低分子量海带岩藻聚糖硫酸酯的制备工艺研究的说明材料

1、工程编号 1020010704工程分类自然科学社会科学 中国海洋大学 本科生研究开展方案 OUC-SRDP工程 结题论文工程名称： 低分子量海带岩藻聚糖硫酸酯的制备工艺研究 负 责 人： 张晶 工程成员: 李尧 于萍萍 联系 ：电子邮箱： zhangjing10280202126 所在学院： 食品科学与工程 专业年级： 2021级食品科学与工程专业 指导教师: 赵雪 起止年月： 2021 年 5 月至 2021 年 4 月二一一年 四 月 二十七 日本科生研究开展方案管理委员会低分子量海带岩藻聚糖硫酸酯的制备工艺的研究 褐藻岩藻聚糖硫酸酯是一种结构独特的海洋硫酸多糖，因为其抗凝血、抗血栓、抗肿

2、瘤、提高免疫力等方面的活性而受到广泛的关注。本研究以我省资源丰富的褐藻海带为研究对象，对海带加工过程中废弃未利用的生物活性物质岩藻聚糖硫酸酯进行回收利用，研究制备高效、平安的抗血栓活性的岩藻聚糖硫酸酯，用于开发海洋药物或者海洋功能食品，可以大大提高海带的附加值。也改变了我国海带加工胶、碘、醇四十年一贯制的状况，提高了海带的综合利用价值，可以大大推动我国海藻加工高值化的开展。一、实验方法：(一)、中分子海带岩藻聚糖硫酸酯的分级纯化和制备1. 确定中分子量岩藻聚糖硫酸酯的NaCl洗脱浓度。称量50mg粗糖样品做成3%的水溶液，参加到Q-Sepharose FF阴离子交换柱16*50cm中进行交换，

3、用0-4mol/LNaCl溶液连续梯度洗脱，分部收集，用苯酚-硫酸法检测。通过该试验确定分级洗脱适宜的NaCl浓度。 图1 梯度洗脱得到的吸光值与管数的关系 通过图1可以看出在1mol/L、2.5mol/LNaCl和3.5mol/LNaCl浓度吸光值较大，确定出中分子量岩藻聚糖硫酸酯的适宜的洗脱浓度为1mol/L、2.5mol/LNaCl和3.5mol/LNaCl。2中分子量岩藻聚糖硫酸酯的制备 称量15g粗糖样品做成3%的水溶液，参加到Q-Sepharose FF阴离子交换柱中进行交换，分别用H2O、1mol/L、2.5mol/LNaCl和3.5mol/LNaCl分步洗脱，用硫酸苯酚法检测洗

4、脱的糖的含量直到糖完全洗脱完毕。弃去H2O洗脱局部，收集到高硫高分子量2.5mol/L和低硫高分子量1mol/L三种组分。再用截留分子量为10kDa的中空纤维膜进行超滤，去除盐和小分子的糖。超滤内液经真空旋转浓缩，冻干，得到低硫高分子量F1和高硫高分子量F2的组分。二低分子量岩藻聚糖硫酸酯的制备 取4.5 g岩藻聚糖硫酸酯粗糖与0.36g CuAC2H2O一起溶于67.5 mL蒸馏水中，用2 mol/L NaOH调pH至7.5左右。用蠕动泵以54 mL/h的速度参加H2O2溶液，60反响5小时。将反响液中参加0.3mL 2 mol/L NaOH，离心除去Cu2+。取上清液，并调pH至中性，参加

5、Chelex 100螯合树脂除去残留的Cu2+。反响液分别用截留分子量为10 kDa、6kDa、2.5kDa和300Da的超滤膜进行超滤，得到四个组分Fa6-10kDa、Fb(2.5-6kDa)、Fc(300-2.5kDa)和Fd(小于300)，然后分别浓缩冻干。三、不同分子量的岩藻聚糖硫酸酯的化学分析 分别对F1和F2，以及Fb1和Fb2进行高效液相色谱分析确定其重均分子量和数均分子量分子量，采用氯化钡明胶法确定其硫酸根含量，采用柱前衍生高效液相色谱分析确定各组分的单糖组成。四、不同的岩藻聚糖硫酸酯对动脉血栓形成的影响试剂配制肝素钠溶液：用生理盐水溶解肝素钠干粉，配制成高2mg/ml、低1m

6、g/ml两个剂量组低分子量岩藻聚糖硫酸酯：用生理盐水溶解Fa3和Fb3干粉，配制成高(10mg/ml)、中5mg/ml、低2.5mg/ml)三个剂量组。高分子量岩藻聚糖硫酸酯：用生理盐水溶解F1和F2干粉，配制成高0.25mg/ml、低0.1mg/ml)两个剂量组。对氨基甲酸乙酯麻醉液：用时以超纯水配成质量分数为20%的溶液。实验步骤挑选100只雄性Wistar大鼠，称重250300g，随机分为10组，每组10只，分别标记。将实验动物用对氨基甲酸乙酯(0.5mL/kg) 腹腔注射麻醉后，固定于动物解剖板上，切开大鼠颈部皮肤，剥离右侧颈动脉约13mm，剥离中尽量减轻对颈动脉牵拉刺激，不得损伤血管

7、外表和神经。开启仪器，设置好参数，将血栓探头上的压板翻开，将剥离好的颈总动脉勾入探头的沟槽内，注意：探头上标出的血流方向应与被测动物颈总动脉的血流方向一致，轻轻放下压板，使血栓探头与动物身体保持垂直，将上端软线放入固定支架的夹子内固定，调整好高度和方向。剥离股静脉给药后，按动运行键，博动信号稳定时,通过刺激电极给予1.2 mA电流刺激，以损伤动颈动脉血管的内皮细胞，从而激活凝血因子，启动凝血机制，造成血小板和纤维蛋白聚集，形成一种混合性的血栓。使用红外血流检测探头对血栓形成引起的血流脉动变化进行全程的监测，及时地捕捉血栓开始形成的时间，血栓阻塞血管的百分比的变化以及全阻塞时间。统计学分析实验数

8、据均以xs表示。多组间比拟采用SPSS11.5软件包进行独立样品T检验，再进一步应用LSD法比拟各组组间差异，以0.01和0.05显著差异值界限。二、结果分析：一大分子岩藻聚糖硫酸酯的化学分析图2 大分子岩藻聚糖硫酸酯的分子量和硫酸根含量的比拟组分重均分子量(kDa)数均分子量(kDa)多分散系数硫酸根含量%F128191.4728.50.57F235281.2532.250.57 图3 岩藻聚糖硫酸酯各组分的单糖组成的比拟组分fractions岩藻糖%半乳糖%甘露糖%鼠李糖%葡萄糖醛酸%木糖%葡萄糖胺%葡萄糖醛酸(%)F136.2018.3617.758.718.217.325.28.45F

9、246.2012.3619.757.713.212.3208.45 根据高效液相色谱分析结果确定离子交换法制备的力量个中分子量的岩藻聚糖硫酸酯的重均分子量和数均分子量为F1：28000 和19000 ，F2：35000 和28000。硫酸根含量分别为28.5%和35.25%。而由图3可以看出，中分子岩藻聚糖硫酸酯的单糖组分也不同，单糖组分大多是岩藻糖、半乳糖和甘露糖，而其它糖组分含量较少或根本不含，F1主要含有岩藻糖36.20%、甘露糖17.75%和半乳糖18.36%，F2主要含有岩藻糖46.20%、甘露糖19.75%和半乳糖12.36%，还含有一定量的鼠李糖、木糖和D-葡萄糖醛酸。其中硫酸根

10、含量较高的F2组分，活性成清楚显高于F1。(二) 低分子岩藻聚糖硫酸酯的化学分析1. 低分子岩藻聚糖硫酸酯的高效液相色谱分析结果时间 图4 9% H2O2降解4.5g 组分得到的小于10000Da局部的高效液相色谱分析结果图5 4.5% H2O2降解4.5g 组分得到的小于10000Da局部的高效液相色谱分析结果主要得到峰值分子量为7kDa，4kDa和1kDa的低分子量组分。2 低分子量组分的硫酸根含量分析 图6 低分子量组分的硫酸根含量分析水解条件组分重均分子量(kDa)硫酸根含量%得率%粗糖175.9-74224.809%H2O2降解4.5g组分Fa27.4423.761.230.68Fb

11、23.2525.320.5224.64Fc21.5313.610.4621.584.5%H2O2降解4.5g 组分Fa37.6830.321.6824.36Fb33.8932.480.4930.58Fc31.5518.850.8512.15由图6中数据可以看出，4.5%H2O2降解4.5g Fucoidan，可以得到硫酸根含量高达30.32%和32.48%的7kDa和4kDa的高硫组分，显著高于9%的降解产物。因此，自由基氧化降解是一种有效的降解岩藻聚糖硫酸酯的方法。低分子岩藻聚糖硫酸酯的红外光谱分析结果图7 4.5%H2O2降解4.5g 组分得到的峰值分子量为7kDa组分的红外光谱分析图8

12、4.5%H2O2降解4.5g 组分得到的峰值分子量为4kDa的红外光谱图 采用红外光谱分析4.5%H2O2降解4.5g 岩藻聚糖硫酸酯得到的7kDa组分(图7)和4kDa组分图8，发现两种组分在3450cm和3445cm都有很强的羟基(O-H)伸缩振动吸收峰，在2945cm和2944cm附近有C-H的伸缩振动吸收峰，在1634cm和1639cm处有C=O的伸缩振动中强吸收峰，7kDa和4kDa组分在1257.2cm和1257.9cm处均显示了很强的S=O对称吸收峰，说明这两个组分的硫酸根含量很高，这与离子色谱测定的硫酸根含量高达30.32%和32.48%也是吻合的。多糖的红外吸收光谱810cm

13、-850cm吸收峰表示C-0-S伸缩振动，它的位置与硫酸根在糖上的连接位置有关，指出，如果糖的平伏键结合有硫酸酯，那么C-O-S的振动出现在820cm，如果糖的垂直键结合有硫酸酯，那么C-O-S的振动出现在850cm，由此就可以从红外光谱来判断硫酸基的位置。由图7和图8可以看出，7kDa组分和4kDa组分在845.19cm和844.63cm处均有较强的吸收峰，说明这两个组分的硫酸根大致处于糖的垂直键上，且在2，4位有双硫取代。其它水解条件下的各组分S=O伸缩振动峰和C-0-S的伸缩振动峰均没有这两个组分显著，这也是与前面测得的硫酸根含量数据是一致的，而且4.5%H2O2降解4.5g 岩藻聚糖硫

14、酸酯，7kDa和4kDa组分总糖含量分别到达62.01%和60.82%，说明这两个组分的纯度很高，有很好的均一性。因此选择Fb3和Fa3进行气相色谱分析.图9 Fa3和Fb3的糖组成分析组分岩藻糖%半乳糖%甘露糖%鼠李糖%葡萄糖醛酸%木糖%葡萄糖胺%Fa347.7437.355.443.873.650.801.95Fb365.2730.741.562.211.51-注：*以气相色谱的结果计算，气相色谱中所有的峰的总面积为100，“-，未检出 因此选择硫酸根含量较高的Fa3和Fb3组分进行糖组分分析，结果如下图，重均分子里较小且硫酸根含量较高的Fb3活性成清楚显高于Fa3。图10 低分子质量组分

15、Fa和Fb的分子量测定曲线 岩藻聚糖硫酸酯粗糖经自由基氧化降解后，得到的重均分子量为7.68kDa组分在高效液相色谱分析中呈单一对称峰，且分布范围较窄，组分较纯见图10，主要由岩藻糖组成，到达64.25%，其次是半乳糖含量上升到30.74%，岩藻糖和半乳糖占总单糖组成的94.99%，而甘露糖、鼠李糖和葡萄糖含量很低。而3.89kDa的组分主要由重均分子量为6.52kDa和4.73kDa的两个组分组成，采用TSK2500的色谱柱也无法别离，其硫酸根含量最高，到达32.48%，主要由岩藻糖46.94%和半乳糖37.35%组成，岩藻糖含量明显低于7.68kDa的组分。二、不同岩藻聚糖硫酸酯对大鼠动脉

16、血栓生成的影响 经1.2mA的电流刺激大鼠颈动脉5min后，血管颜色明显变黑，剖开血管壁厚可见血管内血栓形成。 a.剥离颈动脉 b.电刺激颈动脉图11 大鼠颈动脉模型实验过程关键点图图12 0.8mA电刺激对大鼠颈动脉血栓形成阻塞率变化的影响图13 1.0 mA电刺激对大鼠颈动脉血栓形成阻塞率变化的影响图14 1.2 mA电刺激对大鼠颈动脉血栓形成阻塞率变化的影响 图12、13、14为用不同的电流刺激大鼠颈动脉时血栓形成过程中血栓阻塞血管的百分比的变化以及全阻塞时间。血栓形成过程中，血管阻塞率不断上升，阻塞率曲线的斜率由大变小，说明大鼠血管在电刺激的条件下形成血栓的速度先快后慢。随着电流的增大

17、，血栓形成所需的时间逐渐减小。采用0.8mA成栓时间大约为11634s,但是成栓率比拟低，10只大鼠仅有4只一次成拴。而电流加大到1mA和1.2mA，成栓率上升为80%和100%。 1.2mA电流太大，成栓时间太短。所以认为1.0 mA电流是最适宜的电流强度。图15 不同的岩藻聚糖硫酸酯对动脉血栓形成时间的影响组别剂量 (mg/kg)全阻塞时间(s)生理盐水组76.7+27.0肝素钠12112+22.3225.5+37.3*F10.1102.8+19.20.25300*F20.1230+24.6*0.25300*Fb32.5116.5+19.65182.5+36.2*10239.4+29.5*

18、Fa32.5100.3+25.75284+24.3*10300* 肝素的剂量为1mg/kg时，对大鼠颈动脉电刺激的全阻塞时间无显著影响，当肝素的剂量提高到2mg/kg时，可以显著延长全阻塞时间。大分子量岩藻聚糖硫酸酯中，F2比F1更能延长全阻塞时间，低分子量岩藻聚糖硫酸酯中，随着剂量的提高，3.3KD的Fb3和7.7KD的Fa3都可以显著延长大鼠颈动脉血栓形成时血管的全阻塞时间。三、实验结论：通过这次实验我们明显可以得到一下结论：1 通过Q-Sepharos FF阴离子交换制备得到大分子量岩藻聚糖硫酸酯的重均分子量和数均分子量为F1：28000 和19000 ，F2：35000 和28000。硫酸根含量为28.5%和35.25%。硫酸根连接在糖的C2或C3位处于平伏键位置