实验质粒DNA的提取ppt课件

1、质粒质粒DNADNA的提取和鉴定的提取和鉴定 实验一实验一pUC192686 bpAPrALPHAP(BLA)P(LAC)ORIAvaI (413)BamHI (418)EcoRI (397)HindIII (448)PstI (440)SmaI (415)XmaI (413)ApaLI (178)ApaLI (1121)ApaLI (2367)一、目的与要求一、目的与要求1.1.掌握碱裂解法提取质粒的方法及原理掌握碱裂解法提取质粒的方法及原理 2.2.了解用分光光度计测定了解用分光光度计测定DNADNA含量的方法含量的方法3.3.了解了解“过柱快提质粒过柱快提质粒DNADNA 二、 相关知识

2、及原理 质粒质粒(Plasmid) (Plasmid) ： 独立于染色体外的，能自主复制独立于染色体外的，能自主复制且稳定遗传的遗传因子。且稳定遗传的遗传因子。 是一种环状的双链是一种环状的双链DNADNA分子。分子。 存在于细菌、放线菌、真菌以及存在于细菌、放线菌、真菌以及一些动植物细胞中，在细菌细胞中最一些动植物细胞中，在细菌细胞中最多。多。质粒质粒plasmidplasmid 是染色体外小型是染色体外小型1-200kb1-200kb的共价、闭合、的共价、闭合、环状的双链环状的双链DNADNA分子分子cccDNAcccDNA，能自主复制，能自主复制并能稳定遗传的遗传因子。并能稳定遗传的遗传

3、因子。 经常编码一些对宿主有利的酶的基因，这些基经常编码一些对宿主有利的酶的基因，这些基因的表型包括抗生素抗性、产生抗生素、限制因的表型包括抗生素抗性、产生抗生素、限制酶、修饰酶等酶、修饰酶等 质粒的复制：质粒的复制： 严紧型复制严紧型复制1n个个 松弛型复制松弛型复制20个以上个以上 细菌质粒细菌质粒: : 细菌质粒是用的最多的质粒类群，细菌质粒是用的最多的质粒类群，其大小从其大小从1Kb-200Kb1Kb-200Kb，它们复制时利，它们复制时利用宿主细胞复制本身基因组用宿主细胞复制本身基因组DNADNA的同的同一组酶系。一组酶系。 DNA超螺旋构造超螺旋构造常用的质粒载体常用的质粒载体 是

4、经过是经过DNADNA重组技术构建而成的。重组技术构建而成的。pUC18, pUC19pUC18, pUC19pUC192686 bpAPrALPHAP(BLA)P(LAC)ORIAvaI (413)BamHI (418)EcoRI (397)HindIII (448)PstI (440)SmaI (415)XmaI (413)ApaLI (178)ApaLI (1121)ApaLI (2367)InsertEcoRIXhoI1.9kb 严谨型：这些质粒的复制是在寄主细胞严厉控严谨型：这些质粒的复制是在寄主细胞严厉控制之下的，与寄主细胞的复制偶联同步。所以，制之下的，与寄主细胞的复制偶联同步。

5、所以，往往在一个细胞中只需一份或几份拷贝；往往在一个细胞中只需一份或几份拷贝； 松驰型：这些质粒的复制是在寄主细胞的松弛松驰型：这些质粒的复制是在寄主细胞的松弛控制之下的，每个细胞中含有控制之下的，每个细胞中含有10-20010-200份拷贝，份拷贝，假设用一定的药物处置抑制寄主蛋白质的合成假设用一定的药物处置抑制寄主蛋白质的合成才会使质粒拷贝数增至几千份。如较早的质粒才会使质粒拷贝数增至几千份。如较早的质粒pBR322pBR322即属于松弛型质粒，要经过氯霉素处置即属于松弛型质粒，要经过氯霉素处置才干到达更高拷贝数。才干到达更高拷贝数。质粒类型：质粒类型： 质粒是携带外源基因进入细菌中扩增或

6、质粒是携带外源基因进入细菌中扩增或表达的主要载体，它在基因操作中具有重表达的主要载体，它在基因操作中具有重要作用。质粒的分别与提取是最常用、最要作用。质粒的分别与提取是最常用、最根本的实验技术。根本的实验技术。 载体载体(Vector)： 用于携带重组用于携带重组DNA，并且可以使外源，并且可以使外源DNA一同复制与表达的质粒一同复制与表达的质粒(运载工具运载工具)。载体具备的条件：载体具备的条件：适宜的容量适宜的容量在受体细胞中可以独立复制；在受体细胞中可以独立复制；易于鉴定；易于鉴定；易于挑选；易于挑选；易于制备；易于制备；易于导入受体细胞。易于导入受体细胞。 启始复制子启始复制子ori,

7、 Origin of replication)ori, Origin of replication)； 多克隆位点多克隆位点(MSC, Multiple cloning site (MSC, Multiple cloning site or polylinker)or polylinker)； 标志基因标志基因(Marker gene, such as LacZ (Marker gene, such as LacZ gene)gene)。 抗性基因抗性基因Antibiotic resistance Antibiotic resistance gene,such as Ampicillin re

8、sistance gene, gene,such as Ampicillin resistance gene, Kanamycine resistance gene)Kanamycine resistance gene)载体的构造：载体的构造：三、实验原理三、实验原理 碱法提取主要是利用共价闭合环状质粒与线碱法提取主要是利用共价闭合环状质粒与线性染色质在拓扑学上的差别来分别它们，在碱性性染色质在拓扑学上的差别来分别它们，在碱性PHPH，DNADNA变性，恢复中性时，线性染色体变性，恢复中性时，线性染色体DNADNA不能不能准确复性，与其它大分子共沉淀，而质粒准确复性，与其它大分子共沉淀，而质粒

9、DNADNA却却可以准确复性，留在上清中。可以准确复性，留在上清中。 碱性下，变性蛋白是可溶的，酸性、中性下碱性下，变性蛋白是可溶的，酸性、中性下变性蛋白不溶而沉淀。几乎一切纯化质粒的方法变性蛋白不溶而沉淀。几乎一切纯化质粒的方法都用到质粒都用到质粒DNADNA分子相对较小和共价闭合环状这分子相对较小和共价闭合环状这两个特性。由于操作缘由提取的质粒可有三种构两个特性。由于操作缘由提取的质粒可有三种构造：线形、开环、闭环超螺旋。造：线形、开环、闭环超螺旋。 碱裂解法碱裂解法根本原理：根本原理： 当菌体在当菌体在NaOHNaOH和和SDSSDS溶液中裂解时，蛋溶液中裂解时，蛋白质与白质与DNADN

10、A发生变性，当参与中和液后，质发生变性，当参与中和液后，质粒粒DNADNA分子可以迅速复性，呈溶解形状，离分子可以迅速复性，呈溶解形状，离心时留在上清中；蛋白质与染色体心时留在上清中；蛋白质与染色体DNADNA不复不复性而呈絮状，离心时可沉淀下来性而呈絮状，离心时可沉淀下来 DNA DNA 是具有一定构造的物质，一些特殊的环是具有一定构造的物质，一些特殊的环境会导致境会导致DNADNA的变性，如加热、极端的变性，如加热、极端pHpH值、有机值、有机溶剂、尿素、酰胺试剂等，而适宜的环境又可以溶剂、尿素、酰胺试剂等，而适宜的环境又可以使使DNADNA复性。复性。 SDSSDS是一种阴离子外表活性剂

11、，它既能使细是一种阴离子外表活性剂，它既能使细菌细胞裂解，又能使一些蛋白量变性，所以菌细胞裂解，又能使一些蛋白量变性，所以SDSSDS处置细菌细胞后，会导致细菌细胞壁的破裂，从处置细菌细胞后，会导致细菌细胞壁的破裂，从而使质粒而使质粒DNADNA以及基因组以及基因组DNADNA从细胞中同时释放出从细胞中同时释放出来。来。实验原理：实验原理：实验过程实验过程 1.1.利用变性后形状不同：在利用变性后形状不同：在 pH 12.0pH 12.012.6 12.6 碱性环境中，细菌的线性大分子量染色体碱性环境中，细菌的线性大分子量染色体 DNA DNA 变性分开，而共价闭环的质粒变性分开，而共价闭环的

12、质粒 DNA DNA 虽虽然变性但仍处于拓扑缠绕形状。然变性但仍处于拓扑缠绕形状。2.2.利用溶解度的不同：将利用溶解度的不同：将 pH pH 调至中性并有调至中性并有高盐存在及低温的条件下，大部分染色体高盐存在及低温的条件下，大部分染色体 DNA DNA 、大分子量的、大分子量的 RNA RNA 和蛋白质在去污剂和蛋白质在去污剂 SDS SDS 的作用下构成沉淀，而质粒的作用下构成沉淀，而质粒 DNA DNA 依然依然为可溶形状。为可溶形状。3.3.利用离心力的不同：经过离心，可除去大利用离心力的不同：经过离心，可除去大部分细胞碎片、染色体部分细胞碎片、染色体 DNADNA、RNARNA及蛋

13、白质，及蛋白质，质粒质粒DNADNA尚在上清中，尚在上清中，4.4.利用酚变性结果不同：然后用酚、氯仿抽利用酚变性结果不同：然后用酚、氯仿抽提进一步纯化质粒提进一步纯化质粒 DNA DNA 。 释放出来的释放出来的DNADNA遇到强碱性遇到强碱性NaOHNaOH环境，环境，就会变性。然后，用酸性乙酸钾来中和溶液，就会变性。然后，用酸性乙酸钾来中和溶液，使溶液处于中性，质粒使溶液处于中性，质粒DNADNA将迅速复性，而基将迅速复性，而基因组因组DNADNA，由于分子宏大，难以复性。离心后，由于分子宏大，难以复性。离心后，质粒质粒DNADNA将在上清中，而基因组将在上清中，而基因组DNADNA那么

14、与细胞那么与细胞碎片一同沉淀到离心管的底部。碎片一同沉淀到离心管的底部。 经过这种方法即可将质粒经过这种方法即可将质粒DNADNA从细菌中提从细菌中提取出来。取出来。细菌裂解的方法： 碱裂解法：0.2molNaOH+1%SDS煮沸裂解法:沸水煮沸40秒SDS裂解法：10%SDS,普通用于质粒大量提取。提纯的思绪提纯的思绪 质粒的特性：共价、闭合、环状的小分子量质粒的特性：共价、闭合、环状的小分子量DNADNA 要去除的物质：要去除的物质： 蛋白蛋白 基因组基因组DNADNA 脂类及小分子杂质脂类及小分子杂质 RNA RNA 一切分别质粒一切分别质粒DNADNA的方法都包括的方法都包括3 3个根

15、本步骤：个根本步骤： 培育细菌使质粒扩增；培育细菌使质粒扩增； 搜集和裂解细菌；搜集和裂解细菌； 分别质粒分别质粒DNA( DNA( 有时还要求纯化质粒有时还要求纯化质粒DNA)DNA)质粒质粒DNADNA的提取方法的提取方法 方法：方法： 碱裂解法；碱裂解法； 煮沸裂解；煮沸裂解； 羟基磷灰石柱层析法，羟基磷灰石柱层析法， 质粒质粒DNADNA释放法；释放法； 酸酚法等。酸酚法等。 概括起来主要是用非离子型或离子型概括起来主要是用非离子型或离子型去污去污 剂、有机溶剂或碱进展处置及剂、有机溶剂或碱进展处置及用加热处置用加热处置 选择哪种方法主要取决于以下选择哪种方法主要取决于以下几个要素：几

16、个要素： 质粒的大小、质粒的大小、 大肠杆菌菌株、大肠杆菌菌株、 裂解后用于纯化的技术裂解后用于纯化的技术 实验要求实验要求四、实验仪器、资料与试剂四、实验仪器、资料与试剂 一仪器：恒温培育箱、恒温摇床、一仪器：恒温培育箱、恒温摇床、 台式离心机、高压灭菌锅台式离心机、高压灭菌锅二资料：含二资料：含pUC19pUC19质粒的大肠杆菌、质粒的大肠杆菌、 LBLB液体培育基，氨苄青霉素液体培育基，氨苄青霉素三试剂：三试剂： 溶液溶液I I作用：作用： 分散细胞，鳌合金属离子使金属酶失活分散细胞，鳌合金属离子使金属酶失活 溶液溶液IIII作用：作用： 细胞壁肽聚糖碱性下水解，核酸和蛋白量变性。细胞壁

17、肽聚糖碱性下水解，核酸和蛋白量变性。 溶液溶液IIIIII作用：作用： 酸性下质粒酸性下质粒DNADNA复性，变性蛋白复性，变性蛋白SDSSDS线性线性 DNADNA沉淀，沉淀，K K可中和可中和DNADNA平衡酚：氯仿：异戊醇平衡酚：氯仿：异戊醇2525：2424：1 1作用：作用： 氯仿可使蛋白量变性并有助于液相与有氯仿可使蛋白量变性并有助于液相与有机相的分别。平衡酚机相的分别。平衡酚pH7.8pH7.8酸性下酸性下DNADNA分配于分配于有机相，酚的密度大，可使有机相，酚的密度大，可使DNADNA在上清中。在上清中。异戊醇有助于消除抽提过程中出现的泡沫。异戊醇有助于消除抽提过程中出现的泡

18、沫。 注：用时取下层液，酚腐蚀性强，可引注：用时取下层液，酚腐蚀性强，可引起灼伤。起灼伤。 无水乙醇：无水乙醇： 除去除去DNADNA水化层，使水化层，使DNADNA沉淀沉淀 TETE缓冲液：缓冲液： 溶解溶解DNADNA 五、实验步骤五、实验步骤 一一 细菌培育与质粒扩增细菌培育与质粒扩增 1. 挑单克隆E.coli菌株接种到斜面培育基上 活化菌种，37过夜培育 2. 从斜面培育基上挑E.coli菌株，接种于25毫升 液体培育液内含氨苄青霉素，37振荡， 250 r/min 过夜培育。 3. 从中取4毫升种子菌液于含 LB 培育基中含 Ap，37振荡培育3-4小时OD6001.0。 二质粒提

19、二质粒提取取取取1.5ml1.5ml培育物倒入培育物倒入EppendorfEppendorf管中，管中，12000r/min12000r/min，44，30sec30sec。吸去培育液，使细胞沉淀尽能够枯燥吸去培育液，使细胞沉淀尽能够枯燥将细菌沉淀悬浮于将细菌沉淀悬浮于100l100l预冷的溶液预冷的溶液I I中，中，猛烈振荡。猛烈振荡。4.4.加加200L200L溶液溶液IIII新颖配制，盖紧新颖配制，盖紧Eppendorf Eppendorf 管，快速颠倒管，快速颠倒5 5次，混匀内容物，将次，混匀内容物，将 Eppendorf Eppendorf 管放在冰上。管放在冰上。5.5.参与参与

20、150L150L溶液溶液IIIIII冰上预冷，盖紧管冰上预冷，盖紧管口，颠倒数次使混匀，冰上放置口，颠倒数次使混匀，冰上放置5min 5min 6.12 000r/min6.12 000r/min，离心，离心5min5min，将上清夜转至另，将上清夜转至另一一EppendorfEppendorf管中管中 。7. 7. 向上清夜参与向上清夜参与2 2倍体积乙醇，混匀后，室温放置倍体积乙醇，混匀后，室温放置5-10min5-10min。12000r/min12000r/min离心离心5min5min。倒去上清夜，。倒去上清夜，把把EppendorfEppendorf管倒扣在吸水纸上，吸干液体。管倒

21、扣在吸水纸上，吸干液体。 8. 8. 用用1ml 70%1ml 70%乙醇洗涤质粒乙醇洗涤质粒DNADNA沉淀，振荡并离心，沉淀，振荡并离心，倒去上清夜，真空抽干或空气中枯燥。倒去上清夜，真空抽干或空气中枯燥。9. 50L TE9. 50L TE缓冲液，使缓冲液，使DNADNA完全溶解完全溶解-20-20保保管。管。 用移液器操作时，每一步都要格用移液器操作时，每一步都要格外小心，特别是在参与溶液外小心，特别是在参与溶液II 和和III后，后，一定不要猛烈振荡，以免切碎一定不要猛烈振荡，以免切碎DNA(包包括质粒括质粒DNA和基因组和基因组DNA)！三实验步骤流程三实验步骤流程接含接含pUC1

22、8(pUC18(或或pET21a)pET21a)质粒的单菌落于质粒的单菌落于3ml LB3ml LB Amp+ Amp+液体培育基中液体培育基中370C370C，190rpm190rpm振荡培育过夜振荡培育过夜取取1.51.5菌液入菌液入1.5ml1.5ml的的dorfdorf管中管中 6000rpm6000rpm、离心、离心2min2min，弃上清，搜集菌体，弃上清，搜集菌体100L100L溶液溶液I I悬浮菌体充分振荡，室温或冰悬浮菌体充分振荡，室温或冰浴浴10min10min参与参与200L200L溶液溶液IIII悄然混匀，冰上静置悄然混匀，冰上静置5min5min裂裂解菌体解菌体参与参与150L150L溶液溶液IIIIII悄然混匀，冰上静置悄然混匀，冰上静置15min15min质粒质粒DNADNA复性复性12000r/min12000r/min，离心，离心15min15min，取上清记录体积到一新管，取上清记录体积到一新管上清加等体积的酚：氯仿：异戊醇振荡混匀上清加等体积的酚：氯仿：异戊醇振荡混匀