蛋白质药物的PEG化学修饰胡涛

1、单击此处编辑母版标题样式单击此处编辑母版文本样式第二级第三级第四级第五级*蛋白质药物的PEG化学修饰胡 涛中国科学院过程工程研究所生化工程国家重点实验室1.迅速被体内酶降解2.肾小球过滤清除3.抗原抗体反应4.溶解度差导致沉淀蛋白质药物在使用中出现的问题TC实际浓度理想浓度体外聚乙二醇修饰（PEG化）(1)增大药物分子量，避免被肾小球过滤(2)阻碍蛋白酶的降解作用(3)屏蔽药物的免疫位点(4)增加药物在体液中的溶解度(5)与药物间的化学键在体内随时间水解，缓慢释放药物 +蛋白或多肽偶联物聚乙二醇CH3(-O-CH-CH)n-OH分离工程反应工程剂型工程生物医药生物能源生物材料生物化学品其它产品

2、生化工程（生物化学工程，Biochemical Engineering）目 录 PEG修饰的国内外研究进展 PEG修饰剂的研发 PEG修饰方法 PEG修饰工艺的优化 PEG修饰产物的质量控制一、PEG修饰的国内外研究进展国际上PEG修饰技术的研究进展美国Rutgers大学Davis教授70年代的工作甲氧基PEG的应用美国Enzon公司美国最早从事PEG修饰蛋白质药物的公司美国Shearwaters公司各种PEG修饰剂的生产商美国罗氏、先灵宝雅、安进PEG药物：PEG-INF，PEG-G-CSF其它：辉瑞、默克、葛兰素史克、施贵宝。国内PEG修饰技术的研究进展国家863重大机密项目：人工血液代用

3、品的研制，1997-2000中国科学院重点项目：血液代用品和血液净化，2001-2005国家重大科技专项课题创新药物和中药现代化：长效基因工程蛋白质和多肽制剂关键技术，2002-2005国家863重点项目课题：核酸和多肽的修饰和剂型化技术，2007-2010PEG修饰血红蛋白：I 期临床（中科院过程所、凯正公司）PEG修饰G-CSF：III 期临床（格兰百克）修饰粒细胞集落刺激因子（rhG-CSF）延长半衰期修饰人肿瘤坏死因子消除副作用修饰白介素I受体拮抗剂（rhIL-1Ra） 延长半衰期修饰牛胰核糖核酸酶（RNase）提高抗肿瘤活性修饰超氧化物歧化酶（SOD）提高半衰期修饰天冬酰氨酶（Asp

4、artase） 克服免疫原性提高半衰期修饰人干扰素（IFN）提高半衰期修饰血红蛋白（Hb）血液代用品修饰胰岛素提高半衰期我国在PEG修饰蛋白质方面的一些工作二、PEG修饰剂的研发Sc-PEG 专利分析以PEG-OH为原料的必然途径CH3OCH2CH2(OCH2CH2)nOH + 光气 + NHS CH3OCH2CH2(OCH2CH2)nO-C-O-N + NH2G-CSFOOOCH3OCH2CH2(OCH2CH2)nO-C-NHG-CSF O单链修饰：(SC-PEG)Roche公司的长效干扰素产品专利分析同样是以PEG-OH为原料的必然途径双链修饰：新的修饰策略采用新方法制备新的修饰剂以PEG

5、-COOH（CM-PEG)为原料的必然途径，已获专利CH3(OCH2CH2)nOCH2CH2OHCH3(OCH2CH2)nO-CH2C-O-N + NH2G-CSFOOO单链修饰：CH3(OCH2CH2)nOCH2COOHCH3(OCH2CH2)nO-CH2C-NHG-CSFO(CM-PEG)我们的策略以PEG-COOH为原料的必然途径CH3(OCH2CH2)nO-CH2C-NHOOO双链修饰：CH3(OCH2CH2)nOCH2COOH + Lysine OCH3(OCH2CH2)nO-CH2C-NH-O(CH2)3CH2CH-C-O-N+ NH2IFNCH3(OCH2CH2)nO-CH2C-

6、NHOOCH3(OCH2CH2)nO-CH2C-NH-O(CH2)3CH2CH-C-NHIFN1、PEG修饰剂的批量制备取得了成功取 得 的 主 要 进 展分枝型ZL 01141745.5分叉(长尾)型ZL 03100736.8可逆型ZL03105003.4不可逆型200410029577.1ZL02120740.2异端基双官能团200410029577.1聚乙二醇修饰剂产品产品号末端基团分子量包装（g）价格（￥）mPEG-OH5-OH5K100103500700mPEG-OH10-OH10K1001070001400mPEG-OH20-OH20K1001070001400mPEG-COOH5

7、-COOH5K10010100002000mPEG-COOH10-COOH10K10010150003000mPEG-COOH20-COOH20K10010200004000MPEG-NHS5-N-羟基琥珀酰亚胺5K1001052000040002000MPEG-NHS10-N-羟基琥珀酰亚胺10K1001053000060003000MPEG-NHS20-N-羟基琥珀酰亚胺20K1001053500070003500三、药用蛋白的PEG修饰方法创新技术（反应器技术和产物移走技术）振荡反应器流加反应器缓释反应器固相反应方式膜耦合反应方式双水相反应方式Q. Yun, R. Yang, T. Ch

8、en, J. Bi, G. Ma, Z Su. J. Biotechnology, 2005, 118: 67-74中国发明专利，申请号200510114930.0 中国发明专利，申请号0410029577 1.修饰反应器设计PEG-pellet 反应器吸附蛋白加入PEGPEG修饰洗脱2.固相吸附法制备PEG修饰蛋白固相吸附法与液相吸附法的比较1峰：原蛋白；2峰：单修饰蛋白； 3峰：多修饰蛋白PEG-INF的制备过程G-CSFPEG-G-CSFCH3(-O-CH-CH)n-OH甲氧基PEG（mPEG-OH）活化的mPEG-O-醛3.PEG醛制备单修饰的药用蛋白粒细胞集落刺激因子 (G-CSF)

9、MW: 18.8kd (174 amino acids) pI: 6.1,1 thiol, 1 N-terminal, 4 lysines, Half life: 5 h,Weekly injection: 7 times 三批PEG30-rhG-CSF产品的制备取 得 的 主 要 进 展序号产品批号试制日期试制量12007080012007-8-52007-8-15共3750 mg：6 mg/支，302支；3 mg/支，210支；1.5 mg/支，520支；6.6 mg/ml，80 ml22007090012007-9-82007-9-18共1263 mg：3 mg/支，400支；3.15

10、mg/ml，20 ml32007100012007-10-92007-10-21共1422 mg：3 mg/支，400支；3.4 mg/ml，65 ml。PEG化重组人生长激素，批产量1-10g；PEG化降纤酶，批产量6000支；环孢素A眼用微乳制剂，批产量5000支PEG化G-CSF2L修饰反应器计算机程序控制批产量3g生产周期10天修饰和剂型化产品质量达到国际先进水平生产规模产品质量批次稳定性1 2 3123123(A)(B)(C)以分子量为30kDa的PEG修饰rhG-CSF为例：(A)三批产品的SDS-PAGE检测图谱(B)三批产品的高效凝胶过滤检测图谱(C)三批产品的园二色检测图谱4

11、. 引入巯基的方法制备PEG修饰蛋白(2) PEGylationSNH+(1) ThiolationHS-(CH2)3-C-NH-HbNH+NOOPEG-S-(CH2)3-C-NH-HbNH+OPEGNO2-iminothiolaneNH2-HbSangart公司是一家私营的生物制药公司，主要从事氧载体的研发和产业化Hemospan - MP4 Phase I Sweden Status: CompletePhase Ib/II Sweden Status: CompletePhase II Sweden Status: Complete Phase II USA Status: Enroll

12、ment Complete Phase III Europe Status: Enrollment Complete 该PEG修饰产物的凝胶过滤分析四、PEG修饰工艺的优化PEG修饰反应参数的优化 建立反应动力学，包括位点反应动力学和蛋白分 子反应动力学，优化反应时间 优化反应的pH值 优化PEG与蛋白的摩尔比 优化反应体系pTimeppppp 蛋白分子的修饰反应动力学Weijun Li, Zhiguo Su. Quantitatively investigating monomethoxypolyethylene glycol modification of protein by capil

13、lary electrophoresis, J. Biochem. Biophys. Methods. 2004，59: 65-74PEG修饰的位点反应动力学PEG醛修饰药用蛋白的优化反应单修饰产物的分离纯化 P1 P2分离产物分析 6.514.3 29.0 66.420.1116 200 KDa44.3 P1 P2 P1凝胶过滤分析 膜耦合修饰工艺制备PEG化药用蛋白五、PEG修饰产物的质量控制IEF和SDS-PAGE鉴定PEG修饰蛋白1234+-Iodine stainComassie blue stainSDS-PAGEIEF1: Marker, 2: HbA, 3: -Hb 4: (P

14、ropyl-PEG5K)6-Hb5: (Propyl-PEG5K)6-Hb1: HbA, 2: -Hb 3: (Propyl-PEG5K)6-Hb4: (Propyl-PEG5K)6-Hb 1 2 3 4 4 5 5 94.0 66.2 43.0 31.0 20.1 14.4 RP-HPLC分析胰蛋白酶切片段质谱分析胰蛋白酶切片段MALDI-TOF/TOF分析PEG修饰位点在Val-1()PEG修饰蛋白的结构鉴定圆二色光谱鉴定荧光光谱鉴定RP-HPLC分析PEG修饰蛋白 蛋白质修饰剂及其制备方法和用途,中国发明专利， ZL01141745.5 制备分枝型聚乙二醇的新方法,中国发明专利， ZL0

15、2120740.2 带PEG长尾的蛋白质修饰剂的制法和用途,中国发明专利， ZL031100736.8 聚乙二醇羧酸的制备方法和其用途 ,中国发明专利， ZL 200310113367.6 重组人复合干扰素-聚乙二醇偶联物的制备及其偶联产物,中国发明专利， ZL 200410029577.1 一种蛋白质交联剂及其交联方法,中国发明专利， ZL 03105003.4 一种分级分离制备血红蛋白偶联物的方法,中国发明专利， ZL 99106228.0 一种二醇聚合物动物血红蛋白偶联物的制备方法,中国发明专利， ZL 99106229.9 一种二醇聚合物动物血清白蛋白偶联物的制备方法,中国发明专利 Z

16、L 00123696.2 分子量均一的聚合物血红蛋白的制备方法,中国发明专利 ZL 01136190.5. 血红蛋白-人血清白蛋白偶联物制备血液代用品及其制备方法,中国发明专利， ZL 03109622.0蛋白质修饰国家发明专利11项（已授权）PEG修饰的SCI论文Q Yun, T Chen, G Zhang, J Bi, G Ma , Z Su. A novel polyethylene glycol derivative suitable for the preparation of mono-PEGylated protein. Biotech Lett, 27, 213-217, 20

17、05 Q Yun, R Yang, T Chen, J Bi, G Ma, Z Su. Reproducible preparation and effective separation of PEGylated recombinant human granulocyte colony-stimulating factor with novel “PEG-pellet” PEGylation mode and ion-exchange chromatography. J Biotech. 2005, 118:67-74 Q Yun, M He, W Xing, J Bi, G Ma, Z Su

18、, A novel tetrafunctional reagent for simultaneous intramolecular and intermolecular cross-linking of bovine hemoglobin, Biotech Lett 26: 1359-1363, 2004. X Li, F Meng, G Ma , Z Su, A simple and efficient method for synthesis of carboxymethylated polyethyleneglycol. J Chem Res, In press.J Zhang, Y Zhao, Z Su, G Ma, Synthesis of Monomethoxy Poly(ethylene glycol) without Diol Poly(ethylene glycol), J Appl Polym Sci, 105, 37803786 (20