后将细胞沉本细胞的悬液混合在一起离心，后将细胞沉淀悬于灭活的仙台病毒悬液中，使其进行融淀悬于灭活的仙台病毒悬液中，使其进行融合，再洗去病毒，即可将融合的细胞加入选合，再洗去病毒，即可将融合的细胞加入选择培养液进行选择培养；择培养液进行选择培养； 融合贴壁细胞时，可将两亲本细胞混合培融合贴壁细胞时，可将两亲本细胞混合培养，然后将病毒直接加入到混合培养物中，养，然后将病毒直接加入到混合培养物中，培养一定时间后加选择培养液进行选择；融培养一定时间后加选择培养液进行选择；

30、融合效率比悬浮细胞高。合效率比悬浮细胞高。B. 化学融合剂诱发细胞融合化学融合剂诱发细胞融合 主要主要包括包括聚乙二醇聚乙二醇(PEG)、聚乙烯醇、聚甘油、聚乙烯醇、聚甘油、溶血卵磷脂、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰胆碱等，其溶血卵磷脂、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰胆碱等，其中以中以PEG最为常用。最为常用。 PEG比病毒更易制备和控制、活性稳定、使用方比病毒更易制备和控制、活性稳定、使用方便、而且促进细胞融合的能力更强。便、而且促进细胞融合的能力更强。 PEG(polyethylene glycol, PEG)是一种线形的多是一种线形的多聚化合物，有多种不同的分子量，常用于细胞融聚化合物，有多种不同的分子量，

31、常用于细胞融合的合的PEG分子量在分子量在10004000，浓度在，浓度在3050%间。间。PEG诱导细胞融合的诱导细胞融合的机理机理： 带有大量负电荷的带有大量负电荷的PEG与水之间的氢与水之间的氢键结合，使溶液中自由水消失，由于高度键结合，使溶液中自由水消失，由于高度脱水引起细胞凝集，形成大小程度不同的脱水引起细胞凝集，形成大小程度不同的凝集物。细胞发生皱缩并大大扭曲变形，凝集物。细胞发生皱缩并大大扭曲变形，邻近细胞之间紧密接触。邻近细胞之间紧密接触。 在相邻细胞膜紧密接触的部位，膜在相邻细胞膜紧密接触的部位，膜内蛋白质颗粒易位并凝聚。接着可能是内蛋白质颗粒易位并凝聚。接着可能是相邻的剥去

32、蛋白质的细胞膜间的类脂质相邻的剥去蛋白质的细胞膜间的类脂质与类脂质反应。与类脂质反应。 继之，类脂质分子的扰动和重排导继之，类脂质分子的扰动和重排导致接触的细胞膜局部发生融合，形成很致接触的细胞膜局部发生融合，形成很小的小的细胞质桥细胞质桥，之后细胞质桥逐渐扩大，之后细胞质桥逐渐扩大，两个细胞最终融合。两个细胞最终融合。聚乙二醇（聚乙二醇（PEG）法细胞融合过程）法细胞融合过程 使用使用PEG时，通常通过离心使细胞紧密接触，时，通常通过离心使细胞紧密接触，然后在细胞沉淀中加入一定浓度的然后在细胞沉淀中加入一定浓度的PEG，稍作用，稍作用一段时间后一段时间后(约约30秒秒)后立即加液稀释以及时终

33、止后立即加液稀释以及时终止其作用。其作用。 使用化学促融剂时，使用化学促融剂时，Ca2+是必需的是必需的。Ca2+的的作用机理，有的认为是作用机理，有的认为是Ca2+和和PO43-形成不溶于水形成不溶于水的配合物，成为细胞间的钙桥，由此引起融合。的配合物，成为细胞间的钙桥，由此引起融合。也有解释为也有解释为Ca2+结合到带负电磷脂的电离基上，结合到带负电磷脂的电离基上，使磷脂分子在膜上相互分离，由此引起融合。使磷脂分子在膜上相互分离，由此引起融合。PEG诱导鸡红细胞融合诱导鸡红细胞融合PEG法植物原生质体的融合法植物原生质体的融合图图1 烟草叶肉细胞和洋葱根尖烟草叶肉细胞和洋葱根尖细胞原生质体

34、融合（细胞原生质体融合（40） 图图2 烟草叶肉和洋葱根尖细烟草叶肉和洋葱根尖细胞原生质体的异源融合胞原生质体的异源融合 烟草烟草洋葱洋葱C. 电融合法电融合法 电处理融合法是电处理融合法是20世纪世纪80年代发展起来年代发展起来的细胞融合技术，使融合率大为提高。的细胞融合技术，使融合率大为提高。 电融合的原理：电融合的原理： 当细胞处于强电场脉冲时，电脉冲诱当细胞处于强电场脉冲时，电脉冲诱发细胞膜结构紊乱，膜上会短暂地形成微发细胞膜结构紊乱，膜上会短暂地形成微膜孔，相邻两个细胞紧密排列部位的微孔膜孔，相邻两个细胞紧密排列部位的微孔就会有物质交流，形成细胞膜桥和细胞质就会有物质交流，形成细胞膜

35、桥和细胞质桥，进而引起细胞融合产生杂交细胞。桥，进而引起细胞融合产生杂交细胞。电融合诱导法原理示意图电融合诱导法原理示意图实际操作：实际操作： 先把待融合的细胞或原生质体混合，取样置于先把待融合的细胞或原生质体混合，取样置于100V/cm的高频交流电场中，在非均匀交流电场中形成串的高频交流电场中，在非均匀交流电场中形成串珠状排列；珠状排列； 完整烟草原生质体完整烟草原生质体 原生质体成串原生质体成串 再用再用15 KV/cm直流电脉冲，微直流电脉冲，微秒冲击细胞或原生质体的粘接点，细秒冲击细胞或原生质体的粘接点，细胞膜造成若干微孔，于是在膜之间形胞膜造成若干微孔，于是在膜之间形成通道，使细胞质

36、得以交换；最后导成通道，使细胞质得以交换；最后导致新的球状细胞的形成。致新的球状细胞的形成。电融合法原生质体的融合结果电融合法原生质体的融合结果细胞核移植中的细胞融合细胞核移植中的细胞融合融合中融合中融合后融合后融合前融合前电融合技术的扩展：电融合技术的扩展： 离心电融合：离心电融合：利用离心使相邻细胞紧密接利用离心使相邻细胞紧密接触以提高融合率。触以提高融合率。 特异性电融合：特异性电融合：利用生物素抗生物素利用生物素抗生物素抗原抗体桥联，使带有生物素标记的骨抗原抗体桥联，使带有生物素标记的骨髓瘤细胞与具有特异抗体的髓瘤细胞与具有特异抗体的B细胞间特异性细胞间特异性配对；或直接将抗原标记到骨

37、髓瘤细胞表配对；或直接将抗原标记到骨髓瘤细胞表面，利用抗原抗体特异性结合使两种细胞面，利用抗原抗体特异性结合使两种细胞特异性配对，然后用高压电脉冲诱导细胞特异性配对，然后用高压电脉冲诱导细胞融合。融合。 细胞化学聚集电融合：细胞化学聚集电融合：采用低浓度采用低浓度PEG、PHA或伴刀豆蛋白或伴刀豆蛋白A等使细胞聚集接触，等使细胞聚集接触，然后用电脉冲诱导细胞融合。然后用电脉冲诱导细胞融合。 磁电融合：磁电融合：利用磁场使已表面磁化的利用磁场使已表面磁化的细胞相互聚集接触，然后在用电脉冲诱细胞相互聚集接触，然后在用电脉冲诱导融合。导融合。电融合的优点：电融合的优点： 适应的细胞类型广；适应的细胞

38、类型广； 不需加外源因子，如不需加外源因子，如PEG等；等； 对细胞毒性相对低；对细胞毒性相对低； 融合率高，可达融合率高，可达50%80%； 可用于细胞数量很少的融合；可用于细胞数量很少的融合； 可定向诱导细胞融合可定向诱导细胞融合; 有利于融合细胞的挑选。有利于融合细胞的挑选。电融合的不利之处：电融合的不利之处： 融合仪价格昂贵；融合仪价格昂贵； 两细胞大小差异较大时，电压较难选择；两细胞大小差异较大时，电压较难选择； 融合膜成分不同时细胞较难融合融合膜成分不同时细胞较难融合5.融合细胞的筛选融合细胞的筛选与克隆与克隆 在细胞融合过程中，不仅两类不同细胞间在细胞融合过程中，不仅两类不同细胞

39、间发生融合，两类亲本细胞也能发生相互融合发生融合，两类亲本细胞也能发生相互融合现象。含两个不同亲本细胞核的细胞称现象。含两个不同亲本细胞核的细胞称异核异核体体 或或异核细胞异核细胞。由同一亲本细胞融合形成。由同一亲本细胞融合形成的细胞称的细胞称同核体同核体或或同核细胞同核细胞。 利用利用PEG和仙台病毒进行融合时，细胞融和仙台病毒进行融合时，细胞融合有一定的随机性，除形成杂交细胞外还会合有一定的随机性，除形成杂交细胞外还会出现各亲本细胞自身融合，需对杂交细胞及出现各亲本细胞自身融合，需对杂交细胞及时分离或筛选出来。时分离或筛选出来。 大部分多核细胞在一周内死亡，只有少数大部分多核细胞在一周内死

40、亡，只有少数异核细胞、尤其双核异核细胞会存活。并异核细胞、尤其双核异核细胞会存活。并通过有丝分裂使两个不同亲本细胞的染色通过有丝分裂使两个不同亲本细胞的染色体合并在一个细胞核中，形成杂交细胞。体合并在一个细胞核中，形成杂交细胞。 利用利用酶缺陷型、营养缺陷型、温度敏感性、酶缺陷型、营养缺陷型、温度敏感性、形态和行形态和行为等标志，建立了多种选择选择为等标志，建立了多种选择选择系统，最常用的是酶缺陷型系统，最常用的是酶缺陷型HAT选择培养选择培养法。法。 A.初步筛选初步筛选： 融合后马上以融合后马上以 HAT 培养，能活培养，能活下来的大多为下来的大多为 B 细胞与细胞与 骨髓瘤细胞融合形成的

41、骨髓瘤细胞融合形成的杂交瘤细胞。杂交瘤细胞。 未融合的骨髓瘤及骨髓瘤细胞间相互融合的未融合的骨髓瘤及骨髓瘤细胞间相互融合的细胞在细胞在HAT中因中因DNA 合成抑制而死亡。合成抑制而死亡。 未融合的未融合的B细胞及细胞及B细胞相互融合的细胞在体细胞相互融合的细胞在体外培养因无法增殖会渐渐死去。外培养因无法增殖会渐渐死去。 核酸的正常代谢途径若被氨基蝶呤核酸的正常代谢途径若被氨基蝶呤(A)阻碍，可由补救途径利用次黄嘌呤阻碍，可由补救途径利用次黄嘌呤(H)通通过过次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT)催化产生肌苷酸催化产生肌苷酸(IMP)，并利用，并利用胸腺嘧啶核苷

42、胸腺嘧啶核苷(T)通过通过胸腺嘧啶核苷激酶胸腺嘧啶核苷激酶(TK)催化产生脱氧核苷酸来合成催化产生脱氧核苷酸来合成DNA。但骨髓瘤细胞缺乏但骨髓瘤细胞缺乏TK及及 HGPRT 两种酶，两种酶，因此在因此在A存在下无法生长；正常细胞存在下无法生长；正常细胞 (如如B细胞细胞) 则可经由补救途径继续生长。则可经由补救途径继续生长。 骨髓瘤细胞与正常的骨髓瘤细胞与正常的B细胞形成的细胞形成的杂交瘤，因正常细胞可以提供杂交瘤，因正常细胞可以提供TK及及HGPRT两酶，故在两酶，故在HAT培养基中培养基中可以正常生长。可以正常生长。 B.抗体专一性筛选抗体专一性筛选：并非所有：并非所有 B 细胞都产生实

43、验所细胞都产生实验所要的抗体，小鼠原先就存在许多要的抗体，小鼠原先就存在许多B 细胞株对抗一般疾细胞株对抗一般疾病；因此要对杂交瘤细胞产生的抗体专一性进行筛选，病；因此要对杂交瘤细胞产生的抗体专一性进行筛选，这也是单克隆抗体制备中最关键的步骤之一。这也是单克隆抗体制备中最关键的步骤之一。 用于筛选杂交瘤细胞的方法大致有用于筛选杂交瘤细胞的方法大致有第二抗体法第二抗体法、抗抗原结合法原结合法和和功能筛选法功能筛选法三类三类； 常用的方法是第二抗体法，包括固相放射免疫测定常用的方法是第二抗体法，包括固相放射免疫测定法法(RIA)、酶联免疫法酶联免疫法 (ELISA) 和荧光活化细胞分类和荧光活化细

44、胞分类器法器法(FACS)等，通过这些方法挑出产生专一性抗体的等，通过这些方法挑出产生专一性抗体的集落集落 。 C.细胞克隆化细胞克隆化：通过抗体专一性挑出来的：通过抗体专一性挑出来的细胞株，也许仍含有两群以上的细胞细胞株，也许仍含有两群以上的细胞 ，因此，因此要进行单克隆化；要进行单克隆化； 一般采用一般采用有限稀释法有限稀释法或或软琼脂法软琼脂法对杂交瘤对杂交瘤细胞进行细胞克隆化，获得来自单个细胞的细胞进行细胞克隆化，获得来自单个细胞的克隆；克隆； 并对单个细胞生长出的群落，再次以并对单个细胞生长出的群落，再次以 ELISA 筛选专一性抗体，获得可产生特异性筛选专一性抗体，获得可产生特异性

45、抗体的单克隆细胞株。抗体的单克隆细胞株。 得到稳定的抗体后，通常要再以得到稳定的抗体后，通常要再以ELISA方法检定该抗体的亚型是属于方法检定该抗体的亚型是属于IgG, IgM或或IgA等。免疫时间太短的，较可能取得等。免疫时间太短的，较可能取得IgM，但一般仍以，但一般仍以IgG较多。较多。6. 单克隆抗体的大量制备：单克隆抗体的大量制备： 单克隆抗体的大量制备可分为单克隆抗体的大量制备可分为体内法体内法和和体外法体外法。体内法体内法：可把筛选出来的杂交瘤细胞注入小鼠腹：可把筛选出来的杂交瘤细胞注入小鼠腹腔，诱导小鼠产生大量腹水，然后以针头收集所腔，诱导小鼠产生大量腹水，然后以针头收集所产生

46、的腹水，通常每次可取得产生的腹水，通常每次可取得35 mL左右；腹左右；腹水中的抗体浓度高，可达到水中的抗体浓度高，可达到125 g/mL 。其缺。其缺点是不适合大规模生产，腹水中有可能混有小鼠点是不适合大规模生产，腹水中有可能混有小鼠本身的抗体，给纯化抗体带来困难。本身的抗体，给纯化抗体带来困难。1) 体外法体外法：把融合细胞在大型培养瓶中用无血清培：把融合细胞在大型培养瓶中用无血清培养基进行培养，收集培养液上清即得抗体。缺点养基进行培养，收集培养液上清即得抗体。缺点是抗体浓度低，仅为是抗体浓度低，仅为0.51 g mL。三三、人源性单克隆抗体、人源性单克隆抗体 和基因工程抗体和基因工程抗体

47、1. EB病毒转化技术：病毒转化技术： 利用类似于疱疹病毒的利用类似于疱疹病毒的EB病毒在体病毒在体外直接感染人外周血淋巴细胞（来源于淋外直接感染人外周血淋巴细胞（来源于淋巴结、扁桃体、脐带血、外周血等），使巴结、扁桃体、脐带血、外周血等），使之转化获得永生能力得到人之转化获得永生能力得到人B淋巴细胞系，淋巴细胞系，这些细胞可在体外分泌人抗体。这些细胞可在体外分泌人抗体。(一一) 、人源性单克隆抗体、人源性单克隆抗体 技术同鼠鼠杂交瘤，亲本骨髓瘤细胞主要技术同鼠鼠杂交瘤，亲本骨髓瘤细胞主要有来自小鼠的骨髓瘤有来自小鼠的骨髓瘤653、SP2/0、NS-1，来自，来自大鼠的骨髓瘤大鼠的骨髓瘤Y3A

48、g1.2.3等；等； 亲本亲本B细胞来源于人外周血淋巴细胞、淋巴结细胞来源于人外周血淋巴细胞、淋巴结细胞、脾细胞。细胞、脾细胞。 但人鼠杂交瘤的单克隆抗体分泌性能不稳但人鼠杂交瘤的单克隆抗体分泌性能不稳定，多数情况下由于人染色体的丢失导致杂交定，多数情况下由于人染色体的丢失导致杂交瘤细胞失去分泌抗体的能力。瘤细胞失去分泌抗体的能力。 2. 人鼠杂交瘤单克隆抗体： 技术同鼠鼠杂交瘤，亲本骨髓瘤细胞主要技术同鼠鼠杂交瘤，亲本骨髓瘤细胞主要有来自小鼠的骨髓瘤有来自小鼠的骨髓瘤653、SP2/0、NS-1，来自，来自大鼠的骨髓瘤大鼠的骨髓瘤Y3Ag1.2.3等；等； 亲本亲本B细胞来源于人外周血淋巴细

49、胞、淋巴结细胞来源于人外周血淋巴细胞、淋巴结细胞、脾细胞。细胞、脾细胞。 但人鼠杂交瘤的单克隆抗体分泌性能不稳但人鼠杂交瘤的单克隆抗体分泌性能不稳定，多数情况下由于人染色体的丢失导致杂交定，多数情况下由于人染色体的丢失导致杂交瘤细胞失去分泌抗体的能力。瘤细胞失去分泌抗体的能力。3. 人人杂交瘤单克隆抗体：人人杂交瘤单克隆抗体： 人人杂交瘤操作步骤基本上与小鼠小鼠杂交瘤技人人杂交瘤操作步骤基本上与小鼠小鼠杂交瘤技术相同，使用人的骨髓瘤细胞与人的术相同，使用人的骨髓瘤细胞与人的B淋巴细胞融合；淋巴细胞融合； 但可供利用的人骨髓瘤细胞种类非常有限，人的骨髓但可供利用的人骨髓瘤细胞种类非常有限，人的骨

50、髓瘤细胞在融合率、非分泌型方面仍不及小鼠骨髓瘤细胞瘤细胞在融合率、非分泌型方面仍不及小鼠骨髓瘤细胞； 而且人不能像小鼠那样进行高度免疫，而且人不能像小鼠那样进行高度免疫，B淋巴细胞常淋巴细胞常限于取自外周血限于取自外周血(小鼠取自动物脾脏小鼠取自动物脾脏)，激活状态不适合做，激活状态不适合做融合；故人人杂交瘤细胞在融合、融合后的筛选以及融合；故人人杂交瘤细胞在融合、融合后的筛选以及融合细胞分泌抗体方面仍不理想。融合细胞分泌抗体方面仍不理想。4. 构建转构建转入入Ig基因组小鼠基因组小鼠 将改造过的人的抗体基因组导入小鼠胚胎，将改造过的人的抗体基因组导入小鼠胚胎，得到在免疫后能产生人抗体的转基因

51、小鼠。改得到在免疫后能产生人抗体的转基因小鼠。改造过的抗体除了构成抗原识别与抗原结合部位造过的抗体除了构成抗原识别与抗原结合部位的三个互补决定区的三个互补决定区(CDR)是鼠源的以外，其余是鼠源的以外，其余部分均是人源的。部分均是人源的。 用人用人Ig基因组取代小鼠基因组取代小鼠Ig基因组获得转基因基因组获得转基因小鼠，以后仅需免疫小鼠制作单克隆抗体，但小鼠，以后仅需免疫小鼠制作单克隆抗体，但获得的是人抗体而非小鼠抗体。该技术难度较获得的是人抗体而非小鼠抗体。该技术难度较大，但已有成功的报道。大，但已有成功的报道。5. 严重免疫缺陷小鼠制备人单克隆抗体：严重免疫缺陷小鼠制备人单克隆抗体： SC

52、ID小鼠具有严重免疫缺陷，对外源组小鼠具有严重免疫缺陷，对外源组织无免疫排斥反应，故这种小鼠可接受人体织无免疫排斥反应，故这种小鼠可接受人体组织或器官移植，形成人鼠嵌合体小鼠。组织或器官移植，形成人鼠嵌合体小鼠。 将人免疫干细胞移植到将人免疫干细胞移植到SCID小鼠体内，小鼠体内，SCID小鼠获得了人的免疫系统。小鼠获得了人的免疫系统。 这种小鼠可用任何抗原免疫，从激活的这种小鼠可用任何抗原免疫，从激活的淋巴细胞中富集抗原特异性人源性淋巴细胞中富集抗原特异性人源性B淋巴细淋巴细胞，进一步进行细胞融合或制备抗体库。胞，进一步进行细胞融合或制备抗体库。(二二)、基因工程抗体、基因工程抗体 基因工程

53、抗体是利用基因工程基因工程抗体是利用基因工程的手段获得人源性抗体，主要包括的手段获得人源性抗体，主要包括以下几个方面：以下几个方面：人鼠嵌合抗体、人鼠嵌合抗体、改型抗体、抗体片段、噬菌体抗体改型抗体、抗体片段、噬菌体抗体文库技术、表位印迹选择技术等文库技术、表位印迹选择技术等。 抗体的重轻链构成的可变区抗体的重轻链构成的可变区(V区区)与识别抗与识别抗原有关，具有特异性；而恒定区原有关，具有特异性；而恒定区(C区区)与效应功与效应功能有关。能有关。 人鼠嵌合抗体就是通过人工改造使抗体的人鼠嵌合抗体就是通过人工改造使抗体的V区是鼠源的，而区是鼠源的，而C区是人源的。如此改造的嵌区是人源的。如此改

54、造的嵌合抗体保留了原来鼠源单克隆抗体的特异性和合抗体保留了原来鼠源单克隆抗体的特异性和亲和力，人抗小鼠抗体反应亲和力，人抗小鼠抗体反应(HAMA)也明显减弱。也明显减弱。 1. 人鼠嵌合抗体：人鼠嵌合抗体：人鼠嵌合抗体的制备人鼠嵌合抗体的制备 2. 改型抗体：改型抗体： 也称也称CDR移植移植。用鼠源的。用鼠源的CDR(可可变区中和抗原互补结合构成抗原结合部变区中和抗原互补结合构成抗原结合部位的部分）取代人抗体中相应的位的部分）取代人抗体中相应的CDR部部位，使得抗体中除构成抗原结合部位的位，使得抗体中除构成抗原结合部位的3个个CDR是鼠源以外，其余均为人源。是鼠源以外，其余均为人源。这种抗体

55、在人体内免疫性大大降低。这种抗体在人体内免疫性大大降低。改型抗体（改型抗体（CDR移植）移植） Fab抗体抗体：抗体抗体Y形的两个臂称为形的两个臂称为Fab，它由，它由可变区和小部分的恒定区组成，利用基因工可变区和小部分的恒定区组成，利用基因工程的方法构建具有可变区和小部分恒定区的程的方法构建具有可变区和小部分恒定区的Fab抗体，这样的抗体仍具有特异结合抗原的抗体，这样的抗体仍具有特异结合抗原的特性。特性。 单链抗体单链抗体(ScFv)：用短肽接头用短肽接头常用常用(Gly4Ser)3将重链可变区和轻链可变区相连，使其分子将重链可变区和轻链可变区相连，使其分子变小，更有利于穿透组织和清除，而且

56、易构变小，更有利于穿透组织和清除，而且易构建表达；但亲和力会出现一定的下降。建表达；但亲和力会出现一定的下降。4. 噬菌体抗体文库技术噬菌体抗体文库技术 体外建立一个相应于体内体外建立一个相应于体内B细胞库的抗体库，从中筛细胞库的抗体库，从中筛选所需要的抗体。利用选所需要的抗体。利用PCR扩增重链和轻链的扩增重链和轻链的cDNA，并插入到噬菌体外壳蛋白的编码基因中，然后感染并插入到噬菌体外壳蛋白的编码基因中，然后感染E. coli，使抗体基因的表达产物和外壳蛋白一起融合展示在使抗体基因的表达产物和外壳蛋白一起融合展示在噬菌体表面，成为噬菌体抗体。噬菌体表面，成为噬菌体抗体。 通过固相化的抗原进

57、行筛选，不能结合抗原的噬菌体通过固相化的抗原进行筛选，不能结合抗原的噬菌体被洗去，结合的噬菌体被洗脱下来再次感染细菌进行扩被洗去，结合的噬菌体被洗脱下来再次感染细菌进行扩增，多次吸附洗脱扩增后可获得所要的抗原特异性增，多次吸附洗脱扩增后可获得所要的抗原特异性的噬菌体抗体。这些抗体可以做到全部为人源的。的噬菌体抗体。这些抗体可以做到全部为人源的。5. 表位印模选择技术：表位印模选择技术： 用特定的已知抗原从抗体组合文库中或噬菌体抗体文用特定的已知抗原从抗体组合文库中或噬菌体抗体文库中筛选所需抗体，通过抗体可变区与抗原结合及编码轻、库中筛选所需抗体，通过抗体可变区与抗原结合及编码轻、重链可变区鼠源

58、性与人源性基因置换、匹配，从而获得能重链可变区鼠源性与人源性基因置换、匹配，从而获得能与抗原特异性反应的人源性抗体与抗原特异性反应的人源性抗体； 将筛选到的含人轻、重链基因的质粒转染到骨髓瘤将筛选到的含人轻、重链基因的质粒转染到骨髓瘤SP2/0细胞中，该细胞即可产生人单克隆抗体。细胞中，该细胞即可产生人单克隆抗体。四四、单克隆抗体的应用、单克隆抗体的应用 1. 理论研究：理论研究： 构建构建B淋巴细胞杂交瘤可用于分析淋巴细胞杂交瘤可用于分析B细胞的多样细胞的多样性及其产生机理，并能分析免疫应答中抗体的性及其产生机理，并能分析免疫应答中抗体的多样性。多样性。 利用单克隆抗体可利用单克隆抗体可进行

59、表位分析进行表位分析：利用单克隆：利用单克隆抗体的交叉反应，能帮助找出大分子之间在重抗体的交叉反应，能帮助找出大分子之间在重要结构和生物学上的关系，因为对一种单克隆要结构和生物学上的关系，因为对一种单克隆抗体起反应的几种大分子一定具有相同和相似抗体起反应的几种大分子一定具有相同和相似的抗原决定簇。的抗原决定簇。2. 诊断试剂中的应用：诊断试剂中的应用： 单克隆抗体现已广泛应用于许多领域的诊断，特别单克隆抗体现已广泛应用于许多领域的诊断，特别是在疾病诊断上广泛应用。如针对是在疾病诊断上广泛应用。如针对HIV、乙肝等疾病、乙肝等疾病的单克隆抗体，测定妊娠的的单克隆抗体，测定妊娠的hCG单克隆抗体、

60、测定排单克隆抗体、测定排卵的卵的LH单克隆抗体在市场上大量供应。单克隆抗体在市场上大量供应。 用针对肿瘤细胞表面特异抗原的单克隆抗体在帮助用针对肿瘤细胞表面特异抗原的单克隆抗体在帮助诊断癌症，如用诊断癌症，如用癌胚抗原癌胚抗原(CEA)的单克隆抗体在帮助的单克隆抗体在帮助诊断结肠癌和直肠癌，用前列腺诊断结肠癌和直肠癌，用前列腺酸性磷酸酶酸性磷酸酶的单克隆的单克隆抗体在帮助诊断前列腺癌等。抗体在帮助诊断前列腺癌等。 用同位素标记的单克隆抗体用于肿瘤显像定位对诊用同位素标记的单克隆抗体用于肿瘤显像定位对诊断肿瘤患者是否有转移病灶具有重要意义。断肿瘤患者是否有转移病灶具有重要意义。3. 疾病治疗上的