实验二大肠菌群的检验学习教案

1、会计学1实验实验(shyn)二二 大肠菌群的检验大肠菌群的检验第一页，共41页。第1页/共41页第二页，共41页。第2页/共41页第三页，共41页。第3页/共41页第四页，共41页。第4页/共41页第五页，共41页。l 在普通营养琼脂上有3种菌落形态(xngti)：l 1）光滑型：菌落边缘整齐，表面有光泽、湿润、 l 光滑、呈灰色，在生理盐水中易分散；l 2）粗糙型：菌落扁平、干涩、边缘不整齐，易l 在生理盐水中自凝；l 3）黏液型：常为含有荚膜的菌株。第5页/共41页第六页，共41页。第6页/共41页第七页，共41页。第7页/共41页第八页，共41页。第8页/共41页第九页，共41页。菌名菌

2、落形态大肠埃希氏菌 紫黑色，有绿色金属光泽肺炎克雷伯氏菌粉色，中心色深阴沟肠杆菌粉色，中心色深弗氏志贺氏菌无色鼠伤寒沙门氏菌 无色粪链球菌无色第9页/共41页第十页，共41页。且交联度大，类脂质含量少，经乙醇或丙酮洗脱(x tu)后，肽聚糖层的孔径变小，通透性降低，因此细胞仍保留初染时的颜色。第10页/共41页第十一页，共41页。第11页/共41页第十二页，共41页。Testpositivenegativebiotype1biotype2reagentIndole红色环不变色+-KovacsMR红色不变色+甲基红V-P玫瑰红色环不变色-V-P甲、乙液Citrate生长不生长-第12页/共41页

3、第十三页，共41页。实验二大肠菌群的检验实验二大肠菌群的检验一、实验目的一、实验目的1、学习、学习(xux)食品中大肠菌群检测程序、方法；食品中大肠菌群检测程序、方法；2、掌握食品中大肠菌群检测结果的报告方式。、掌握食品中大肠菌群检测结果的报告方式。二、实验材料二、实验材料1、设备和材料、设备和材料温箱、水浴锅、天平、显微镜、均质器或乳钵、温度计、温箱、水浴锅、天平、显微镜、均质器或乳钵、温度计、平皿、试管、发酵管、吸管、载玻片、接种针平皿、试管、发酵管、吸管、载玻片、接种针2、培养基及试剂、培养基及试剂乳糖乳糖胆盐发酵管、乳糖发酵管、蛋白胨水、靛基质试剂、胆盐发酵管、乳糖发酵管、蛋白胨水、靛

4、基质试剂、麦康凯、伊红美蓝琼脂（麦康凯、伊红美蓝琼脂（EMB）、革兰氏染色液）、革兰氏染色液第13页/共41页第十四页，共41页。GB4789.3-2010 大肠菌群计数(j sh)第14页/共41页第十五页，共41页。GB4789.3-2010 大肠菌群计数(j sh)第15页/共41页第十六页，共41页。第16页/共41页第十七页，共41页。（二）应灭菌消毒的器材（二）应灭菌消毒的器材剪刀剪刀(jindo)1把不锈钢药匙把不锈钢药匙1把把 滴管滴管胶头胶头5只称量纸适量只称量纸适量第17页/共41页第十八页，共41页。第18页/共41页第十九页，共41页。蛋白(dnbi)胨20g、胆盐5g

5、、乳糖10g、0.4%溴甲酚紫乙醇溶液25ml、蒸馏水1000ml（将蛋白(dnbi)胨、胆盐及乳糖溶于水中，校正PH值至7.4，加入指示剂）；或购买制好的乳糖胆盐发酵培养基、按说明配置。分装试管，每管10ml，并放入一个到气管（杜氏小管），高压灭菌115、15分钟。双料乳糖胆盐发酵培养基除蒸馏水外，其它成分加倍。乳糖乳糖(r tn)胆盐发酵培养基：胆盐发酵培养基：P99第19页/共41页第二十页，共41页。A.1 月桂月桂(yu u)基硫酸盐胰蛋白胨（基硫酸盐胰蛋白胨（LST）肉汤）肉汤A.1.1 成分成分胰蛋白胨或胰酪胨胰蛋白胨或胰酪胨 20.0 g氯化钠氯化钠 5.0 g乳糖乳糖 5.0

6、 g磷酸氢二钾（磷酸氢二钾（K2HPO4） 2.75 g磷酸二氢钾（磷酸二氢钾（KH2PO4） 2.75 g月桂月桂(yu u)基硫酸钠基硫酸钠 0.1 g蒸馏水蒸馏水 1 000 mLpH 6.80.2A.1.2 制法制法将上述成分溶解于蒸馏水中，调节将上述成分溶解于蒸馏水中，调节 pH。分装到有玻璃小倒管的试管。分装到有玻璃小倒管的试管中，每管中，每管10 mL。121 高压灭菌高压灭菌15 min。第20页/共41页第二十一页，共41页。A.2 A.2 煌绿乳糖胆盐（煌绿乳糖胆盐（BGLBBGLB）肉汤）肉汤A.2.1 A.2.1 成分成分蛋白蛋白(dnbi)(dnbi)胨胨 10.0

7、g 10.0 g乳糖乳糖 10.0 g 10.0 g牛胆粉（牛胆粉（oxgalloxgall或或oxbileoxbile）溶液）溶液 200 mL 200 mL0.1%0.1%煌绿水溶液煌绿水溶液 13.3 mL 13.3 mL蒸馏水蒸馏水 800 mL 800 mLpH 7.2pH 7.20.10.1A.2.2 A.2.2 制法制法将蛋白将蛋白(dnbi)(dnbi)胨、乳糖溶于约胨、乳糖溶于约500 mL500 mL蒸馏水中，加入牛胆粉溶液蒸馏水中，加入牛胆粉溶液200 mL200 mL（将将20.0 g20.0 g脱水牛胆粉溶于脱水牛胆粉溶于200 mL200 mL蒸馏水中，调节蒸馏水中

8、，调节pHpH至至7.07.07.57.5），用蒸馏水），用蒸馏水稀释到稀释到975 mL975 mL，调节，调节pHpH，再加入，再加入0.1%0.1%煌绿水溶液煌绿水溶液13.3 mL13.3 mL，用蒸馏水补足到，用蒸馏水补足到1 1 000 mL000 mL，用棉花过滤后，分装到有玻璃小倒管的试管中，每管，用棉花过滤后，分装到有玻璃小倒管的试管中，每管10 mL10 mL。121 121 高压灭菌高压灭菌15 min15 min。第21页/共41页第二十二页，共41页。A.3 结晶(jijng)紫中性红胆盐琼脂（VRBA）A.3.1 成分蛋白胨 7.0 g酵母膏 3.0 g乳糖 10.

9、0 g氯化钠 5.0 g胆盐或3号胆盐 1.5 g中性红 0.03 g结晶(jijng)紫 0.002 g琼脂 15 g18 g蒸馏水 1 000 mLpH 7.40.1A.3.2 制法将上述成分溶于蒸馏水中，静置几分钟，充分搅拌，调节(tioji)pH。煮沸2 min，将培养基冷却至45 50 倾注平板。使用前临时制备，不得超过3 h。第22页/共41页第二十三页，共41页。第23页/共41页第二十四页，共41页。质控：质控：此培养基呈紫色，可有细微沉淀此培养基呈紫色，可有细微沉淀(chndin)(chndin)。质控菌株接种后，。质控菌株接种后，3535培养培养18182424小时，观察结

10、果应如下表所示：小时，观察结果应如下表所示：菌株 菌号 生长情况 菌落产气肠杆菌 ATCC 13048 好 粉红，无光泽大肠埃希氏菌 ATCC 25922 好，极好 有紫绿金属光泽中心肺炎克雷伯氏菌 ATCC 13883 好 绿金属光泽，有黑心奇异变形杆菌 ATCC 25933 好，极好 无色鼠伤寒沙门氏菌 ATCC 14028 好，极好 无色金黄色葡萄球菌 ATCC 25923 被抑制 第24页/共41页第二十五页，共41页。说明：（1）伊红又称署红或四溴荧光素，为酸性染料。美蓝又称亚甲蓝，为碱性染料。当大肠杆菌分解乳糖产酸时，细菌带正电荷，染上红色(hngs)，再与美蓝结合而形成紫黑色菌落

11、，并有绿色金属光泽。二者除了作为指示剂外，还有抑制格兰氏阳性菌的作用。（2）在碱性环境中，不分解乳糖产酸的细菌不着色。伊红、美蓝不能结合，故沙门氏菌和志贺氏菌等为无色或琥珀色半透明菌落。（3）此培养基用于鉴别大肠杆菌及产气杆菌，并可快速鉴定白色念珠菌及鉴定凝固酶阳性葡萄球菌。美国公共卫生协会和美国细菌协会推荐，用于增殖或鉴别大肠杆菌的检查。但某些沙门氏菌、志贺氏菌可被抑制。培养基保存应注意避光防止氧化。 第25页/共41页第二十六页，共41页。第26页/共41页第二十七页，共41页。A1组组 酸奶1 A2A2组组 水样1 A3组组 水样2 A4组组 水样3 第27页/共41页第二十八页，共41

12、页。B1B1组组 鲜奶 B2B2组组 水样4 B3B3组组 水样5 B4组组 酸奶2 第28页/共41页第二十九页，共41页。三、实验方法与步骤三、实验方法与步骤1、采样及稀释、采样及稀释以无菌操作将检样以无菌操作将检样25g（或（或25ml）放于含有）放于含有225ml灭菌生理灭菌生理盐水或其他稀释液的灭菌玻璃瓶内（瓶内预置适当数量的玻盐水或其他稀释液的灭菌玻璃瓶内（瓶内预置适当数量的玻璃珠）或灭菌乳钵内，经充分振摇或研磨做成璃珠）或灭菌乳钵内，经充分振摇或研磨做成1：10的均匀稀的均匀稀释液。固体检样最好用无菌均质器，以释液。固体检样最好用无菌均质器，以800r/min1000r/min的

13、速度处理的速度处理(chl)1min，做成，做成1：10的稀释液。的稀释液。用用1ml灭菌吸管吸取灭菌吸管吸取1：10稀释液稀释液1ml，注入含有，注入含有9ml灭菌生灭菌生理盐水或其他稀释液的试管内，振摇混匀，做成理盐水或其他稀释液的试管内，振摇混匀，做成1：100的稀的稀释液，换用释液，换用1支支1ml灭菌吸管，按上述操作依次作灭菌吸管，按上述操作依次作10倍递增稀倍递增稀释液释液第29页/共41页第三十页，共41页。2. 乳糖初发酵试验乳糖初发酵试验(shyn) 即通常所说的假定试验即通常所说的假定试验(shyn)。其目的在于检查样品中有。其目的在于检查样品中有无发酵乳糖产生气体的细菌。

14、无发酵乳糖产生气体的细菌。 将待检样品接种于乳糖胆盐发酵管内，接种量在将待检样品接种于乳糖胆盐发酵管内，接种量在1ml以上者，以上者，用双料乳糖胆盐发酵管；用双料乳糖胆盐发酵管；1ml及及1ml以下者，用单料乳糖发酵管。以下者，用单料乳糖发酵管。每一个稀释度接种每一个稀释度接种3管，置（管，置（361）0C温箱内，培养（温箱内，培养（242）h，如所有乳糖胆盐发酵管都不产气，则可报告为大肠菌群阴性，如所有乳糖胆盐发酵管都不产气，则可报告为大肠菌群阴性，如有产生者，则按下列程续进行如有产生者，则按下列程续进行根据食品卫生要求根据食品卫生要求(yoqi)或对检验样品污染情况估计，选择三个稀释度，每

15、个稀释度接种或对检验样品污染情况估计，选择三个稀释度，每个稀释度接种3管。也可直接用样品接种。管。也可直接用样品接种。10， 100, 1000 倍稀释（倍稀释（-1，-2，-3）第30页/共41页第三十一页，共41页。3.分离培养（分离培养（10倍稀释）倍稀释） 将产气的发酵管分别转种在伊红美蓝琼脂板或麦康凯琼将产气的发酵管分别转种在伊红美蓝琼脂板或麦康凯琼脂平板上，置（脂平板上，置（361）0C温箱内，培养温箱内，培养18h24h，然后，然后(rnhu)取出，观察菌落形态并作革兰氏染色镜检和复发酵取出，观察菌落形态并作革兰氏染色镜检和复发酵试验。试验。4.乳糖复发酵试验乳糖复发酵试验 即通

16、常所说的证实试验，其目的在于证明从乳糖初酵管即通常所说的证实试验，其目的在于证明从乳糖初酵管试验呈阳性反应的试管内分离到的革兰氏阴性无芽胞杆菌，试验呈阳性反应的试管内分离到的革兰氏阴性无芽胞杆菌，确能发酵乳糖产生气体。确能发酵乳糖产生气体。 第31页/共41页第三十二页，共41页。 在上述的选择性培养基上，挑取可疑大肠菌群12个进行革兰氏染色，同时接种乳糖发酵(f jio)管，置（361）0C的温箱内培养（242）h，观察产气情况。 凡乳糖发酵(f jio)管产气，革兰氏染色为阴性无芽胞杆菌，即报告为大肠杆菌阳性；凡乳糖发酵(f jio)管不产气或革兰氏染色为阳性，则报告为大肠杆菌为阴性。5.报告 根据证实为大肠菌群阳性的管数，查MPN检索表，报