改良LORRY法测蛋白质含量

1、实验要求实验要求u 实验室安全：实验室安全： 实验服、口罩、手套实验服、口罩、手套u试剂和仪器的使用试剂和仪器的使用u禁止大声喧哗，保持实验环境的安静禁止大声喧哗，保持实验环境的安静u实验室卫生实验室卫生u实验分组实验分组实验报告格式实验报告格式实验名称实验名称姓名：姓名：班级：班级：学号：学号：实验原理：实验原理：实验目的：实验目的：实验步骤：实验步骤：文字简洁，尽可能采用图表文字简洁，尽可能采用图表实验结果：实验结果：原始数据、计算过程、结论原始数据、计算过程、结论实验讨论：实验讨论：结果分析、实验注意事项结果分析、实验注意事项实验日期：实验日期：同组人员：同组人员：总分总分100 ：50

2、%为实验理论（闭卷）为实验理论（闭卷） 50%为实验技能操作及平时为实验技能操作及平时 平时（包括实验报告和平时表现）实验课的考核实验课的考核？ ？实验安排实验安排12临床药理、医学检验、药学临床药理、医学检验、药学13护理班护理班13生工、药贸生工、药贸 实验四实验四：谷丙转氨酶活性测定和竞争性抑制（22&7） 实验五：实验五：质粒DNA的提取与电泳（27） 实验一实验一：改良Lowry氏法测定蛋白质浓度（1） 实验二实验二：乙酸纤维素薄膜电泳和凝胶柱层析（14&13） 实验三实验三：血清甘油三酯含量测定（26） 试验六：试验六：聚合酶链式反应（28） 实验七实验七：血清蛋白聚丙烯酰胺凝胶电

3、泳（15）一、玻璃仪器的常规清洗一、玻璃仪器的常规清洗（P2-3） 清洗剂刷洗清洗剂刷洗 自来水冲洗（至少自来水冲洗（至少5遍）遍） 蒸馏水冲洗（蒸馏水冲洗（2-3次）次） 干燥与放置干燥与放置二、吸量管的使用二、吸量管的使用（P3-4）选、吸、平、减、吹选、吸、平、减、吹三、试剂瓶、吸量管、试管的放置三、试剂瓶、吸量管、试管的放置 试剂瓶用后放回原处、标签面向同一方向 吸量管箭头朝下放置，以免倒流 空置干净试管倒扣放在试管架上四、分光光度计的原理（四、分光光度计的原理（P11）光源光源I0I单色器单色器样品池样品池狭缝狭缝检测系统检测系统 T = I/I0， A = - lg T 1、A1/

4、A2= c1/c22、标准曲线法、标准曲线法Lambert-Beer 定律定律A= KcL1. 打开电源，调节旋钮至需要的波长，预热打开电源，调节旋钮至需要的波长，预热2030min2. 1档档（空白管）（空白管），T模式调模式调100%，显示，显示“Blank”、“100”3. 拉杆拉至拉杆拉至1.5档，档，T模式调模式调0%，显示，显示“0.00”4. 切换到切换到A模式，拉至模式，拉至2、3、4档，读取各个样品的吸光度档，读取各个样品的吸光度5. 使用完毕后，置于休息档（使用完毕后，置于休息档（1.5档）档）拉杆，拉杆，1-4档档样品池样品池读数读数波长波长五、分光光度计的使用五、分光光

5、度计的使用1档，空白对照，档，空白对照，A=0，T=100%1.5档，隔板，档，隔板，A=+，T=0%2档，样品档，样品1，A=？3档，样品档，样品3，A=？4档，样品档，样品4，A=？1、分清光面、毛面、分清光面、毛面 手只可接触毛面，光线须从光面通过手只可接触毛面，光线须从光面通过2、用溶液润洗、用溶液润洗2-3次，装至次，装至2/3至至4/5体积体积3、粗纸吸水、柔纸擦亮光面、粗纸吸水、柔纸擦亮光面4、从低到高依次测量，不需清洗比色杯、从低到高依次测量，不需清洗比色杯5、蒸馏水冲洗、蒸馏水冲洗3-5次，擦干，倒扣放置次，擦干，倒扣放置毛面毛面光面光面六、比色皿的使用六、比色皿的使用1、学

6、习改良、学习改良Lowry氏法测定蛋白质含量氏法测定蛋白质含量 的原理及方法的原理及方法2、了解标准曲线在物质定量测定中的、了解标准曲线在物质定量测定中的 应用及绘制要点应用及绘制要点凯氏定氮法凯氏定氮法 16%紫外吸收紫外吸收 280nm呈色反应呈色反应Pr.Cu2+OH-Pr-Cu2+ 螯合物螯合物 (紫红色紫红色) 酚试剂酚试剂钼蓝钼蓝-钨蓝混合物钨蓝混合物 (蓝色，深浅与蛋白含量呈正比蓝色，深浅与蛋白含量呈正比) （双缩脲反应）（双缩脲反应）Pr.Cu2+费时较长，而且要精确控制操作时间。费时较长，而且要精确控制操作时间。显色程度与时间有关。显色程度与时间有关。 专一性较差，干扰物质较

7、多。专一性较差，干扰物质较多。灵敏度高灵敏度高双缩脲法的检出限为双缩脲法的检出限为 0.21.7 mg/ml，而本法的检出限为而本法的检出限为0.0150.110 mg/ml。优优 点点缺缺 点点试剂试剂（ml）蛋白标准品蛋白标准品样品样品测定管测定管012345Pr标准液标准液00.10.20.40.60.8 待测血清待测血清 1.0生理盐水生理盐水1.00.90.80.60.40.20试剂试剂A0.9ml, 混匀后，混匀后，37水浴水浴10min试剂试剂B0.1ml, 混匀后，室温放置混匀后，室温放置10min试剂试剂C3ml, 立即立即混匀，混匀，37水浴水浴10min1、标准曲线的绘制

8、和实测样本浓度的求得、标准曲线的绘制和实测样本浓度的求得0 x1 x2 x3 x4Y3OD650蛋白质量（蛋白质量（mg）/蛋白浓度（蛋白浓度（mg/ml）Y2Y1样品吸光度样品吸光度样品浓度样品浓度2、浓度换算、浓度换算样品体积样品体积实测蛋白质量实测蛋白质量待测蛋白浓度（待测蛋白浓度（g/L）= 实测蛋白浓度实测蛋白浓度 稀释倍数稀释倍数待测蛋白浓度（待测蛋白浓度（g/L）= 稀释倍数稀释倍数注意注意1终体积相同的前提下，可以用质量代表浓度终体积相同的前提下，可以用质量代表浓度 例如：例如：1号管中，蛋白质量为号管中，蛋白质量为0.02mg，而其终浓度为，而其终浓度为0.004mg/ml2注意溶液的稀释倍数注意溶液的稀释倍数 例如：若以浓度为横坐标，根据吸光度得到实测蛋白浓度为例如：若以浓度为横坐标，根据吸光度得到实测蛋白浓度为0.02mg/ml, 则待测蛋白浓度则待测蛋白浓度= 0.02mg/ml x x 5 x x 1000=100mg/ml 若以质量为横坐标，根据吸光度得到实测蛋白质量为若以质量为横坐标，根据吸光度得到实测蛋白质量为0.1mg, 则待测蛋白浓度则待测蛋白浓度= (0.