科学研究训练实验讲义

1、科学研究训练实验讲义复旦大学化学系2008-2-15目 录实验实验题目页码教 师1过渡金属催化的Sonogashira偶联反应1-4孙兴文2CO在负载纳米金（铜）催化剂上吸附的原位红外光谱研究4-19曹 勇3质粒DNA的提取、酶切和基因表达19-25王韵华416电子体系碳硼烷化合物Cp*IrE2C2(B10H10)的合成25-27金国新5不溶性有序分子膜、Langmuir-Blodgett膜的制备与表征27-33钱东金6原位红外光谱技术测定固体催化剂表面的酸性质33-38牛国兴7细胞色素c突变体蛋白的催化反应动力学测定38-42谭相石8负载型Pd系催化剂的合成及催化反应43-48任 楠9多组份

2、反应合成a-氨基膦酸酯类化合物49-51吴 劼101,2,3,4,5Pentamethylcyclopentadiene（Cp*）的合成51-56郑文军11(S)脯氨酸催化的交叉Aldol缩合反应56-58王全瑞实验一 过渡金属催化的Sonogashira偶联反应实验目的1 熟悉过渡金属催化的现代有机合成的方法学，理解Sonogashira偶联反应的催化机理，了解金属有机化学的四大基元反应；2 掌握无水无氧的操作过程及原理；熟练掌握TLC（薄层板色谱）过程及展开剂的选择；3 掌握快速柱层析分离少量有机化合物的方法；学习分析1H-NMR图谱，对数据进行归属；实验原理过渡金属催化的偶联反应在近三十

3、年来引起了合成化学家的极大兴趣，是现代有机化学的核心组成部分之一，同时也是现代有机化学的研究热点领域，它们“魔术”般的催化作用为一些在通常情况下难于构建的碳碳键、碳氮碱、碳氧键等提供了简洁高效的方法学。目前，基于过渡金属催化的有机反应，已经被广泛的应用于复杂天然产物、药物分子、液晶材料、功能材料等的合成中。 1975 年K. Sonogashira和他的合作者研究发现，在PdCl2(PPh3)2和CuI同时存在下，乙炔气体可以在温和的条件下与芳基碘化合物或烯基溴化合物偶联得到取代的炔烃；同年，R.F. Heck和L. Cassar也分别独立报道了类似的结果，但他们的没有用到助催化剂CuI，反应

4、条件也比较苛刻。后来，由Pd/Cu 混合催化剂催化的末端炔烃与sp2碳的卤化物之间的交叉偶联反应通常被称之为Sonogashira反应(Scheme 1)。目前, Sonogashira 反应在取代炔烃以及大共轭炔烃的合成中得到了广泛的应用，在很多天然产物、农药医药、新兴材料以及纳米分子器件的合成中起着关键的作用。Scheme 1Sonogashira偶联反应的机理是有两个催化循环组成的。亚铜的催化循环过程中，首先，碱攫取末端炔烃上的氢，然后与亚铜盐作用生成炔基铜中间体A；零价钯的催化循环过程中，首先零价钯与芳基卤代物发生氧化加成生成中间体B，中间体B与中间体A发生转金属化生成中间体C并再生亚

5、铜盐，完成亚铜催化剂的循环，中间体C发生还原消除生成偶联产物同时再生零价钯，完成零价钯的催化循环(Scheme 2)。Scheme 2实验内容：本实验是利用Sonogashira偶联反应合成2-苯乙炔基苯甲醛化合物(Scheme 3)。Scheme 3实验目的：一，熟悉过渡金属催化的现代有机合成的方法学，理解过渡金属催化的Sonogashira偶联反应的催化机理，了解金属有机化学的四大基元反应；二，掌握较严格的无水无氧的操作过程及原理；三，熟练掌握TLC（薄层板色谱）过程中合适展开剂的选择以及TLC跟踪无水无氧反应的方法；四，掌握快速柱层析分离少量有机化合物的方法；五，进一步熟悉专业有机实验室

6、的设置以及强化常规仪器如油泵、旋转蒸发仪等的使用；六，学习分析1H-NMR图谱，对数据进行归属。实验试剂与仪器试剂：CuI，PdCl2，PPh3，邻溴苯甲醛，苯乙炔，乙酸乙酯，石油醚，三乙胺，氢氧化钠，乙醇，丙酮，硅藻土，硅胶，石英砂，苯甲腈等。仪器设备：旋转蒸发仪，水泵、真空油泵、双排管、高纯氮气钢瓶，红外烘箱，磁力搅拌器，磁力搅拌子，调压器，加热圈，结晶皿，回流冷凝管、温度计、温度计套管、橡胶塞，抽气头，加料漏斗，砂芯抽滤漏斗（带磨口），层析柱，紫外灯，加压球，50mL三颈烧瓶、100mL烧瓶，10mL烧瓶，试管，试管架，储液球，球形冷阱，硅胶板，毛细管，玻璃刀，钢尺，胶头滴管，层析缸，称

7、量纸，药匙，泵油，硅油，真空橡胶管，普通橡胶管，聚乙烯手套，洗瓶，烧瓶托，真空干燥器，橡胶塞，标签纸，瓷缸，针筒，针头，托盘，铁架台，十字夹，烧瓶夹。实验步骤1. PdCl2(Ph3)2的制备1： 称取70mgPdCl2(0.395mmol)溶于2mL苯甲腈中，在100oC下加入搅拌23小时至PdCl2完全溶解后，趁热过滤，用少量石油醚洗涤，冷却至室温，析出黄色固体PdCl2(PhCN)2，过滤，再将滤液用少量石油醚稀释，再过滤，合并后抽干得130mg PdCl2(PhCN)2。将它和178mg (0.678mmol) PPh3溶解在2mL苯中，室温搅拌1.5小时，再加热回流3小时，冷却至室温

8、，有固体析出，过滤，抽干得209mg PdCl2(PPh3)2，总产率为88%。2. Sonogashira偶联反应；在干燥的50mL三颈瓶中加入邻溴苯甲醛（925mg，5mmol），苯乙炔（612mg，6mmol）和三乙胺（20ml），PdCl2(PPh3)2（70mg，2mmol%），在干冰-丙酮（或者液氮-乙醇）冷却下抽真空和冲氮气三次后，撤去冷浴，在氮气保护下，让其自然回到室温后，反应5分钟，然后迅速加入CuI（10mg，1mmol%），再加热至50oC，氮气保护下进行反应，TLC跟踪反应至反应终了（约4小时），将反应体系冷至室温，硅藻土过滤除去生成的无机盐，滤渣用乙酸乙酯洗涤三次，浓

9、缩，快速柱层析，得到黄色油状产物927mg，产率为90%。核磁表征产品，并对数据进行归属。思考题1. 在加入催化剂的过程中为什么需要低温冷却？2. 是否可以由别的过渡金属代替Pd或者Cu实现这一过程?3. 对于目标产物是否有别的方法可以构建？对于sp2碳和sp碳的偶联，除了Sonogashira偶联反应还有哪些别的方法？他们之间有何不同？4. 是否可以尝试别的后处理方式，比如加入水，然后有机溶剂萃取等？参考文献1PdCl2(PPh3)2的制备：a) Anderson, G. K.; Lin, M. Inorg. Synth. 1989, 28, 60. b)King, A. O.; Negis

10、hi, E. J. Org. Chem. 1978, 43, 358.2Sonogashira偶联反应：a) Sonogashira, K., Tohda, Y., Hagihara, N. Tetrahedton Lett. 1975, 4467. b) Dai G.-X. , Richard C. L. Org. Lett. 2001, 3, 4034. c) Fukuyama, T., Shinmen, M., Nishitani, S., Sato, M., Ryu, I. Org. Lett. 2002, 4, 1691. 实验二 CO在负载纳米金（铜）催化剂上吸附的原位红外光谱研究

11、实验目的1、熟悉并掌握催化材料的红外表征技术中包括红外光谱的基本原理、制样、原位池的原理、构造及使用以及一氧化碳（CO）等基本探针分子的吸附研究等实验技能；2、以CO为探针分子，采用原位红外吸附实验测定不同制备及预处理条件下得到的Au/CeO2、Au/ZrO2及CuO/CeO2等催化剂中高分散金、铜物种的化学状态；3、结合CO低温氧化活性评价及XPS、TEM测试等表征手段分析并探讨Au/CeO2、Au/ZrO2、CuO/CeO2等催化剂中金、铜活性物种的价态、金属-载体相互作用及催化本质。4、掌握原位红外、吸附、化学状态、金催化、铜催化、金属-载体相互作用和一氧化碳低温氧化等化学概念实验原理催

12、化是现代化学工业、石油加工工业、能源、制药工业以及环境保护以及医药、农药、表面活性剂等精细化学品合成中的关键技术，其核心是催化剂。在化学工业生产中催化过程占全部化学过程的80以上。因此，催化科学技术对国家的经济、环境和公众健康起着关键作用。当前，人们对生活质量和环境问题日益重视，而许多现代的低成本且节能的环境技术都同催化技术相关，因此世界各国均把催化技术视为实现国民经济可持续发展的关键技术之一，进而给催化科学和催化技术的发展提供了更加广阔的前景。到目前为止，人们认识到的催化剂是一种物质，它通过基元反应步骤的不间断地重复循环，将反应物转变为产物，在循环的最终步骤催化剂再生为其原始状态。更简单地说

13、：“催化剂是一种加速化学反应而在其过程中自身不被消耗的物质。”许多种类的物质都可用作催化剂，如金属、金属氧化物、金属硫化物、金属有机络合物及酶等。催化技术，尤其是多相催化技术已成为调控化学反应速率与方向的核心科学。催化同时也是一门复杂的跨学科的综合性科学。因此，催化及其实际应用的进展将取决于若干学科领域的平行发展，而最有可能的是涉及新催化材料的合成和催化反应的反应途径的识别。因为这一原因，许多研究集中在新催化材料的探索、发现以及发展能原位观察反应过程或催化活性位的方法，近年来在许多领域已取得重大的进展和科学突破，其中包括金属表面的原子水平的分辨，例如利用隧道扫描电镜（STM）技术研究氧化物（如

14、TiO2）表面的气固反应机理取得了重要进展；用核磁共振（NMR）谱原位观察烯烃与沸石分子筛酸性位络合情况和用各种分子光谱技术原位表征反应中间物等，都为发展催化理论和全新的催化技术及进一步改善现有工艺提供了新的可能性。本实验中，我们将在以氧化铈（CeO2）、氧化锆（ZrO2）为载体的Au/CeO2、Au/ZrO2、CuO/CeO2等催化剂的制备及其CO低温氧化反应性能评价的基础上，以CO为探针分子，采用原位红外光谱研究其在不同处理阶段以及状态下的纳米金（铜）催化剂上的静态及动态吸/脱附行为。其间，拟通过原位红外探针技术及方法的建立与完善深入研究并揭示金（铜）纳米催化体系中金属活性位的存在状态、金

15、属-载体间相互作用等关键科学问题。金，历来被认为是化学惰性的金属，相对其它贵金属，其催化潜力一直未能引起足够的重视。20世纪80年代后期，Haruta发现沉积在Fe2O3、TiO2等氧化物载体上的金纳米粒子具有很高的低温CO催化氧化活性，且具有其它贵金属不具有的湿度增强效应，打破了金不具备催化活性的传统观念，人们由此对其催化特性产生了极大的兴趣和关注。近来大量研究表明金有潜在的催化多种化学反应的能力，并有望在精细化学品合成及环境治理等领域全面或部分取代现有的Pd、Pt等贵金属催化剂，显现出巨大的研究潜力和广阔的应用前景。氧化物担载纳米金催化剂及其催化应用由于现有研究手段和工具的限制，关于金催化

16、剂的活性中心及其本质一直都没有形成较明确的认识。金催化研究的日趋活跃并没有使这一问题变得清晰反而由于实验条件和方法的不同带来更多争议。研究表明金的催化活性与金纳米粒子的粒径大小及形状、金的配位状态及配位环境、载体特性、金-载体相互作用以及金的价态等诸多因素密切相关。其中，反应状态下活性金物种的化学状态（Au3+, Au+, Au0 或Au-）一直是争论的焦点。通常认为在金催化CO氧化反应中，在金-载体接触界面处的阳离子金物种（Aud+）是CO催化氧化的活性中心，但也有观点认为活性位是由Au0 与Aud+共同参与构成的。甚至有推测认为阴离子态的金物种（Aud-）才是CO氧化反应活性中心的重要组成

17、部分。在这个实验中，我们将通过CO在负载型纳米金（铜）催化剂上吸附的原位红外光谱来研究金、铜活性物种的价态及金属-载体相互作用。由吸附分子的红外光谱（IR）可以给出表面吸附物种的结构信息，尤其采用“原位”（in situ）技术可以得到在反应条件下吸附物种结构的信息。目前，红外光谱技术已经发展成为催化研究中十分普遍和行之有效的方法。研究的对象可以从工业上实用的负载型催化剂、多孔材料到超高真空条件下的单晶或薄膜样品。它可以同程序升温热脱附（TPD）、四极质谱（MS）、色谱（GC）等近代物理方法在线联合，获得对活性位结构及催化作用机理更深入的了解。如果同原位X射线衍射仪（XRD）、电镜（TEM）、热

18、分析（TD/DTA）技术相结合，可研究催化剂合功能材料的相变、体相组成结构的变化及表面官能团的变化。从分子固体的红外光谱（IR）和拉曼光谱（Raman）还可以研究分子晶体的对称性、畸变晶体纵向和横向的变化以及缺陷造成的影响。考虑到CO 的吸附行为很强地依赖于金属的荷电状态（比如，CO在Aud+上吸附较强，从而导致CO伸缩振动频率的蓝移，相反CO和Aud-作用较弱，会导致CO伸缩振动频率的红移），通过对金（铜）催化剂表面羰基物种红外光谱的分析和归属可基本确定催化剂表面金物种及铜物种的化学状态。由于金（铜）催化剂结构的复杂性和敏感性，表面相关羰基物种的精确归属和指认目前一直未能形成较一致的认识。在

19、这个实验中，为进一步精确指认金（铜）催化剂表面活性物种的化学特性及氧化价态，我们将在对现有相关文献详细归纳分析的基础上开展CO在负载型纳米金（铜）催化剂上吸附的原位红外光谱研究。结合X射线光电子能谱（XPS）测试可进一步较准确地测定Au的荷电状态。此外，还可以结合原位吸、脱附实验测定CO分子在催化剂表面的吸附活化能或脱附活化能。实验仪器与试剂1、仪器：Bruker Vector 22红外光谱仪；漫反射（透射）原位红外池及附件；气体质量流量计；程序升温仪；XRD粉末衍射仪；X-射线光电子能谱仪；pH计；小型在线质谱仪等2、试剂：氯金酸；硝酸铜；硝酸铈；硝酸锆；氧化铈；氧化锆；草酸；乙醇等实验前准

20、备工作1、阅读在 CATTEC 及Chemie Ingenieur Technik上发表的描述金催化的制备、应用及表征的文献。这两篇论文来自“原始”的科学文献，易懂并且提供了有关金催化议题及催化原位红外表征技术的有趣背景。除此之外，它提供给你一些完成这个实验的必要细节。2、学习实验讲义中有关红外光谱仪工作原理、漫反射红外工作原理、红外原位池工作原理、金催化剂制备、一氧化碳（CO）低温氧化活性评价等的技术部分。3、完成实验前的预习报告，即写出阶段工作目标、阶段实验目的、实验注意事项以及实验简要过程（不要简单拷贝实验讲义中的步骤整理实验报告）等。多数需要的信息都可以从上面的两篇论文中获得，但是应注

21、意下列的提示和修正：1）你们要研究的催化体系是Au/CeO2、Au/ZrO2及CuO/CeO2而非Au/TiO2及Au/NaY。2）对于羰基化合物的归属和指认，铜与金可能会有所不同，请注意加以区分。3）你们的实验条件会和CATTEC 及Chemie Ingenieur Technik论文提及与报道的有点出入，可能需要进一步探索和调整。实验步骤1、 催化剂制备1） 采用沉积-沉淀（Deposition-Precipitation，DP）法制备纳米金催化剂。用1 mol×L-1的NaOH溶液将H2AuCl4稀溶液（含金 0.02 克）调至pH值等于8-10，在不断搅拌下，将1 g氧化物载

22、体（CeO2、ZrO2等）分散于其中，沉淀反应1 h后将悬浮液过滤，滤饼经洗涤、干燥，再经一定温度下的空气中焙烧或氢气还原即得氧化物负载纳米金催化剂。2） 采用草酸盐胶态共沉淀（Oxalate Gel Coprecipitation method）法制备纳米铜铈催化剂。配置摩尔浓度比Cu:Ce = 1:9的混合硝酸盐的乙醇溶液。室温下，缓慢将过量20的草酸溶液加入到上述硝酸盐混合溶液中，形成胶状粘稠的沉淀物，室温陈化24小时之后在110烘箱中干燥12小时，再于空气气氛350 oC焙烧4小时制得纳米铜铈催化剂。2、催化剂的活性评价CO氧化反应在小型固定床连续流动反应装置上进行。U 型石英质反应管

23、，内径为4 mm，放置于加热炉或冷阱内以控制反应温度。评价方法如下：称取20 -50 mg催化剂装入反应管中，反应气路切换为 1%CO-20%O2-79%He 混合气（流速 37 ml×min-1），反应温度由高逐渐降低，直到可使CO完全转化，并能稳定15 min，此时的反应温度称为最低全转化温度，以T100表示，T100.越低，表明CO越容易被氧化，催化剂的活性越高。使用在线质谱仪（Balzers Omnistar TM200）分析反应混合气中CO的含量。3、红外测试制样将红外光谱用于催化剂研究需要解决的首要技术问题是样品制备。在红外光谱研究中发展了许多样品制备方法，但目前应用最广

24、泛的是负载型催化剂压片制备方法，其中样品厚度至关重要，最合适的样品厚度应由样品自身的吸收和散射共同决定。通常将样品压制成自支撑片（10 mg，f 13 mm）用于透射红外测定研究（详见红外制样技术部分）。当样品颜色较深且对红外吸收较强时，通常采用漫反射技术，此时无需制作自支撑的样品薄片，而可直接使用粉末样品进行实验测试，但样品粒度需严格控制。4、CO红外吸附实验根据实验需要，选择透射或漫反射模式进行原位红外吸附实验。将自支撑片或粉末样品置于高温-高压原位红外池中。样品首先在常压流动的空气或H2、He等气氛（流量20 ml×min-1，质量流量计控制）中试漏，随后升温至150-300

25、oC处理1 h，随后切换成N2并吹扫30 min，且在N2中降至室温（25 oC），采摄不同温度的本底红外图谱A。向原位池中引入组成分别为1%CO-99%He、5%CO-95%He、1%CO-20%O2-79%He等的混合气，并在不同时间及温度下记录图谱C。图谱C与不同温度的本底红外图谱A的差谱即为催化剂表面吸附了CO或反应条件下的红外谱图。为检验高分压下气相CO的影响，可进一步详细研究不同分压CO吸附的红外谱图D。也可以在同样的吸附分压下采用时间跟踪模式在同一样品上采摄系列吸附红外谱图或脱附红外谱图E或F。据此可测定CO分子在催化剂表面的吸附活化能或脱附活化能。数据分析与处理1） 通过与文献

26、结果的比对，可以对不同样品及处理条件下得到的CO吸附红外结果进行初步的分析。考虑到CO 的吸附行为很强地依赖金属的荷电状态（比如，CO在Aud+上吸附较强，从而导致CO伸缩振动频率的蓝移，相反CO和Aud-作用较弱，会导致CO伸缩振动频率的红移），结合XPS测试可进一步较准确地测定Au的荷电状态。Spectral regions of performance of surface carbonyls of gold (in +3, +1, 0 and 1oxidation states) on various supports (adapted from Ref. 2)2） 此外，还可以进一步

27、结合原位吸、脱附实验的红外羰基振动峰强度随时间及吸附压力的动态变化测定CO分子在催化剂表面的吸附活化能或脱附活化能（详见文献4）。3） 结合一氧化碳（CO）低温氧化活性评价实验结果，仔细比较、分析关联催化剂中金、铜物种价态以及载体特性的差异对催化性能的影响。4） 以科技论文形式撰写实验报告。参考文献1M. Haruta, “Catalysis of gold nanoparticles deposited on metal oxides,” Cattech 2002, 6, 102-115.2M. Mihaylov, H Knözinger, K Hadjiivanov, B C.

28、Gates, “Characterization of the Oxidation States of Supported Gold Species by IR Spectroscopy of Adsorbed CO,” Chemie Ingenieur Technik, 2007, 79, 795-806.3F. Vindigni, M. Manzoli, A. Chiorino, T. Tabakova, F. Boccuzzi, “CO Adsorption on Gold Clusters Stabilized on Ceria-Titania Mixed Oxides: Compar

29、ison with Reference Catalysts,” J. Phys. Chem. B 2006, 110, 23329-23336.4 P. Gravejat, S. Derrouiche, D. Farrussengn, K. Lombaert, C. Mirodatos, D. Bianchi, “Heats of Adsorption of Linear and Bridged CO Species Adsorbed on a 3% Ag/Al2O3 Catalyst Using in situ FTIR Spectroscopy under Adsorption Equil

30、ibrium,” J. Phys. Chem. C 2007, 111, 9496-9503.附1：Bruker Vector 22 傅立叶变换红外光谱仪一、 工作原理傅立叶变换红外光谱仪（Fourier Transform Infrared Spectrometer, FTIR）是基于光相干性原理而设计的干涉型红外光谱仪。由于干涉计不能得到人们业已习惯并熟知的光源的光谱图，而是干涉图，为此可根据数学上的傅立叶变换函数的特性，利用计算机将其光源的干涉图转换程光源的光谱图。即将以光程差为函数的干涉图像变换成为以波长为函数的光谱图，故将这种干涉型红外光谱仪称为傅立叶变换红外光谱仪。1 F

31、TIR光谱仪的基本结构FTIR光谱仪是由光学测量系统、计算机数据处理系统、计算机接口及电子线路系统等几个主要部分组成。光学测量系统用来测量收集数据。计算机用来处理数据和控制仪器运行。一个完整的FTIR光谱仪的基本结构框图如图1-1所示。Bruker Vector 22 傅立叶变换红外光谱仪是德国Bruker公司产品，其基本硬件配置如图1-2所示。软件配置为红外操作软件 OPUS 5.0 OPUS。图1-1FTIR光谱仪的结构图图1-2 Bruker Vector 22 FTIR光谱仪基本硬件配置2 工作原理光源辐射出的红外光经过透镜变成平行光线，射入麦克尔逊干涉仪。干涉仪由分束器、固定镜及在空

32、气轴承上平行移动的动镜组成。分束器把入射光分成两束，经过固镜和动镜，而后重新汇合到一起，再落到检测器上。这样由同一光源发出的两束光，经过不同路程后再聚到某一点时，便成为相干光。当两光束的光程差为半波长的偶数倍时，则落到检测器上的相干光相互叠加，产成明线，其相干光的强度有最大值；而当两光束的光程差为半波长的奇数倍时，则落到检测器上的相干光相互抵消，产生暗线，其相干光的强度有最小值。两光束的光程差既不是半波长的偶数倍，也不是半波长的奇数倍时，则其相干光的强度介于最强和最弱之间。如果动镜连续移动，再检测器上将得到一个强度为余弦变化的讯号。如光源为单色光，则其数学表达式：式中 I(x) 干涉强度，是光

33、程差x的函数B(n) 光源（被测对象）的强度，是光源波长的函数n n 频率连续波长的复合光干涉图，其数学表达式：依据傅立叶变换的可逆性，就可计算出光源的光谱分布：这是傅立叶光谱学的基本方程。由它记录干涉图并作傅立叶余弦变换，就可得到在任意波数的光强。但这一变换处理工作非常复杂和麻烦，不能写出简单的解析式，因此在计算光谱时必须将傅立叶积分变为加和公式，用电子计算机完成数值的计算。由于计算机只能进行数字化运算，它只能对数字化了的干涉图进行干涉图变换。因此，实测的干涉图需用间隔取点采样的办法，先进行数字化。而这种等间隔取点采样就要一块激光干涉仪协助完成。Bruker Vector 22 的激光干涉仪

34、和红外干涉仪共用一个分束器、动镜，使用光电二极管作检测器，当激光通过干涉仪时，被调制成一个呈余弦曲线的干涉图。测样时，用这个余弦干涉图监测扫描测量全过程，获得实用的数字化样品干涉图。激光干涉仪还有下述两个功能：监控动镜移动速度和决定动镜移动距离。样品扫描测量中，动镜移动要求平稳且需速度均一。当动镜速度发生变化时，将会引起激光干涉图频率的改变，变化的信息即可传到驱动机构的伺服系统，控制器即会自动调整动镜速度，保证动镜平稳匀速运动。3 Bruker Vector 22 光谱仪的特点高光通量，高信噪比，高分辨率，高测量精度，测量速度快，谱图自动检索。二、  BRUKER-VECT

35、OR22傅立叶变换红外光谱仪操作规程1.目的：介绍BRUKER-VECTOR22傅立叶变换红外光谱仪操作规程及规范。2.范围：本标准适用于本实验室BRUKER-VECTOR22傅立叶变换红外光谱仪。3.组成：微机控制部分：显示器，主机，打印机红外光谱检验部分：VECTOR22傅立叶变换光学台 红外样品制备组件3.1 微机控制部分： 显示器：型号sony CPD-100EST；14英寸；电源：100-240V 50/60Hz，2.1A主 机：型号：PHMcomputer GmbH 电源:：220V 50/60Hz配 置：IntelPentium 266MHz（主频）64兆（内存）、4.3G（硬盘

36、）、 3.5英寸软驱、24倍速CD-ROM 驱动器、标准键盘、鼠标。打印机：型号HP laserjet1100 电源：220 50/60Hz操作系统：IBM OS/2 Warp4.0，Windows NT 红外软件：OPUS/IR 3.03.2 红外光谱检验部分：傅立叶变换光学台PS15(型号)：230/115V 50/60Hz 1.6A(电源)光谱范围 7500-370cm分辨率： 0.9cm性噪比： 30，000：1波数精度： 0.01cm光学系统：红外光源SIC（无需水冷的高能量光源） 干涉仪：60自动校准 Rocksolid专利技术分数器：KBr上镀锗检测器：DTGS（氘代硫

37、酸三甘酞）光学腔：密封干燥 光路设计：三面反射镜联机能力：联接研究级红外显微镜，气相色谱型号，TGA样品腔：27×25×16cm傅立叶变换：AQP快速硬件傅立叶处理板3.3 红外样品制备组件：（1）液体池（包括KBr窗片，垫片0.025、0.05、0.1、0.2、0.5、1mm） （2）样品架（3）磁性样品架（4）35mm玛瑙研钵（5）KBr粉末（6）晶体抛光工具包（7）15吨油压机（8）13mm制片模具4.操作规程：4.1. 开，关机检查各设备电源线安全插入电源插座。打开空气开关，开启精密电源。在精密电源工作正常的状态下，启动光谱仪。开机：接通光学台电源（电源开关在光学台

38、后面左下侧）面板右上方激光灯(LASER)点亮呈橘黄色，状态灯（STATUS）点亮呈黄色闪亮。启动计算机（先开显示器，接着开主机，最后开打印机）鼠标指定OPUS软件图形符号，击左键启动，进入OPUS信息窗口，鼠标左键点击OK按钮。关机：点击关闭计算机图形，待出现对话框提示能安全关闭计算机时，按主机电源键关闭主机，接着关闭显示器，打印机，最后关闭光学台。4.2.  红外样品的制备4.2.1 液体样品：以试样易溶有机溶剂，制成110%浓度的溶液，注入适宜厚度的液体池中测定。常用溶剂有二氯乙烷、四氯化碳、三氯甲烷、二硫化碳、己烷及环己烷等。 注：不可用水做试样溶剂。使用完后，用相

39、应溶剂立即将液体池清洗干净。4.2.2 固体样品：取样品11.5mg与KBr200300mg（样品与KBr的比约为200:1）于玛瑙研钵中研磨成混合均匀的粉末，用小药匙转入制片模具中于油压机10吨压力下保持2分钟，撤去压力后取处制成的供试片，目视检测，片子应呈透明状，然后取出样品片装入样品架。4.3. 测试光谱4.3.1   选定主菜单Measure项中Measurement进入测试窗口。选定Align，Mode.检查光通量值是否正常。4.3.2   选定Start Background Measurement扫描空白吸收。选定光通量窗口EXIT键退出。

40、4.3.3   编辑样品信息，储存路径。4.3.4   将样品架或液体池放入样品室中样品固定座。4.3.5   选定Start Sample Measurement按键进行样品测试。4.3.6   选定测试所得文件号位于图谱框与主菜单之间，通常样品编号为100双击鼠标左键。4.3.7   调整X，Y坐标。主菜单Display项下hanger x/y values.y或(x-y成手动输入x，y坐标值。)4.3.8   标峰值：主菜单 Evaluatepeak pick输入文件号

41、Peak picks左双敲标峰数据块（位于文件号后面）4.3.9  打印图谱主菜单 plot/print plot. 输入文件号后数据块preview 放好打印纸 plot5.        VECTOR22傅立叶变换红外光谱仪操作注意事项5.1        保持室内清洁，干燥5.2        光学台不要受振动，取样，放样时，样品盖应轻开轻闭5.3 &

42、#160;      眼睛不要注视氦-氖激光，以免受伤害5.4        不要做与红外无关的操作5.5        不得自带软盘进行拷贝5.6        不得随意改变参数5.7        使用的红外样品制备组件立即以甲醇或乙醇洗干净，注：窗片不得用水清洗，

43、各组件用后归还原位附2 漫反射红外光谱（DRIFT）早在20世纪70年代，Körtüum和Griffihs等已经从理论上论述了漫反射红外光谱的基本原理。漫反射红外光谱可以测量松散的粉末，因而可以避免由于压片造成的扩散影响。它很适用于散射和吸附性强的样品，目前在催化剂研究中得到了广泛的应用。通常用DRIFT或DRITS表示漫反射傅立叶变换红外光谱。漫反射红外辐射的收集通常采用椭圆（ellipsoidal）镜收集器聚焦于探测器上。其红外吸收光谱用Kubelka-Munk函数描述：式中 吸收系数，是频率的函数 散射系数 无限厚的样品的反射比（一般厚度在几毫米即可满足上述条件）Ha

44、rrick公司设计的漫反射附件Harrick公司设计的漫反射原位池通常，漫反射测量利用所谓积分球，是FTIR的一个附件。一般为避免法线方向的反射均采用非法线方向的入射角，即固定的离轴（off-axis）椭圆镜子。最近Korte和Otto设计了一个Light-pipe Blocker光锲可以隔断法线方向的反射影响。利用这些漫反射附件可以获得质量很好的漫反射红外光谱。目前，大多数FTIR仪器均设有做漫反射的莫件，即Kubelka模，如果配备漫反射池，均可以方便地进行漫反射研究。为了进一步做一些原位红外光谱研究，人们设计了可控气氛和压力的原位漫反射池。可以在室温至400 oC 或500 oC、真空或

45、加压条件下进行原位研究，见上图。右图显示的是进口原位漫反射吸收池。一、红外光谱法对试样的要求 红外光谱的试样可以是液体、固体或气体，一般应要求：（1）试样应该是单一组份的纯物质，纯度应>98%或符合商业规格才便于与纯物质的标准光谱进行对照。多组份试样应在测定前尽量预先用分馏、萃取、重结晶或色谱法进行分离提纯，否则各组份光谱相互重叠，难于判断。（2）试样中不应含有游离水。水本身有红外吸收，会严重干扰样品谱，而且会侵蚀吸收池的盐窗。（3）试样的浓度和测试厚度应选择适当，以使光谱图中的大多数吸收峰的透射比处于10%80%范围内。二、制样的方法1. 气体样品气态样品可在玻璃气槽内进行测定，它的两

46、端粘有红外透光的NaCl或KBr窗片。先将气槽抽真空，再将试样注入。2. 液体和溶液试样（1）液体池法沸点较低，挥发性较大的试样，可注入封闭液体池中，液层厚度一般为0.011mm。（2）液膜法 沸点较高的试样，直接滴在两片盐片之间，形成液膜。对于一些吸收很强的液体，当用调整厚度的方法仍然得不到满意的谱图时，可用适当的溶剂配成稀溶液进行测定。一些固体也可以溶液的形式进行测定。常用的红外光谱溶剂应在所测光谱区内本身没有强烈的吸收，不侵蚀盐窗，对试样没有强烈的溶剂化效应等。3. 固体试样（1）压片法107Pa压力在油压机上压成透明薄片，即可用语测定。试样和KBr都应经干燥处理，研磨到粒度小于2微米，

47、以免散射光影响。´将12mg试样与200mg纯KBr研细均匀，置于模具中，用（510）（2）石蜡糊法将干燥处理后的试样研细，与液体石蜡或全氟代烃混合，调成糊状，夹在盐片中测定。（3）薄膜法主要用于高分子化合物的测定。可将它们直接加热熔融制或压制成膜。也可将试样溶解在低沸点的易挥发溶剂中，涂在盐片上，待溶剂挥发后成膜测定。当样品量特别少或样品面积特别小时，采用光束聚光器，并配有微量液体池、微量固体池和微量气体池，采用全反射系统或用带有卤化碱透镜的反射系统进行测量。实验三 质粒DNA的提取、酶切和基因表达实验目的1. 学习和掌握质粒DNA的提取、酶切和电泳鉴定等基本操作技术。2. 了解细

48、菌、质粒、内切酶的基本性质及其在基因工程中的应用。3. 了解基因表达条件选择、表达结果检测等方法原理；掌握常用的蛋白质分离技术及其运用范围等。实验原理细菌质粒是细菌染色体外的遗传因子，具有使细菌带有抗药性、产生细菌毒素等特性或生物功能。绝大部分质粒为环状的双链DNA分子，能自主复制，并含有少量基因，经过人工改造后可作为基因载体，在基因工程中有重要应用。从大肠杆菌中提取质粒DNA的方法很多，本实验中采用的碱性SDS提取法，是基于染色体DNA与质粒DNA的变性与复性存在差异而进行分离的。在强碱性条件下，染色体DNA和质粒DNA均变性，双链均解开。由于质粒DNA是共价闭合环状超螺旋结构，变性后两条互

49、补链不会完全分开。当溶液酸度调至中性时，质粒DNA容易复性并溶解在溶液中。而染色体DNA则不易复性，解开的链互相缠绕，离心时极易和溶液中的蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来。在离心分离出的上清液中，加入一定量的乙醇，使复性后的质粒DNA沉淀。限制性核酸内切酶是基因工程中不可或缺的工具酶。它们能识别双链DNA中特定的位点并将DNA切开，这个特定位点是一段具有旋转对称结构的DNA片段。本实验中所有的限制性核酸内切酶ECoR1识别和切割的碱基序列为： 5.G¯- A - A -T - T - C .3 3. C- T - T - A - A -­G5限制性核酸内切酶Hind II

50、I识别和切割的碱基序列为： 5.A¯- A -G -C- T -T .3 3. T - T - C - G-A-­A 5酶切之后得到的两条单链具有粘性末端，在基因重组时是外源基因很好的连接部位。用上述碱性SDS提取法从大肠杆菌DH5a 提取得到的pUC19质粒, 是一种由大肠杆菌pBR322质粒与M13噬菌体改建而成的双链DNA质粒载体，具有多个克隆位点，是基因工程中常用的克隆载体。pUC19质粒有一个ECoR1的识别序列，经该酶切割后， pUC19质粒由环状分子变为具有粘性末端的线性分子，这种结构的变化可以用琼脂糖凝胶电泳进行检测，因环状分子与线性分子的电泳条带形状有明显

51、差异。琼脂糖凝胶电泳适合于分离鉴定200-200000 bp的核酸片段。在中性pH条件下，核酸带负电荷，在电场中向正极移动。电泳后，核酸分子在凝胶中的位置通过染色来显示。常用染色剂溴化乙锭（EB）是一种吖啶类染料，其扁平形分子能插入DNA积叠的碱基之间，导致和DNA结合，形成的复合物在300 nm紫外光的照射下，可发射出590 nm的橘红色荧光。 pUC19质粒还有一个Hind III的识别序列。根据实验的需要，可以用ECoR1和Hind III同时酶切后，用琼脂糖凝胶电泳回收2.6 Kb的pUC19质粒线性DNA片段，然后将其与目标基因和进行连接。在基因克隆技术中，将重组质粒导入细菌称为转化

52、。在0°C的CaCl2低渗溶液中，大肠杆菌膨胀成球形称“感受态”。感受态的细胞膜出现变化，使DNA易于进入细胞内。插入外源基因的重组质粒与感受态细菌一起，经42°C的短时间热激后，使黏附于细胞表面的质粒DNA-钙盐复合物被吸收。然后用选择性培养基可以筛选出含有外源基因的阳性克隆。将含外源基因的重组质粒转染至感受态细胞，在合适的培养基和条件下进行表达，最后用SDS- PAGE电泳等检测表达结果。如果需要得到较大量的纯蛋白，还需用FPLC（高效蛋白质液相色谱）进行分离。在聚丙烯酰胺凝胶电泳中，蛋白质的迁移率与它所带电荷的多少、分子量的大小和分子的形状有关。如果用二硫苏糖醇等还原

53、剂和SDS（十二烷基磺酸钠）加热处理蛋白质样品，蛋白质分子中的二硫键将还原，而且1克蛋白质可定量结合1.4克SDS，亚基的构象呈长椭圆棒状。由于与蛋白质结合的SDS呈解离状态，使蛋白质亚基带上大量负电荷，其数值大大超过蛋白质原有的电荷量，掩盖了不同亚基间原有的电荷差异。各种蛋白质-SDS复合物具有相同的电荷密度，电泳时纯粹按亚基大小靠凝胶的分子筛效应进行分离。有效迁移速率与分子量的对数成很好的线性关系，所以这也是一种非常有用的测定蛋白质分子量的方法。实验内容和步骤1. 配置相关溶液a. LB培养基：500 ml三角烧瓶中加入 1 克蛋白胨、0.5克酵母提取物和1克NaCl，用95 ml去离子水

54、溶解，用NaOH溶液调节至pH 7，再用去离子定容至 100 ml。 在1.1 kg /cm2 高压灭菌 20分钟。b. 氨苄青霉素： 在0.5克氨苄青霉素固体中加入重蒸水，配成 100 mg / ml 母液，置4°C冰箱中保存。c. TE缓冲液： 用一定量的Tris-HCl、 NaOH和EDTA固体，配成10 mmol/L Tris-HCl、10 mmol/L EDTA、pH = 8.0的水溶液。d. GTE缓冲液： 用一定量的Tris-HCl、 NaOH、EDTA和蔗糖固体， 配成25%蔗糖、50 mmol/L Tris-HCl、100 mmol/L EDTA、pH = 8.0的

55、水溶液。e. NaOH/SDS： 用一定量的固体氢氧化钠和十二烷基磺酸钠（SDS）配成0.2 mol/L NaOH、1% (W/V)的SDS水溶液。f. KAc水溶液： 取29.5 ml冰乙酸， 用固体KOH中和至pH = 4.8，加蒸馏水定容至 100 ml。g. 上样缓冲液： 0.25%溴酚蓝、0.25%二甲苯青FF和30%甘油水溶液。h. 电解缓冲液 10 x TBE： 称取54克Tris、27.5克硼酸， 加20 ml 0.5 mol/L EDTA (pH=8.0)，加蒸馏水定容至1000 ml。 50 x TAE： 称取242克Tris、57.1 ml冰乙酸，加100 ml 0.5

56、mol/L EDTA (pH=8.0)，加蒸馏水定容至1000 ml。2. 抽提质粒a. 接种一单菌落于 100 ml LB 液体培养基中，加入100 ml 100 mg / m l氨苄青霉素母液，37°C摇床振荡培养8-10小时，至菌液的A600 = 0.6。b. 取出3 ml该菌液于5 ml Eppendorf离心管中，在离心机上以3000 r/ min 离心2分钟。 弃去上层清液，沉淀用100 ml GTE缓冲溶液悬浮并于室温下放置 5 分钟。c. 加入200 ml NaOH/SDS溶液，混匀后于冰上放置 5 分钟。d. 加入150 ml KAc溶液，在旋涡混合器上振荡数秒钟后

57、，于冰上放置 5 分钟。e. 以10000 r/ min离心3分钟后，将上清液移至1.5 ml Eppendorf离心管中。加入等体积的酚-氯仿混合液，在旋涡混合器上振荡数秒钟后，将上层水溶液移至另一干净的1.5 ml Eppendorf 离心管中。f. 加入等体积氯仿，在旋涡混合器上振荡数秒钟后，将上层水溶液移至另一干净的1.5 ml Eppendorf 离心管中。g. 在该溶液中加入2倍体积的无水乙醇，于室温下放置数分钟后，以10000 r/ min离心5分钟，弃去溶液后得到质粒DNA沉淀。h. 用1 ml 70%乙醇洗涤DNA沉淀，然后真空干燥。i. 质粒DNA沉淀用30 m 重蒸水溶解，于 -20°C冰箱中保存。3. 酶切a. 取5 ml上述质粒DNA溶液于一干净的Eppendorf离心管中，加入2 ml 10 x酶切缓冲液、1 ml RNAase A酶、1 ml EcoR1 酶和11 ml dd H2O 于37 °C酶解2小时。4. 电泳鉴定a. 称取1克琼脂糖，加入100 ml 1 x TBE缓冲液，加热溶解。待温度降至约50°C左右，将凝胶倒入放好梳子的胶槽中。b. 等完全冷却后将胶槽放入电泳槽中，加入1 x TBE缓冲液至液面没过凝胶， 然后拔出样品梳。c