第八章海洋肽类

1、第八章 海洋肽类韩韩 亮645586)浙江工业大学精细化工研究所海洋药物学（海洋药物学（Marine Pharmacology）肽类概述肽类概述海洋肽类海洋肽类氨基酸氨基酸CCHOOHHCH2OHCCHOHHOCH2OHD-(+)-GlyceraldehydeL-(-)-GlyceraldehydeCCOOHHH2NRL-氨基酸氨基酸天然蛋白质中只发现了天然蛋白质中只发现了L-氨基酸氨基酸但在海洋生物和微生物中也发现但在海洋生物和微生物中也发现D-氨基酸氨基酸的存在的存在蛋白质氨基酸20种非蛋白质氨基酸：植物中发现了非蛋白质氨基酸：植物中发现了240种种多官能团饱和脂

2、肪氨基酸多官能团饱和脂肪氨基酸HOOCCH(CH2)3HCNH2COOHNH2HOOCH2CCHCNH2COOHOHCOOHCH2NHOClCOOHHNNCOOH真菌中发现真菌中发现海绵体中分离得到海绵体中分离得到氨基酸的物理性质：等电点氨基酸的物理性质：等电点中性氨基酸：中性氨基酸：两性两性、内盐内盐结构结构高熔点或分解点及不溶于有机溶剂高熔点或分解点及不溶于有机溶剂等电点：当溶液调节至一定的等电点：当溶液调节至一定的pH值时，氨基酸可以两性离子值时，氨基酸可以两性离子的形式存在，将此溶液置于电场中，氨基酸不向电场的任何的形式存在，将此溶液置于电场中，氨基酸不向电场的任何一极移动，即处于电中

3、性状态，这时溶液的一极移动，即处于电中性状态，这时溶液的pH值称为氨基酸值称为氨基酸的的等电点等电点，通常以，通常以pl表示。表示。氨基酸在等电点时，溶解度最小。可用调节氨基酸在等电点时，溶解度最小。可用调节氨基酸等电点的方法分离氨基酸的混合物。氨基酸等电点的方法分离氨基酸的混合物。 CHCOO-NH3+RCHCOO-NH2RCHCOOHNH3+ROH-OH-H+H+ 碱性氨基酸碱性氨基酸需加入碱将溶液调到等电点，故需加入碱将溶液调到等电点，故其等电点大于其等电点大于7。等电点一般在。等电点一般在7.610.8之间。之间。 酸性氨基酸酸性氨基酸需加入酸将溶液调到等电点，故需加入酸将溶液调到等电

4、点，故其等电点小于其等电点小于7。等电点一般在。等电点一般在2.83.2之间。之间。 中性氨基酸中性氨基酸的等电点小于的等电点小于7（负离子要多些）。（负离子要多些）。等电点一般在等电点一般在56.3之间。之间。pH pI 氨基酸以氨基酸以负离子负离子形式存在。形式存在。u分子氨基酸中的羧基与另一分子氨基酸分子的氨基脱分子氨基酸中的羧基与另一分子氨基酸分子的氨基脱水而形成的水而形成的酰胺酰胺叫做肽，其形成的酰胺键称为叫做肽，其形成的酰胺键称为肽键肽键。NH2CHRCOOHNH2CHRCOOH+- H2ONH2CHRCOHNCHRCOOHH2N CHRCHNHCRCO12三肽HNOCHRCOOH

5、3肽肽u由由n n个个-氨基酸缩合而成的肽称为氨基酸缩合而成的肽称为n n肽肽，由多个，由多个-氨氨基酸缩合而成的肽称为基酸缩合而成的肽称为多肽多肽。u一般把含一般把含100个个以上氨基酸的多肽（有时是含以上氨基酸的多肽（有时是含50个个以上）以上）称为称为蛋白质蛋白质。H2N CHCHNOCH2COOH丙氨酰 - 甘氨酸，简写为丙- 甘（Ala - Gly）CH3（）H2N CH2CHNOHCCH3COOH（）甘氨酰- 丙氨酸，简写为甘- 丙（Gly - Ala） C端端：保留游离的：保留游离的羧基羧基； N端端：保留游离的：保留游离的氨基氨基。一般一般N-端氨基酸端氨基酸缩写名称写在缩写名

6、称写在左边左边，C-端氨基酸端氨基酸缩写名称写缩写名称写在在右边右边，每个氨基酸名称中间，每个氨基酸名称中间用一短线联结起来用一短线联结起来 NH2CHCH2CH2CHNOCHC谷氨酰- 半胱氨酰 - 甘氨酸简写为谷- 半胱 - 甘（Glu - Cys - Gly）HOOCCH2HNH2CCOOHSHO这是我国于这是我国于1965年成功年成功合成了世界上第一个具合成了世界上第一个具有生物活性的蛋白质有生物活性的蛋白质-牛胰岛素。牛胰岛素。 多肽结构的测定多肽结构的测定1测定分子量（凝胶柱层析）测定分子量（凝胶柱层析）2氨基酸的定量分析氨基酸的定量分析HClH2O多 肽氨 基 酸层 析 法 分

7、离各 种 氨 基 酸各 种 氨 基 酸 的 含 量多肽结构的测定主要工作：多肽结构的测定主要工作： 了解某一多肽是由哪些氨基酸组成的。了解某一多肽是由哪些氨基酸组成的。 各种氨基酸的相对比例。各种氨基酸的相对比例。 确定各氨基酸的排列顺序。确定各氨基酸的排列顺序。多肽结构测定工作步骤多肽结构测定工作步骤氨基酸分析示意图氨基酸分析示意图 茚三酮茚三酮紫色物质紫色物质 O2NFH2N CHRCONH CHRCONH+O2NHNCHRCONH CHRCONHNO2NO2Na2CO3HClCHRCOOH+ H2N+O2NHNCHRCOOHNO23端基分析（测定端基分析（测定N端和端和C端）端）（1）测

8、定）测定N端（两种方法）端（两种方法）a 2,4- 二二硝基氟苯法硝基氟苯法桑格尔桑格尔(Sanger-英国人英国人)法法此法的缺点是所有的肽键都被水解掉了。此法的缺点是所有的肽键都被水解掉了。黄色黄色b 异硫氰酸苯酯异硫氰酸苯酯(Ph-N=C=S)法法艾德曼艾德曼(Edman)降解法。降解法。C6H5N=C=SNH2CHCONHR多肽+C多肽SNHCHRCONHpH 7pH 7CNCCHHNC6H5ORS+多肽H2NNHC6H5苯基乙内酰硫脲衍生物苯基乙内酰硫脲衍生物（2）测定）测定C端：端：羧肽酶羧肽酶水解法水解法羧肽酶：选择性切断游离羧基相邻的肽键羧肽酶：选择性切断游离羧基相邻的肽键只能

9、鉴定只能鉴定34个氨基酸，对于长链用处不大个氨基酸，对于长链用处不大4肽链的选择性断裂及鉴定肽链的选择性断裂及鉴定 部分水解法常用的蛋白酶有：部分水解法常用的蛋白酶有： 胰蛋白酶胰蛋白酶只水解羰基属于只水解羰基属于赖氨酸、精氨酸赖氨酸、精氨酸的肽键。的肽键。 糜蛋白酶糜蛋白酶水解羰基属于水解羰基属于苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸的肽键。的肽键。 溴化氰溴化氰只能断裂羰基属于只能断裂羰基属于蛋氨酸蛋氨酸的肽键。的肽键。肽类概述肽类概述海洋肽类海洋肽类 肽类是海洋生物活性物质中数量最庞大的一类化合肽类是海洋生物活性物质中数量最庞大的一类化合物，达数万种之上。物，达数万种之上。 近

10、几年已经为广大海洋药物学家所关注，且其部分近几年已经为广大海洋药物学家所关注，且其部分次生代谢产物已进入临床。次生代谢产物已进入临床。环肽环肽肽类毒素肽类毒素直链肽类直链肽类糖蛋白糖蛋白海洋肽类环 肽v环肽：是由氨基酸通过首尾缩合形成环肽：是由氨基酸通过首尾缩合形成酰胺键酰胺键而成而成为具有为具有大环大环的肽类化合物，或通过其余的键如的肽类化合物，或通过其余的键如酯酯键键而形成的而形成的大环大环的肽类化合物。的肽类化合物。v1980年由美国学者年由美国学者ireland从海鞘分离第一个具有从海鞘分离第一个具有抗肿瘤活性的环肽抗肿瘤活性的环肽ulithiacyclamide以来，环肽类以来，环肽

11、类化合物是目前研究最热的肽类化合物。化合物是目前研究最热的肽类化合物。v环肽类主要来自于海鞘、海兔、海绵以及海藻。环肽类主要来自于海鞘、海兔、海绵以及海藻。海鞘海鞘脊索动物门脊索动物门u种类较丰富的被囊动物，约有种类较丰富的被囊动物，约有2000多个品种多个品种u海鞘中含有许多重要的生理活性物质，是除海鞘中含有许多重要的生理活性物质，是除海绵外具有显著药理活性物质的重要来源海绵外具有显著药理活性物质的重要来源。膜海鞘素膜海鞘素 强细胞毒活性强细胞毒活性 目前，美国国立癌症研究所目前，美国国立癌症研究所(NCI)已进行了已进行了I期临床研究，期临床研究，正准备作为新型的抗癌药物正准备作为新型的抗

12、癌药物问世。问世。经分离精制得膜海鞘素经分离精制得膜海鞘素A、B、C，为，为脂肽类环状缩肽脂肽类环状缩肽，由由肽键肽键与与非肽键非肽键联成。联成。 膜海鞘素膜海鞘素B能抑制能抑制 DNA和和 RNA病毒，对病毒，对P388白血病小鼠存白血病小鼠存活期延长活期延长99%，对，对B16黑色素瘤小鼠可延长黑色素瘤小鼠可延长60%，膜海鞘素，膜海鞘素B比比A作用更强，对人类肿瘤在低浓度时（作用更强，对人类肿瘤在低浓度时（0.01g/ml持续作持续作用）对乳腺癌、卵巢癌、肾癌及肉瘤等均有明显活性，在免用）对乳腺癌、卵巢癌、肾癌及肉瘤等均有明显活性，在免疫抑制活性与目前临床上常用的免疫抑制剂类固醇激素等相

13、疫抑制活性与目前临床上常用的免疫抑制剂类固醇激素等相比，其作用要高出比，其作用要高出1001000倍。倍。 海兔海兔海洋腹足类软体动物海洋腹足类软体动物“海粉丝海粉丝”，即海兔胶质丝卵袋的干制品，即海兔胶质丝卵袋的干制品 n近年来，近年来，日本名古屋日本名古屋大学山田静之教授等大学山田静之教授等 “阿普里罗灵阿普里罗灵” ” ，抗癌剂，抗癌剂 n后来，日本后来，日本东京大学东京大学水野传一教授等水野传一教授等利用海兔腺体制成一种高效抗癌剂利用海兔腺体制成一种高效抗癌剂 只对只对癌细胞癌细胞起杀灭作用，对正常细胞无毒性起杀灭作用，对正常细胞无毒性 海兔毒素海兔毒素从从100公斤的海兔萃取得到一系

14、列的环肽，每种公斤的海兔萃取得到一系列的环肽，每种成分大约仅成分大约仅1毫克左右。对毫克左右。对P388白血病老鼠，施白血病老鼠，施以以11g/kg剂量，有剂量，有88生命延长效果。这种极生命延长效果。这种极低的剂量就有极高的延寿效果，使得低的剂量就有极高的延寿效果，使得dolastatin 1成为所有已知成为所有已知抗肿瘤抗肿瘤成分活性最强的一种。成分活性最强的一种。 NHNNHNHNNHH2CNOOSOOOSCONH2Dolastatin 3合成得到合成得到抗肿瘤活性抗肿瘤活性在美国进入第在美国进入第期临床期临床海绵海绵u最低等的多细胞动物，结构较简单，但作为一个生物群体，最低等的多细胞动

15、物，结构较简单，但作为一个生物群体，它们含有极为丰富的生理活性化合物它们含有极为丰富的生理活性化合物u海绵中的许多生理活性化合物实际上是与之共生的藻类海绵中的许多生理活性化合物实际上是与之共生的藻类或其它微生物所产生的。或其它微生物所产生的。Cyclotheonamide日本八丈岛海域海绵中分离得到日本八丈岛海域海绵中分离得到对凝血酶、胰蛋白酶有极强的抑制活性对凝血酶、胰蛋白酶有极强的抑制活性微藻微藻HNNOHCO2HONHYHNNHOOOHCO2HXHHOCH3HH微囊藻素微囊藻素海洋环肽化合物的特征1.海洋环肽中经常有海洋环肽中经常有非正常氨基酸非正常氨基酸，这是海洋环，这是海洋环肽的基本

16、特征，也是保证这类物质有活性的肽的基本特征，也是保证这类物质有活性的重要结构片断。重要结构片断。 非正常氨基酸包括：非正常氨基酸包括： 、 -氨基酸氨基酸，D型氨基酸型氨基酸2.连接方式除了连接方式除了酰胺键酰胺键以外，还有其余连接方以外，还有其余连接方 式，最常见为式，最常见为酯键酯键连接。连接。海洋环肽的提取与分离 环肽化合物的提取和分离有两种方法：环肽化合物的提取和分离有两种方法：（1 1）采用经典的生物碱提取法，即酸溶碱化萃取处）采用经典的生物碱提取法，即酸溶碱化萃取处理后，再用柱层析分离。理后，再用柱层析分离。（2 2）用甲醇或乙醇提取后，提取物经石油醚脱脂，）用甲醇或乙醇提取后，提

17、取物经石油醚脱脂，用氯仿或乙酸乙酯萃取，再通过柱层析、高效液相、用氯仿或乙酸乙酯萃取，再通过柱层析、高效液相、制备薄层以及化学衍生化等方法分离。制备薄层以及化学衍生化等方法分离。 环肽类提取分离中的检测：环肽类提取分离中的检测：（1）对一些特殊的环肽可以采用生物碱显色试剂，如碘化）对一些特殊的环肽可以采用生物碱显色试剂，如碘化 铋钾。铋钾。（2）茚三酮试剂）茚三酮试剂 环肽类直接用茚三酮试剂是不会显色的，环肽类直接用茚三酮试剂是不会显色的，需将环肽类水解成氨基酸再用茚三酮试剂显色。需将环肽类水解成氨基酸再用茚三酮试剂显色。具体操作如下：具体操作如下：点样点样层析层析浓盐酸蒸汽缸浓盐酸蒸汽缸11

18、0度加热水解度加热水解茚三酮茚三酮显色显色环肽结构鉴定 含有不常见的氨基酸含有不常见的氨基酸(-氨基酸、氨基酸、N-取代氨取代氨 基酸以及含有卤素、硫元素和噻唑等基团基酸以及含有卤素、硫元素和噻唑等基团)样品量都比较少样品量都比较少NMR分析分析质谱分析质谱分析二维核磁二维核磁氨基酸组成分析氨基酸组成分析酶解测绝对构型酶解测绝对构型构象分析构象分析NMR分析分析u1H-NMR和和13C-NMR测定测定u提供氨基酸残基质子和碳的化学位移大致归属提供氨基酸残基质子和碳的化学位移大致归属u不损失样品量不损失样品量质谱分析质谱分析u质谱质谱HR-FAB-MS和和FAB-MSu可提供环肽化合物精确的分子

19、量和分子式组成可提供环肽化合物精确的分子量和分子式组成u串联质谱还可提供环肽化合物分子某些重要串联质谱还可提供环肽化合物分子某些重要的碎片结构以及氨基酸的连接顺序等信息。的碎片结构以及氨基酸的连接顺序等信息。u只损失只损失g级的样品量级的样品量二维核磁二维核磁uHMQC,HMBC,1H-1H-COSY, TOSCY, HMQC-TOCSYu结合质谱结合质谱FAB-MSu对环肽化合物分子的化学位移进行全指定，对环肽化合物分子的化学位移进行全指定，并确定氨基酸的连接顺序并确定氨基酸的连接顺序氨基酸组成分析氨基酸组成分析u将环肽加入将环肽加入6N盐酸溶液，加热盐酸溶液，加热1小时小时后用于分析后用于

20、分析u氨基酸自动分析仪氨基酸自动分析仪酶解测绝对构型酶解测绝对构型uL或或D-型氨基酸氧化酶酶解型氨基酸氧化酶酶解u针对有标准品的氨基酸可以用此方法测针对有标准品的氨基酸可以用此方法测定，而对于一些没有标准品的非正常氨基定，而对于一些没有标准品的非正常氨基酸必须采用衍生化再进行酸必须采用衍生化再进行HPLC测定。测定。构象分析构象分析NOESY和和ROESY核磁技术核磁技术CD和和X-rayLFDLA DFDLAHNNH2ONO2O2NFHNNH2ONO2O2NF将试剂与待检测的氨基酸反应，反应生成非对映异构体，将试剂与待检测的氨基酸反应，反应生成非对映异构体，再用再用HPLC测定其保留时间，

21、根据保留时间确定其绝对测定其保留时间，根据保留时间确定其绝对构型，这是一个半经验方法，对于有些氨基酸构型确定构型，这是一个半经验方法，对于有些氨基酸构型确定会产生错误判断。会产生错误判断。肽类毒素海洋活性物质研究中发展最迅速的重要领域之一海洋活性物质研究中发展最迅速的重要领域之一具有神经、心血管、细胞毒作用，以神经毒为主具有神经、心血管、细胞毒作用，以神经毒为主具有麻醉、强心、抗癌、抗菌和抗病毒作用具有麻醉、强心、抗癌、抗菌和抗病毒作用毒性作用强烈、药效高、作用剂量小毒性作用强烈、药效高、作用剂量小分子量相对较小，容易通过基因工程进行大批量生产分子量相对较小，容易通过基因工程进行大批量生产海葵

22、毒素海葵毒素芋螺毒素芋螺毒素海蛇毒素海蛇毒素海葵毒素海葵毒素海葵属于腔肠动物门、珊瑚纲，它的触手及身体富含海葵属于腔肠动物门、珊瑚纲，它的触手及身体富含多肽类毒素和蛋白毒素多肽类毒素和蛋白毒素, ,在受到机械或化学刺激时在受到机械或化学刺激时, ,便便会释放毒素用于抵御敌害及捕捉食物。会释放毒素用于抵御敌害及捕捉食物。海葵溶细胞素海葵溶细胞素海葵神经毒素海葵神经毒素一类重要的毒素一类重要的毒素, 分子量在分子量在1500020000，具有多种生物学活性具有多种生物学活性,如如:溶血性、细胞毒性、溶血性、细胞毒性、心脏刺激活性、使膜去极化、阻断钾离子通道等。心脏刺激活性、使膜去极化、阻断钾离子通

23、道等。分子量在分子量在30005000，主要作用于电压门，主要作用于电压门控钠通道，可用于强心药物的开发。控钠通道，可用于强心药物的开发。l均有均有4649个氨基酸残基组成；个氨基酸残基组成；l存在存在6个个Cys残基残基l包括包括Cys在内共存在在内共存在12个相同的氨基酸残基个相同的氨基酸残基lC末端都是亲水性氨基酸残基末端都是亲水性氨基酸残基l都存在都存在3对二硫键对二硫键海葵毒素基本结构特征海葵毒素基本结构特征芋螺毒素芋螺毒素腹足纲软体动物腹足纲软体动物|全球约有全球约有500种分布于热带海域，主要是印度洋和太平洋种分布于热带海域，主要是印度洋和太平洋海域。海域。|芋螺主要是靠毒液的麻

24、痹作用来征服猎物芋螺主要是靠毒液的麻痹作用来征服猎物|分子小、结构稳定，对受体作用范围大、特异性强，分子小、结构稳定，对受体作用范围大、特异性强，易化学合成，构成了神经药理学探针的宝库，已跃居动易化学合成，构成了神经药理学探针的宝库，已跃居动物神经毒素研究的首位。物神经毒素研究的首位。1）一般由）一般由1031个氨基酸残基组成，含个氨基酸残基组成，含2对或对或3对二硫键。对二硫键。2）药理学活性丰富，能作用于神经肌肉系统的关键传导部）药理学活性丰富，能作用于神经肌肉系统的关键传导部位位Na+通道、通道、Ca2+通道及乙酰胆碱受体等，对受体作用具通道及乙酰胆碱受体等，对受体作用具有高选择性和高亲

25、和性。有高选择性和高亲和性。3）根据作用受体不同，将其分为）根据作用受体不同，将其分为-CTX、-CTX、-CTX及及-CTX等多种类型。等多种类型。芋螺毒素的结构特征和分类：芋螺毒素的结构特征和分类：u-CTX特异阻断突触后膜乙酰胆碱受体；特异阻断突触后膜乙酰胆碱受体；u-CTX特异阻断神经或肌肉电压敏感性特异阻断神经或肌肉电压敏感性Na+通道，抑通道，抑制动作电位的产生；制动作电位的产生；u-CTX特异阻断神经元电压敏感性特异阻断神经元电压敏感性Ca2+通道通道u-CTX特异作用于神经元电压敏感性特异作用于神经元电压敏感性Na+通道，延缓通道，延缓Na+流失活速度，延长动作电位持续时间。流

26、失活速度，延长动作电位持续时间。 海蛇毒素海蛇毒素海蛇主要分布于热带和亚热带海域中，在中国主要产于南海。海蛇主要分布于热带和亚热带海域中，在中国主要产于南海。海蛇的毒素，主要有海蛇的毒素，主要有 4种：种：（1）神经毒素，会引起麻痹，导致死亡。）神经毒素，会引起麻痹，导致死亡。（2）卵磷脂酶，起破坏红血球作用。）卵磷脂酶，起破坏红血球作用。（3）抗凝固酶，能阻止血浆凝固。）抗凝固酶，能阻止血浆凝固。（4）透明脂酸酶，起扩散毒素作用。）透明脂酸酶，起扩散毒素作用。海蛇毒素的致死量依种类而不同海蛇毒素的致死量依种类而不同,一般为一般为310毫克。毫克。通常每条海蛇所含的毒素量高达通常每条海蛇所含的

27、毒素量高达1050毫克毫克(干重干重)。所。所以被咬伤后死亡率很高，可在数小时内死亡。但注射以被咬伤后死亡率很高，可在数小时内死亡。但注射抗抗毒蛇血清毒蛇血清，能很快治愈。，能很快治愈。海蛇毒素具有镇痛作用，且无耐药性和成瘾性，是一海蛇毒素具有镇痛作用，且无耐药性和成瘾性，是一种较为理想的镇痛剂。种较为理想的镇痛剂。直链多肽凝集素凝集素(Lectin)是指一种从各种植物，无脊椎动物和是指一种从各种植物，无脊椎动物和高等动物中提纯的蛋白或结合糖的蛋白，可以对糖及高等动物中提纯的蛋白或结合糖的蛋白，可以对糖及其缀合物可逆专一识别的蛋白质分子其缀合物可逆专一识别的蛋白质分子 ，可以用于血型，可以用于

28、血型的检测等多种生物用途。的检测等多种生物用途。海藻凝集素海藻凝集素来源来源：红藻、绿藻：红藻、绿藻分子量分子量：1000030000结构特征结构特征：组成的氨基酸多为甘氨酸、丝氨酸、和酸：组成的氨基酸多为甘氨酸、丝氨酸、和酸性氨基酸。性氨基酸。海藻凝集素海藻凝集素藻胆蛋白藻胆蛋白主要功用：光合作用的捕光色素的复合体。可以用于临床主要功用：光合作用的捕光色素的复合体。可以用于临床癌症患者治疗的光敏剂，提高敏感度，提高治疗效果。癌症患者治疗的光敏剂，提高敏感度，提高治疗效果。鲎鲎(hu)试剂试剂鲎试剂中含有细菌内毒素敏感的因子鲎试剂中含有细菌内毒素敏感的因子C、因子、因子B、凝固酶原、凝固酶原、凝固蛋白等凝固因子，微量的细菌内毒素即可将其依次激活，凝固蛋白等凝固因子，微量的细菌内毒素即可将其依次激活，引起胶冻样凝集。其程度与检样中内毒素的含量成正比。引起胶冻样凝集。其程度与检样中内毒素的含量成正比。 用于细菌内毒素的检测用于细菌内毒素的检测麝香蛸素麝香蛸素焦谷氨酸焦谷氨酸-丙氨酸丙氨酸-苯丙氨酸苯丙氨酸-异亮氨酸异亮氨酸-甘氨酸甘氨酸-亮氨酸亮氨酸-甲硫氨酸酰氨甲硫氨酸酰氨已知最有效的降压药，具有强烈的催产作用以及显著的外周已知最有效的降压药，具有强烈的催产作用以及显著的外周血管舒张和增加冠脉血流作用血管舒张和增加冠脉血流作用