红外辅助提取白芨多糖(BSP)

1、红外辅助提取白芨多糖（BSP）的优化基于响应面法及BSP的抗氧化活性201440302105赵颖摘要 BSP由于其潜在的医学应用，而吸引了广泛的研究兴趣。这里，首次采用红外辅助技术从白芨块茎中提取BSP。基于Box-Behnken设计（BBD）和响应面（RSM）方法，在最佳提取条件下：75C提取温度，2.5 h提取时间;和水料比（53ml / g）（水的体积与药材质量比），获得43.950.26的粗BSP产率。随后，将粗BSP进一步脱色，脱蛋白，冷冻干燥，并通过DEAE-52纤维素柱纯化。 此外，对BSP的微结构和的三螺旋结构进行了表征。傅里叶变换红外光谱也证实了其通过典型峰的多糖表征。还通过

2、超氧化物阴离子自由基清除测定，羟基自由基清除测定，DPPH自由基清除活性和亚铁离子的螯合证明了BSP的显着的体外抗氧化活性。总之，这项研究提供了一种有效的提取BSP（作为有希望的天然抗氧化剂）的技术。介绍 白芨可以用于促进伤口愈合和治疗消化道粘膜损伤，溃疡，出血，瘀伤和烧伤 近年来，天然多糖已被用于各种生物材料，其中它们表现出生物相容性，低毒性和制药生物医学活性。而由于白芨多糖抗菌、抗炎、抗衰老、抗癌（癌症免疫治疗）和保护作用（针对肾纤维化）等，使白芨多糖备受关注。 此外，在用于药物应用的生物活性材料中，已经报道BSP成功地用作药物和基因的受控递送和组织工程的赋形剂。 BSP优异的可纺性，机械

3、性能和生物相容性使生物纤维的生产成为可能，其潜在应用包括作为组织工程支架和伤口敷料的理想材料。 白芨的组分、分子量和生物活性已被广泛研究。然而，BSP的提取及其抗氧化活性却很少被关注。介绍 提取方法的研究 目前已经开发了多种用于提取多糖的新技术，包括超临界流体提取，微波辅助提取，酶辅助提取和超声波辅助提取。每种提取方法都有其优点和缺点。如，这些方法需要使用精密设备（微波炉或超临界流体提取系统），并且涉及高成本。同时，它揭示了超声辅助提取方法可能会导致水溶性多糖的一些降解。因此，仍然需要开发简单且低成本的提取方法。 与这些方法相比，红外辅助提取（IRAE）越来越多地应用于从药用植物提取活性成分，

4、具有许多优点，包括较短的提取时间，低提取温度和高提取商;此外，红外辅助提取更容易使用，更廉价和无辐射。本研究集中于BSP的IRAE，使用可商购的红外灯泡作为红外辐射源，以开发有效和经济的提取方法。介绍 实验优化基于RSM响应面法 RSM已被广泛用于优化许多研究中的过程，包括多糖的提取。基于Box-Behnken Design（BBD）的统计建模旨在用于实现最大多糖产率的响应表面设计。 与其他方法相比，BBD有助于实验的设计和解释，具有广泛的应用范围。而且，据我们所知，在RSM的基础上使用IRAE提取BSP还没有被描述。 因此，在本研究中，通过IRAE（红外辅助）提取BSP，用BBD来优化提取变

5、量以获得最大多糖产率。 响应面分析也是一种最优化方法，它是将体系的响应（如萃取化学中的萃取率）作为一个或多个因素（如萃取剂浓度、酸度等）的函数，运用图形技术将这种函数关系显示出来，以供我们凭借直觉的观察来选择试验设计中的最优化条件。实验流程白芨块根粉碎石油醚脱脂95%乙醇回流过滤残渣干燥用水提取干燥研磨样品离心取得上清液用苯酚-硫酸法在红外光照射下测得BSP的最大吸收带在490nm实验优化设计单因素设计温度：40、50、60、70、80、90度时间：0.5、1、2、3、4、5h水料比：30、40、50、0、70ml/g得到的结果是提取温度6080佳提取时间13h为佳水料比应在4060ml/g为

6、佳实验优化设计BSP冻干技术 冻干可用于保留样品的天然结构和特征。因此，该方法广泛用于干燥多糖样品。 为了便于比较，在本研究中，BSP使用冻干和风干进行干燥。 与以前的报道一致，真空干燥和冻干后BSP的外观差异很大。就本研究中所发现的，BSP的粘度随着浓度增加而增加，使得其容易粘附到容器上并形成干燥的真空薄膜。在高浓度下BSP冻干形成胶状团块，表明BSP具有良好的成膜性质。然而，随着干燥时间的要求，这些团块难以再溶解。而且，冻干的BSP表面结构不同于真空干燥BSP的表面结构，其结构相对薄和松散，并且有一些小碎片粘黏在上面。 因此，为了保证冷冻干燥样品的质量，减少干燥时间和提高效率，在此使用冷冻

7、干燥法制备BSP。实验优化设计粗BSP的制备和纯化将多次离心所得上清液合并置于旋转蒸发器将体积浓缩至1/3用sevag（氯仿：丁醇，4:1）试剂除去蛋白质加入脱水醇至最终浓度为80%，并浓缩得到沉淀，过夜再离心，得到沉淀物BSPBSP与100ml水以10mg/ml比例配制通过DEAE-52纤维柱，使用去离子水洗脱得到洗脱液再用苯酚-硫酸检测其在490nm处的吸光度当无吸光度后停止洗脱将洗脱液再减压浓缩在去离子水中透析72h所得样品冻干，最终得到白色粉末最后用苯酚-硫酸法测定多糖的总碳水化合物含量BSP的微结构表征结果冻干BSP的SEM观察如图，所有样品表现出松散的丝状网络，尽管根据浓度存在大的

8、差异。显微组织如图。 图A表示，出了大的絮状结构。 在图B中，看到带和宽丝。 图C所示，观察到片状结构。 随着薄片结构增加（图D）BSP几乎形成薄膜层。 然而，随着膜层数量的增加，形成了网状结构（图E） 图F中，网格数增加，网格的尺寸减小。网状结构的规则性和密度说明冻干的BSP在无水状态下表现出强烈的相互作用。在网络结构中观察到一些角度不规则的空隙，这些空隙可能代表在冷冻干燥过程中冰晶升华后残留的空间。BSP的多糖结构表征结果 BSP的FT-IR光谱BSP的多糖构象表征结果刚果红法刚果红与三螺旋多糖反应，将溶液的紫外最大吸收峰移向较长波长处。从三螺旋构象到单线圈构象的转变降低了刚果红多糖溶液的

9、最大吸收峰。在0-0.5mol / l（摩尔/升）的NaOH浓度下BSP的螺旋 - 线圈过渡分析如图所示。 BSP在蒸馏水中的最大吸收波长从 503 转移到 512 nm，比在没有 BSP刚果红溶液中测量的值从487到498 nm大，表示三螺旋多糖-刚果红络合物已经形成。在较高浓度的NaOH下螺旋构象被破坏，最大吸收波长也降低。这些结果表明BSP具有三螺旋构象。BSP的体外抗氧化活性的表征 人体衰老和多种疾病均与自由基有关，寻找天然抗氧化剂具有重要意义。黄酮、多糖、多肽、酚类等生物活性成分均具有抗氧化活性，抗氧化活性的筛选方法可分为体外和体内2种测试体系。 体外：通过样品对检测体系中自由基的清

10、除能力、抗油脂过氧化能力及样品的还原能力、总抗氧化能力等来衡量和表征。 常用的方法有羟基自由基（OH）清除能力法、1,1-二苯基苦基苯肼（DPPH法）、2,2-联氮基-双-(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二氨盐（ABTS法）、超氧阴离子自由基法（O2-）、邻苯三酚自氧化法、-胡萝卜素漂白法、硫代巴比妥酸法、铁离子还原能力测定（FRAP法）、总酚测定法、ORAC法等方法。体外抗氧化活性研究通过测定 对超氧化物阴离子自由基的清除活性 对DPPH自由基的清除活性 对亚铁离子螯合的作用 对羟基自由基的清除活性同时与抗坏血酸作对比体外抗氧化活性的表征结果超氧自由基清除活性纯化的BSP的超氧自由基清除活性

11、与增加的浓度从0.25至5mg / ml呈正相关，但活性小于抗坏血酸。在5mg / ml时，纯化的BSP的清除活性为43.70，抗坏血酸的清除活性为93.46。体外抗氧化活性的表征结果对羟基自由基的清除活性羟基对生物体是危险的，因为它引起生物分子（例如脂质，蛋白质，碳水化合物和DNA）的氧化损伤;因此，这种自由基可以很容易地损坏，甚至杀死细胞;多糖可以作为电子或氢供体来清除羟基自由基。因此，去除羟基自由基对于保护身体免受氧化相关损伤是非常重要的。 OH-的清除活性是有浓度依赖性的。在5mg / ml的浓度下，纯化的BSP和抗坏血酸对羟基自由基的清除活性分别为35.97和93.37。这些结果表明

12、BSP具有清除羟基自由基的能力。体外抗氧化活性的表征结果DPPH自由基清除活性DPPH基是相对稳定的自由基并且可以接受电子或氢原子以形成稳定的抗磁分子;因此，DPPH被广泛用于评价自由基清除活性。 DPPH自由基清除活性是有浓度依赖性的。在5mg / ml时，纯化的BSP和抗坏血酸的DPPH自由基清除活性分别为42.20和94.01。这些发现意味着BSP可以捐赠电子或氢原子以清除DPPH自由基。体外抗氧化活性的表征结果纯化的BSP螯合金属离子，如Fe 2+的能力金属螯合能力被认为与抗氧化活性相关。几项研究已经证明了多糖的金属离子螯合能力可能是由于糖醛酸中的羧基和二价离子之间形成交联桥。纯化的BSP的亚铁离子螯合作用是有浓度依赖性的。我们