生化工程整理

1、绪论海洋生化工程：以海洋生物学为基础，利用陆地生化工程和工程原理，将海洋生物技术实验室研究成果推向产业化的一门新兴的综合性学科。生化工程（生物分离）的对象: 1、胞外产品: 产物作为细胞的代谢产物被分泌于培养液中2. 胞内产品: 产物被留在细胞内部 a. 以包涵体(inclusion bodies)形式存在 b. 在细胞周质内或细胞的其它部位 3. 天然产物: 不需经过细胞培养或发酵的体系，包括固体物、固体的提取物以及各类溶液 分离分类：机械分离、输送分离、平衡分离微藻及微藻生物技术微藻生物技术:概念：以微藻生物学为基础，利用微藻生物体系和工程原理，提供商品和社会服务的综合性科学。本质：利用太

2、阳能大量生产生物量，用作人类的有机资源。微藻：概念:指在显微镜下才能辨别其形态的微小藻类类群。微藻的特点：具有叶绿素等光合器官；分裂式繁殖，周期短，易大规模培养；可用海水、咸水或半咸水培养；富含蛋白质、脂肪和碳水化合物等；能合成生物活性物质。光生物反应器：概念：指能用于光合微生物及具有光合能力的组织或细胞培养的一类装置，与一般的生物反应器有相似的结构，有光、温度、溶解氧、CO2、pH值和营养物质等培养条件的调节和控制系统。开放式光生物反应器优缺点：优点：构建简单、成本低廉、操作简便缺点：易受外界环境影响，难以保持较适宜的温度和光照会受到灰尘、昆虫及杂菌的污染，不易保持高质量的单藻培养光能及CO

3、2利用率不高，无法实现高密度培养密闭式光生物反应器的优点无污染，能实现单种、纯种培养培养条件容易控制培养密度高，易收获适合于所有微藻的光自养培养，尤其适合于微藻代谢产物的生产有较高的光照面积与培养体积之比，光能和CO2利用率高等微藻的生长动力学研究是实现高密度培养、降低生产成本的理论基础。微藻的生长动力学：1、微藻生长的特点：微藻是生化反应过程的主体2、微藻生长的本质：复杂的酶催化体系3、微藻的生长过程：复杂的反应过程微藻生物量产量的测量1、藻体细胞计数：血球计数板计数2、吸光度值：最适波长；藻细胞密度与吸光度值的关系曲线3、生物量干重的测量： 方法：取10ml培养液在4500r/min的转速

4、下离心15min后弃上清液，以pH=4的酸化水洗2遍后用PallA/B膜过滤，于105 烘至恒重后以精密分析天平称量。微藻大规模培养的三个关键因素：高效率地捕获和利用光能；高效率地吸收和利用营养；优化微藻的培养工艺条件微藻的最适培养密度在特定的培养环境下能使微藻细胞能以最大或最高的速率生产微藻细胞生物量或某种所期望的微藻产物时的培养密度。光反应光反应包括光能的吸收、传递和转换等过程。其最终电子供体是（H2O ），最终受体是（NADP+ ）。反应结果产生了固定和还原CO2所需的（ 能量ATP ）和（还原力NADPH2), 即光合同化力，同时产生（O2）。暗反应 暗反应实质上是一个酶化学反应过程，

5、这一过程主要受CO2浓度、温度和其他有关培养条件的影响和调控，是固定（CO2）的具体过程，其基本转化途径就是（ 磷酸戊糖还原途径或称卡尔文途径）。在一次循环中，必须动用光反应中合成的（ 12）分子NADPH和（18）分子ATP.Ic：光补偿点，指光合作用形成的物质与呼吸作用消耗的物质相互抵偿时的光强度，与微藻的种类、生态型有关；Ik：光饱和点，表示光合作用达到最大速度时的光强度，也是光反应最大速度和暗反应最大速度的比值。光抑制当光强达到饱和状态时，此时如果不设法改善暗反应的条件，而是仍然继续增加辐照，则会因为过强的光照导致光合色素的氧化和细胞中的某些酶受到氧化伤害而使光合速率开始下降。光衰减现

6、象定义：当光辐射通过培养液时，随着光子的被吸收、反射和散射等而造成的光子通量密度（Photon flux density, PFD）减少的现象。控制外来生物污染方法1、大量接种，利用数量优势使培养的微藻细胞快速达到最适培养密度从而有效地抑制外来生物的生长繁殖；2、控制培养温度或某些特殊培养成分的含量，调节pH值或者利用高浓度的盐分抵御外来生物的入侵；3、利用某些既不影响微藻细胞的生长又对外来生物具有杀灭作用的化学试剂。微藻毒素引发赤潮的微藻有300多种；甲藻 硅藻 针胞藻 蓝藻 定鞭藻等海洋生物活性物质海洋生物活性物质（Marine Bioactive Substances）指海洋生物体内所含

7、有的对生命现象具有影响的微量或少量物质，主要包括海洋药用物质、生物信息物质、海洋生物毒素和生物功能材料等海洋生物体内的天然产物。海洋生物活性物质的特点种类繁多、结构特异；活性高；资源有限，含量通常都很低；获得难 五碳糖六碳糖DL型五碳糖吡喃型糖，C4位（从不对称炭逆时针数）的羟基在上为L型，在下为D型，五碳糖呋喃型糖，C4位（从不对称炭逆时针数）的羟基在上为D型，在下为L型，六碳吡喃型，C4位（从不对称炭逆时针数）的羟基在上为D型，在下为L型，型五碳糖6元吡喃型糖，乳醇基和C4位羟基同面为型，异面为型五碳糖5元呋喃型糖，乳醇基和C4位R基同面为型，异面为型六碳糖6元吡喃型糖，乳醇基和C5位R基

8、同面为型，异面为型微藻活性物质不饱和脂肪酸（PUFA）：二十碳五烯酸（EPA）二十二碳六烯酸（DHA）花生四烯酸（AA）藻胆蛋白：藻红蛋白（PE）藻蓝蛋白(PC)藻红蓝蛋白(PC)别藻蓝蛋白(PEC)微藻色素：叶绿素（占干重）叶黄素 胡萝卜素 藻胆素（藻蓝素和藻红素）其他色素（血球藻含有虾青素）清除氧自由基抗氧化作用的物质虾青素、-胡萝卜素 ，维生素E，藻胆蛋白藻胆蛋白结构测定方法直接测定测定相应基因的核甘酸序列再反推其氨基酸序列藻蓝蛋白含量分析方法：紫外可见分光、滴定原理：基于螺旋藻中藻胆蛋白吸收光谱不同。藻胆蛋白的应用研究范畴用作天然色素；作为药物；作为荧光探针提取方法：反复冻熔、超声波、

9、溶菌酶等来破碎细胞；离心、过滤（粗提液）；盐析、透析、离心、层析等（纯化液）。通常采用的层析法是羟基磷灰石柱层析，所用的洗脱液为梯度浓度的磷酸盐缓冲液。抗氧化剂：胡萝卜素，虾青素，海藻硫酸多糖，褐藻多糖海洋生物毒素：1、内源性 2、外源性河豚毒素：胍胺类 西加毒素：醚类 海葵：肽类 箭毒蛙：甾体生物碱五大类生物毒素：麻痹性贝毒PSP 腹泻性DSP 神经性NSP 记忆性缺失ASP 西加毒素CFP特点：化学结构新颖，作用机制特殊，高生物活性DHA二十二碳六烯酸：1、降压、降脂、降胆固醇等，预防和治疗心血管疾病2、预防和治疗癌症、炎症、糖尿病等，提高人体的免疫调节机能；3、促进脑细胞的生长发育，改善

10、脑的机能。不饱和脂肪酸PUFA：传统上：鱼油；真正的生产者：微藻鱼油中提取的PUFA存在的问题：1、构成和含量随着鱼的种类、季节、地理位置变化；2、胆固醇含量高，并带有腥味；3、加工过程中的氢化处理降低了产量；4、复杂的处理过程，价格昂贵。利用微藻生产PUFA的优点：1、含量高；2、无腥味，不含胆固醇；3、种类单一，分离纯化容易；4、繁殖周期短，容易进行大规模培养；5、可进行基因改造，合成单一的PUFA第四章 海洋生物活性物质制备技术海洋生化制备概念从海洋生物材料中对各种化合物进行分离、提取、纯化，获得目的产物（主要是海洋生物活性物质）的方法与技术。海洋生化制备技术的特点成分组成非常复杂；含量

11、微；稳定性差；制约因素多；分离程序复杂；均一性或纯度的检验比较复杂海洋生化制备的一般过程发酵液或培养液或海洋生物材料（胞内产物细胞破碎）（胞外产物）固液分离浓缩初步纯化纯化精制产品预处理方法粉碎或匀浆；凝集与絮凝；加热；调节pH值；稀释；加入助滤剂对干燥固体行原料先粉碎，新鲜海洋生物原料则需匀浆处理，对植物类物料细胞破碎细胞破碎细胞破碎的阻力主要来自于细胞壁和细胞膜，细胞壁和细胞膜的结构决定了其破碎方法的选取；方法：:按照是否施加外力可分为机械法和非机械法两大类。细胞破碎的目的是释放出细胞内含物机械法：1、固体剪切作用：珠磨法、压榨2、液体剪切作用：高压匀浆、超声破碎非机械法1、干燥处理2、溶

12、胞作用：化学法、物理法、酶溶法离心机的种类低速离心机：细胞和细胞核；高速离心机：细胞器；超高速离心机：蛋白质离心分离法差速离心 (最常用于生化工业)：污染（小分子粘附在大分子上），分离精度有限（相似性质的分子难以分开），振动和对流的影响；密度梯度离心(常用于生化研究, 如蛋白质、核酸分离)；工业：管式-可以冷却 碟式-可以连续操作过滤利用薄片形多孔介质（如滤布）截留固体悬浮液中的固体颗粒；分为死端过滤和错流过滤膜的过滤操作有死端过滤（用于无菌过滤，污染严重，用于金贵药品提纯，一次性）和错流过滤（1、污染轻2、便于连续操作3、有效改善液体分离过程4、提高过滤速度）不同类型过滤装置的特点：管式：优

13、点 易清洗，无死角 缺点 保留体积大，单位体积过滤面积小中空纤维式：优点 保留体积小，单位体积过滤面积大 缺点 需要预处理，单根纤维损坏时，需调换整个膜件螺旋卷绕式：优点 过滤面积大，换新膜容易 缺点 需要预处理，易污染，清洗困难平板式：优点 保留体积小，能耗在管式和螺旋之间 缺点 死体积较大膜分离利用半透膜作为选择性隔离层，有选择性地允许某些组分透过而保留混合物中其它组分，从而达到分离纯化的目的。膜分离的特点及主要问题不涉及相变，对能量要求较低；无化学变化，分离条件较温和；具有设备简单、操作方便、易于自动化、处理效率高等优点。问题：1、膜易受污染 2、耐受性有限 3、效果有限膜材料的基本要求

14、膜材料为惰性，不吸附溶质（蛋白质、细胞、细胞碎片等），膜不易污染，膜孔不易堵塞； 起分离作用的有效膜厚度小，超滤和微滤膜的开孔率高，过滤阻力小；适用的pH和温度范围较广，需要耐高温灭菌，耐酸碱，稳定性高，使用寿命长；满足分离的各种要求，如对菌体细胞的截留、对生物大分子的通透性或截留等；容易通过适当的清洗恢复透过性能，重复利用率高。膜分离的分类微滤膜孔径20 10000nm 超滤250nm 纳滤< 2 反渗透< 1 渗透汽化< 0.5浓差极化在膜分离过程中，一部分溶质被截留，在膜表面及靠近膜表面区域的浓度越来越高，造成从膜表面到本体溶液之间产生浓度梯度，这一现象称为“浓差极化”

15、。 浓差极化不利影响，如何减小影响影响：操作压力必须相应提高，膜的传质阻力大为增加，膜的渗透通量下降减小：1、提高液料的流速 2、增加湍流促进器3、采用膜冲形式进料4.提高温度电渗析电渗析是一种电化学过程，利用膜和电位差从水溶液和其它带荷电的混合物中分离离子物质的膜过程。渗透汽化在膜两侧压差（跨膜压差）作用下，料液侧混合物中优先组分渗透通过膜，并在膜的另一侧表面上汽化，达到混合物脱水（易挥发溶质)与分离，获得纯化产物的一种新型膜分离技术。膜组件由膜、固定膜的支撑物、间隔物以及容纳这些部件的容器构成的一个单元（unit）。管式、板框式、卷式、中空纤维式膜分离过程的影响因素（1）操作形式：减轻浓差

16、极化或减小凝胶层厚度（2）流速：流速升高，传质系数增大，透过通量增大（3）压力：因此操作压差愈高，渗透通量增大，但压差增大往往导致浓差极化的增加；操作压差的增大将导致能耗增加（4）其它：1、料液的预处理：处理料液以增加分离过程的效率。调整pH值2、温度：升高有利于降低浓差极化影响，提高膜的渗透通量，但导致能耗增大，寿命影响3、膜的清洗：污染，导致膜通量的下降，需要清洗。膜清洗的方法有两种：物理清洗和化学清洗（1、用草酸、柠檬酸或EDTA等配制的清洗液除去金属氧化物沉淀；2、加酶洗涤剂对有机物，特别是蛋白质、多糖类和油脂类污染物有较好的清洗效果。3、双氧水溶液除有机物4、胶体堵塞，可用尿素、硼酸

17、、醇等作清洗剂）沉淀分离法沉淀法也称溶解度法，其纯化物质的原理是根据物质的结构差异（如蛋白质分子表面疏水基团和亲水基团比例的差异）来改变溶液的某些性质（如pH值、极性、离子强度、金属离子等），使提取液中有效成份的溶解度发生变化，从而达到从提取液中分离有效成份的目的。沉淀分离的优缺点技术成熟、设备简单、成本低、原料易得、便于小批量生产；所得沉淀物中可能聚集有多种物质，含有大量盐类或包裹着溶剂，产品纯度低盐析法一般在低盐浓度的情况下，各种生物分子的溶解度随盐浓度的升高而增加，这种现象称为盐溶；而当盐浓度升高到一定程度后，生物分子的溶解度又随着盐浓度的升高而降低，结果使生物分子沉淀析出，这种现象称为

18、盐析作用。在同一浓度的盐溶液中，不同生物分子的溶解度不同，借此可达到彼此分离的目的。主要用于蛋白质和酶的分离。硫酸铵作为盐析剂的优点1、硫酸铵在水中的溶解度很高，而且溶解度受温度的影响很小2、沉淀中的硫酸铵可以在将沉淀重新溶解后，用透析、超滤、层析方法去除；3、高浓度的硫酸铵对细菌有抑制作用；4、硫酸铵溶于水不产生热量；5、硫酸铵沉淀蛋白质的能力很强，其饱和同业能使大多数的蛋白质沉淀下来，使酶没有破坏作用；6、价格便宜。影响蛋白质盐析的因素：1、蛋白质浓度蛋白质浓度高时，欲分离的蛋白质常常夹杂着其他蛋白质一起沉淀出来（共沉现象）。因此在盐析前要加等量生理盐水稀释，使蛋白质含量在2530g/L。

19、 2、离子强度和离子类型的影响离子强度增加，溶解度下降，盐析易发生；不同蛋白质盐析时所需离子强度不同，可采用分步盐析，通过逐步增加离子强度，使不同蛋白分步沉淀出来；离子强度相同时，高价离子，半径小的离子盐析力强 3、pH的影响大多数蛋白质在等点电时，在盐溶液中的溶解度最低。所以盐析时溶液pH值调到等电点效果最好。 4、温度的影响在低离子强度或纯水中，温度升高，溶解度增加；在高盐溶液中，温度升高，溶解度降低。一般在室温下进行盐析；温度敏感的蛋白质在低温4进行；也有个别酶在低温时失活，高温有活性，如血红蛋白、肌红蛋白、清蛋白在25比0时溶解度低，更容易盐析。等电沉淀法利用蛋白质等两性活性物质在等电

20、点时溶解度最低以及不同的两性物质具有不同等电点一这特性，对其进行分离纯化的方法称为等电点沉淀法。等电沉淀法经常与盐析法或有机溶剂沉淀法联合使用。有机溶剂沉淀利用不同蛋白质在不同浓度的有机溶剂中的溶解度不同而使蛋白质分离的方法，称为有机溶剂沉淀法。经常使用的有机溶剂是乙醇和丙酮。优点：比盐析法析出的沉淀容易过滤或离心分离，分辨力比盐析法好，溶剂也容易除去。缺点：易使蛋白质和酶变性，所以操作必须在低温条件下进行。 选择性变性沉淀法：选择一定的条件使溶液中存在的某些杂蛋白变性沉淀而不影响所需蛋白质的方法称为选择性变性沉淀法。PEG（聚乙二醇）非离子多聚物沉淀法：分离纯化酶及核酸优点：在室温条件下可进

21、行；沉淀颗粒比较大，产物容易收集；可以提高被沉淀剂的稳定性缺点：比其他沉淀剂更难除去，需用超滤和液液萃取海洋生物活性物质的提取技术将提取溶剂加入固相或另一液相中，使其中所含的一种或几种组分溶出，从而使化合物得到完全或部分分离的过程。海洋生物活性物质的提取特点1、生物系统的复杂性，包括组分的复杂性和相的复杂性；2、传质速率3、相分离困难。4、产物的不稳定性。5、与时间有关的过程行为。提取溶剂的选择：1、相似相溶2、碱性物质易溶于酸性溶剂中，酸性物质易溶于碱性溶剂中；3、在极性溶液中，随着溶剂的介电常数的减少，溶质的溶解度也随之减少；4、选用的溶剂对杂质的溶解度尽量要小，不能与提取的物质起化学反应

22、，而且是安全无毒的影响提取效果的因素浸提温度、浸提压力、浸提时间、浸提时固液两相的相对运动速度煎煮法 煎煮法适用于有效成分能溶于提取溶剂，对热、湿均稳定且不易挥发的原料。缺点：煎出液中杂质较多；易霉变腐败；含淀粉类、黏液质等成分的原料；煎煮后溶液黏度大，不易过滤；一些不耐热及挥发性成分在煎煮过程中易被破坏或挥发损失。浸渍法 是将原料用适当的溶剂在常温或温热条件下浸泡出有效成分的一种方法。 适宜有效成分遇热易挥发破坏对的原料，不适用有效成分含量低的原料渗漉法 将原料粉末湿润膨胀后将于渗漏器内，浸出溶剂从渗漉器上部添加，溶剂渗过原料层往下流动过程中将成分浸出的方法。水蒸气蒸馏法 将原料组分或碎片浸

23、泡润湿后，加热蒸馏或通过水蒸气蒸馏，也可在多功能提取器中边煎煮边蒸馏，原料中挥发成分随水蒸气蒸馏而带出，经冷凝后分层收集。该法适用于具有挥发性，能随水蒸气蒸馏而不被破坏，难溶或不溶于水的化学成分的提取分离。 适宜挥发性，遇水蒸气不被破坏，难溶的化学成分提取双水相萃取的特点与应用两相中水分含量高（8595），活性蛋白或细胞在这种环境中不会失活；可直接在含菌体的发酵液或培养液中萃取蛋白质，甚至在不破碎的条件下，提取胞内酶；萃取原理及操作与普通溶剂萃取相同，易于连续操作，处理量大，适合工业应用；操作条件温和，在常温常压下进行；若两相密度差小，则相分离较困难；双水相亲和分配纯化技术蛋白质在上层相和下层

24、相浓度之比称为该蛋白质的分配系数K，将一些小分子配基共价连接到形成相的多聚物之上，使生物大分子在双水相系统中的分配性能与生物识别原理相结合，就是双水相亲和分配纯化技术。反胶束反胶束，也称反胶团，是表面活性剂分散于连续有机相中自发形成的纳米尺度的一种聚集体，反胶束溶液是透明的、热力学稳定的系统。临界胶束浓度胶束形成时所需表面活性剂的最低浓度。反相胶团萃取的优点成本低、选择性高、操作方便、放大容易、萃取剂 (反胶团相 )可循环利用、蛋白质不易变性等优点。 影响反胶束萃取蛋白质的主要因素1、水相pH值，对于带有正电荷的表面活性剂，pH值高于等电点时，有利于蛋白质溶于反胶束，阴离子表面活性剂则相反2、

25、离子强度3、温度：低温4、亲和表面活性剂超临界流体萃取利用超临界流体在超过气液共存状态时的性质来溶解某种、液体或它们其中的某些组分，并且利用这种能力从固体或液体中萃取分离高沸点或热敏性成分，或去除有害成分，从而达到分离、提纯的目的。泡沫分离泡沫分离是以泡沫为分离介质，以组分之间的 表面活性差异作为分离依据，利用气体在溶液中鼓泡来达到浓集物质目的的一种分离技术。包括两个：泡沫浮选，利用泡沫对微粒、离子、分子、胶体等的表面吸附作用进行浮选分离；泡沫分馏，是泡沫有选择性地将待分离成分吸附，泡沫层浮在溶液上部，然后将泡沫收集并进行消泡处理。进行泡沫分离的两个充分必要条件：要有很大的气液接触表面；待分离

26、的物质具有表面活性，并且溶液中各组分的表面活性要有差异。泡沫分离的优缺点及应用优点：设备简单；可连续操作；容易放大；能耗低；常温或低温下操作缺点：捕集剂难于回收；消耗量大；泡沫塔返混现象严重等。应用：热敏性和化学不稳定性成分（蛋白质或酶），还特别适用于低浓度组分的浓缩和回收，如从发酵液中回收生物大分子或生物制品等。亲和作用生物分子间的特异性相互作用就称为生物亲和作用或简称为亲和作用。通过亲和作用发生的结合称为特异性结合(specific binding)或亲和结合(affinity binding)。亲和纯化技术：基于亲和作用的生物分离方法 影响亲和作用的因素离子强度 静电作用、疏水相互作用；

27、pH 静电作用；温度静电作用、氢键、配位键、疏水相互作用；抑制氢键物质（脲和盐酸胍）氢键；离液离子疏水相互作用；螯合剂（EDTA)金属离子的配位键抗原抗体反应:指抗原与相应抗体之间所发生的特异性结合反应。特点：特异性、可逆性、比例性、阶段性亲和层析法的四要素配基 ；耦合反应；杂质；洗脱亲和膜分离的不足膜的厚度有限，理论板数低；膜的污染和堵塞，使用寿命有限亲和过滤的特点亲和过滤=亲和吸附+膜分离；以压差为推动力，速度快，易于放大和连续化操作；亲和载体的引入大大提高了膜分离的选择性；亲和吸附中的内扩散阻力可以消除；一级吸附平衡，分离效率不如亲和层析；可以采用多级串联的操作方式加以弥补吸附分离吸附分

28、离是指混合物随流动相通过固定相时，因固定相对不同物质吸附力的不同而使混合物分离的方法。吸附剂：活性炭、活性氧化铝、硅胶、分子筛、活性白土、滑石粉、硅藻土、大网格聚合物。浓缩低浓度溶液通过除去溶剂转变为高浓度溶液的过程。干燥把产品中的液体含量（水或有机溶剂），从开始时的某一值降低到允许值的过程。去除潮湿的固体、膏状物、浓缩液及液体中的溶剂得到相对或绝对干燥产品的过程。冷冻干燥的基本原理使被干燥的液体在极低的温度下，冷冻成固体；然后，在低温、低压下利用水的升华性能，使冰升华汽化而除去，以达到干燥的目的；冷冻干燥法适用于绝大多数生物产品的干燥和浓缩，可以最大限度地保证生物产品的活性。电泳分离：利用荷电溶质在电场中泳动速度的差别进行分离电泳原理:带电粒子在电场中朝与自身带相反电荷的电极移动的现象影响泳动速度的因素:1、带电颗粒