基因工程育种微生物遗传育种

1、基因工程育种微生物遗传育种2奠定基因工程的三项关键技术奠定基因工程的三项关键技术DNA的特异切割的特异切割 Smith 和和Nathans 获获1978年诺贝尔医学奖年诺贝尔医学奖DNA的分子克隆的分子克隆 Berg（1972）将猴病毒）将猴病毒SV40 DNA与与噬菌噬菌体基因融合，成功构建重组体基因融合，成功构建重组DNA； Cohen 和和Boyer （1973）将质粒）将质粒pSC101与与R的的tetrkmr基因融合，并将重组基因融合，并将重组DNA转化转化E.coli，首次实现了，首次实现了DNA的分子克隆。的分子克隆。DNA的快速测序的快速测序 Sanger(1975)的酶法、的

2、酶法、Gilbert(1977)的化的化学法学法DNA快速测序技术快速测序技术 1980年诺贝尔化学奖：年诺贝尔化学奖：Berg, Gilbert, Sanger第1页/共74页3分离或合成基因；分离或合成基因；通过体外重组将基因插入载体；通过体外重组将基因插入载体；将重组将重组DNA导入细胞；导入细胞；扩增克隆的基因；扩增克隆的基因；筛选重组体克隆；筛选重组体克隆；对克隆的基因进行鉴定或测序；对克隆的基因进行鉴定或测序；控制外源基因的表达；控制外源基因的表达；得到基因产物或转基因动物、转基因植物得到基因产物或转基因动物、转基因植物基因工程操作的主要步骤第2页/共74页4第一节第一节 基因克隆

3、的酶学基础基因克隆的酶学基础一、限制性核酸内切酶一、限制性核酸内切酶restrictive endonuclease核酸酶：核酸酶：通过切割相邻的两个核苷酸残基之间的磷通过切割相邻的两个核苷酸残基之间的磷酸二酯键，从而导致核酸分子多核苷酸链发生水酸二酯键，从而导致核酸分子多核苷酸链发生水解断裂的酶。解断裂的酶。核糖核酸酶核糖核酸酶(RNase)与脱氧核糖核酸酶与脱氧核糖核酸酶(DNase)核酸外切酶：核酸外切酶：exonuclease核酸内切酶：核酸内切酶：endonuclease第3页/共74页51、寄主控制的限制与修饰作用、寄主控制的限制与修饰作用（1）寄主控制的限制作用）寄主控制的限制作

4、用(Restriction)作用：破坏外源作用：破坏外源DNA，使之迅速降解，使之迅速降解机制：限制性核酸内切酶，识别特定的碱基序列机制：限制性核酸内切酶，识别特定的碱基序列并进并进 行切割行切割（2）寄主控制的修饰作用）寄主控制的修饰作用(Modification)作用：保护自身的作用：保护自身的DNA，使之不受限制，使之不受限制机制：甲基化酶，催化机制：甲基化酶，催化S-腺苷甲硫氨酸的甲基转移腺苷甲硫氨酸的甲基转移到到 限制酶识别序列的特定碱基，使之甲基限制酶识别序列的特定碱基，使之甲基化。化。第4页/共74页62、限制性核酸内切酶的类型、限制性核酸内切酶的类型特性特性型型型型型型功能功能

5、限制、修饰限制、修饰限制限制限制、修饰限制、修饰蛋白质结构蛋白质结构 3种不同亚基种不同亚基单一成分单一成分2种不同亚基种不同亚基所需辅助因所需辅助因子子ATP, Mg2+, SAMMg2+ATP, Mg2+, SAM识别序列识别序列EcoB: TGA(N)8TGCT48bp,旋转对旋转对称称EcoPI: AGACC切割位点切割位点距识别位点至少距识别位点至少1000kb处随机处随机切割切割在识别序列内在识别序列内（或附近）（或附近）距识别位点距识别位点3-端端2426bp处处第5页/共74页73、限制性核酸内切酶的命名、限制性核酸内切酶的命名用产生菌的用产生菌的属名一个字母属名一个字母(大写

6、，大写，斜体斜体)种名两个字母种名两个字母(小写，小写，斜体斜体)菌株菌株名一个字母名一个字母编号编号（罗马数字罗马数字） 例例EcoRI, EcoRII：从：从E.coli Rye13菌株中获得菌株中获得HindI，HindII，HindIII：从：从Haemophilus influenzae d菌株获得菌株获得 第6页/共74页84、型限制性核酸内切酶的基本特型限制性核酸内切酶的基本特征征（1）识别序列：）识别序列：一般一般48bp，具有二重旋转对称轴，序列呈回文结构，具有二重旋转对称轴，序列呈回文结构 ( palindromic structure )例：例：AluI：5-AGCT-3

7、 AsuI：5-GGNCC-3 PstI： 5-CTGCAG-3第7页/共74页9（2） 切割：切割：产生平末端：产生平末端：SmaI5-CCCGGG-33-GGGCCC-5产生产生3-OH单链粘性末端单链粘性末端: PstI5-C TGCA G -33-G ACGT C-5 产生产生5-P单链粘性末端单链粘性末端: EcoRI5-GAATT C -33-C TTAA G-5 第8页/共74页10第9页/共74页11酶剪切条件酶剪切条件需要镁离子的存在，特定的酸碱度和离子强度。需要镁离子的存在，特定的酸碱度和离子强度。辅助条件：辅助条件：DTT、牛血清蛋白。、牛血清蛋白。抑制因子：杂蛋白、酚、

8、氯仿、乙醇、抑制因子：杂蛋白、酚、氯仿、乙醇、EDTA、SDS、高盐浓度。、高盐浓度。其它：甘油浓度等可以改变对序列的识别。其它：甘油浓度等可以改变对序列的识别。第10页/共74页12狭义：来源不同但狭义：来源不同但识别和切割相同识别和切割相同序列的酶。序列的酶。 Hpa与与MspI: CCGG广义：来源于不同物种但能广义：来源于不同物种但能识别相同识别相同DNA序列序列的限制性内切酶，的限制性内切酶，切割切割位点位点可以相同也可以不可以相同也可以不同同异功酶（异功酶（neoschizomer）：）：SmaI和和XmaI，它，它们均识别们均识别CCCGGG，但前者切后产生钝末端，但前者切后产生

9、钝末端，后者切后产生粘性末端。后者切后产生粘性末端。 （3）同裂酶 ( isoschizomers )第11页/共74页13 两种酶切割序列不完全相同，但却能产生相两种酶切割序列不完全相同，但却能产生相同的粘性末端，这类酶被称为同尾酶同的粘性末端，这类酶被称为同尾酶 BamHI: GGATCC Bgl：T GATCA（4） 同尾酶 ( isoocaudamer )第12页/共74页14二、二、DNA连接酶（连接酶（DNA ligase ） 催化两个双链催化两个双链DNA片段相邻的片段相邻的5-P与与3-OH之间形成磷酸二酯键。之间形成磷酸二酯键。1、体外、体外DNA连接连接连接具有互补粘性末端

10、的连接具有互补粘性末端的DNA片段片段连接具有平末端的连接具有平末端的DNA片段片段先在先在DNA片段末端加上人工接头，使其形成粘性末端，再行连接片段末端加上人工接头，使其形成粘性末端，再行连接第13页/共74页152、连接用酶、连接用酶（1）T4 DNA连接酶：连接酶：催化反应需要催化反应需要Mg+2, ATP催化粘性末端连接，效率较高催化粘性末端连接，效率较高催化平末端连接催化平末端连接（2）大肠杆菌连接酶）大肠杆菌连接酶催化反应需要催化反应需要NAD+只能催化粘性末端的连接只能催化粘性末端的连接第14页/共74页16减少载体减少载体自身连接自身连接的方法：的方法：脱磷酸；脱磷酸；双酶切双

11、酶切第15页/共74页17三、反转录酶三、反转录酶 (reverse transcriptase)催化以催化以mRNA为模板的为模板的cDNA的合成的合成 cDNA（complementary DNA）：）： 互补于互补于mRNA的的DNA片段片段内含子外显子 DNA 转录前体mRNA 修饰成熟mRNA第16页/共74页18Reverse transcription第17页/共74页19四、末端转移酶四、末端转移酶(terminal deoxynucleotidyl transferase)催化将脱氧核苷酸连接至催化将脱氧核苷酸连接至DNA分子末端的分子末端的3-OH上上向向3-单链末端上连接

12、：单链末端上连接：Mg+2向平末端上连接：向平末端上连接：Co+2五、五、Taq DNA聚合酶聚合酶来源：栖热水生菌来源：栖热水生菌 Thermus aquaticus第18页/共74页20第二节第二节 基因的克隆载体基因的克隆载体(cloning vector)克隆载体克隆载体：以繁殖以繁殖DNA片段为目的的载体片段为目的的载体克隆载体的基本要求克隆载体的基本要求在细胞中能进行自主复制，为松弛型在细胞中能进行自主复制，为松弛型;具有多种限制酶的单一切割位点，便于外源具有多种限制酶的单一切割位点，便于外源DNA的插入，并且插入后不影响载体的复制的插入，并且插入后不影响载体的复制;容易进入宿主细

13、胞，进入效率越高越好，并容易进入宿主细胞，进入效率越高越好，并且容易从宿主细胞中分离纯化出来，以便于重且容易从宿主细胞中分离纯化出来，以便于重组操作组操作;具有可供选择的遗传标记具有可供选择的遗传标记第19页/共74页21一、质粒载体一、质粒载体1、质粒的一般生物学特性、质粒的一般生物学特性 (1)环状双链质粒环状双链质粒DNA的构型的构型共价闭合环状共价闭合环状DNA(cccDNA):两条链均保持两条链均保持完整的环状构型，通常呈现超螺旋的完整的环状构型，通常呈现超螺旋的SC构型构型开环开环DNA(ocDNA)：一条链保持完整的环状：一条链保持完整的环状结构，另一条链出现有一至数个缺口，即结

14、构，另一条链出现有一至数个缺口，即OC构型构型线形线形DNA(l DNA)：质粒：质粒DNA经过适当的限经过适当的限制性核酸内切酶的切割后，发生双链断裂，称制性核酸内切酶的切割后，发生双链断裂，称L构型构型第20页/共74页22第21页/共74页23(2)表型效应表型效应性别：性别：F，SCP1抗生素类物质合成：抗生素类物质合成：SCP1，Col抗药性：抗药性：R分解性质粒：分解性质粒：CAM(樟脑樟脑)，TOL(甲苯甲苯)酶的合成：酶的合成：Rye13隐蔽性质粒隐蔽性质粒(cryptic plasmid)：2m第22页/共74页24(3)质粒的分类质粒的分类分子量：分子量： 大型质粒：大型质

15、粒：MW40106d 小型质粒：小型质粒：MW10106d复制类型复制类型 严紧型质粒严紧型质粒(stringent)：13 copies/cell 松弛型质粒松弛型质粒(relaxed)：1060, or more第23页/共74页25接合类型接合类型 接合型质粒接合型质粒(conjugative) 非接合型质粒非接合型质粒(nonconjugative)质粒的不亲和性质粒的不亲和性(incompatibility) 在没有选择压力的情况下，两种亲缘关系密切的不同质粒，不能够在同一在没有选择压力的情况下，两种亲缘关系密切的不同质粒，不能够在同一个寄主细胞中稳定共存的现象。个寄主细胞中稳定共存

16、的现象。同一不亲和群同一不亲和群：不能共存于同一细胞中不能共存于同一细胞中不同的不亲和群不同的不亲和群：能共存于同一细胞中能共存于同一细胞中第24页/共74页26(4)质粒的命名质粒的命名质粒名以三个英文字母加阿拉伯数字表示质粒名以三个英文字母加阿拉伯数字表示 pUC19plasmid 发现者或实验室名发现者或实验室名 编号编号(小写）小写） （大写）（大写）第25页/共74页27为了说明质粒的来源、性状，有时需要标出缺失、插入等为了说明质粒的来源、性状，有时需要标出缺失、插入等pXY9109：FD DtraA3(63.1-64.0kb)pXY2101：pXY101W W40kb:k12his

17、A:1.5kb(5)与质粒有关的菌株的命名与质粒有关的菌株的命名E.coli k12: E.coli C600：k12(F-)(l l-)thr leu tonA lacY thiE.coli XY100：C600(F155)(pXY1234)第26页/共74页282、质粒克隆载体、质粒克隆载体（1）特性）特性 具有独立复制起点具有独立复制起点; 具有较小的相对分子量（具有较小的相对分子量（1200kb）, 克隆外源克隆外源DNA片段一般不超过片段一般不超过15kb； 具有较高的拷贝数（具有较高的拷贝数（10200）；）； 具有便于选择的标记；具有便于选择的标记； 易于导入细胞；易于导入细胞；

18、 具有安全性具有安全性第27页/共74页29（2）克隆质粒载体）克隆质粒载体第28页/共74页30第29页/共74页31质粒分离的步骤：粗提粗提精提精提第30页/共74页32氯化铯梯度离心法：氯化铯梯度离心法：有效地去除蛋白质、有效地去除蛋白质、RNA、染色体、染色体DNA、受损质粒。、受损质粒。第31页/共74页33二、二、l l噬菌体克隆载体噬菌体克隆载体1、优点、优点遗传学背景十分清楚遗传学背景十分清楚载体容量大，载体容量大，23kb具有较高的感染效率具有较高的感染效率2、类型、类型插入型载体插入型载体:较小片段较小片段DNA的插入（的插入（10kb以以内）；内）；取代型载体：较大片段取

19、代型载体：较大片段DNA的插入；的插入；重组重组DNA分子大小为分子大小为l l噬菌体噬菌体DNA的的75105；野生型；野生型DNA为为 48kb，噬菌体的包装上噬菌体的包装上限是限是 51kb。编码必要基因的。编码必要基因的DNA区段占区段占28kb，因此因此载体克隆外源载体克隆外源DNA的理论极限值应是的理论极限值应是23kb。第32页/共74页34插入型载体插入型载体第33页/共74页35取代型载体取代型载体第34页/共74页363、 l l噬菌体克隆载体的导入噬菌体克隆载体的导入 转染转染：用：用重组体重组体DNA分子直接感染大肠杆菌，使之侵入寄主细胞内。分子直接感染大肠杆菌，使之侵

20、入寄主细胞内。效率低：未经任何基因操作处理的新鲜制备效率低：未经任何基因操作处理的新鲜制备的的DNA，其典型的转染效率也仅为，其典型的转染效率也仅为 105106噬菌斑噬菌斑/微克微克DNA，体外连接的结果，转，体外连接的结果，转染效率便下降到了染效率便下降到了104103左右。左右。 DNA的体外包装：的体外包装：在离体条件下，将重组体在离体条件下，将重组体DNA包入噬菌体等病毒颗粒，包入噬菌体等病毒颗粒，形成有感染功能的病毒载体。形成有感染功能的病毒载体。第35页/共74页37三、柯斯质粒载体三、柯斯质粒载体(cosmid vector) 由由l l噬菌体的粘噬菌体的粘性末端和质粒构性末端

21、和质粒构建而成。含有来建而成。含有来自质粒的一个复自质粒的一个复制起点、抗药性制起点、抗药性标记、一个或多标记、一个或多个限制酶单一位个限制酶单一位点，来自点，来自l l噬菌体噬菌体粘性末端的粘性末端的DNA片段（片段（cos位点）。位点）。第36页/共74页38优点优点 具有具有l l噬菌体的特性，在体外包装后具有噬菌体的特性，在体外包装后具有噬菌体的高效感染力；噬菌体的高效感染力； 具有质粒具有质粒DNA的复制方式；的复制方式； 具有克隆大片段外源具有克隆大片段外源DNA的能力的能力(45kb)； 具有与同源序列的质粒进行重组的能力具有与同源序列的质粒进行重组的能力第37页/共74页39柯

22、斯克隆柯斯克隆（cosmid cloning） 应用柯斯质粒载应用柯斯质粒载体，在大肠杆菌细体，在大肠杆菌细胞中克隆大片段的胞中克隆大片段的真核基因组真核基因组DNA技技术术第38页/共74页40第三节第三节 基因工程的基本操作基因工程的基本操作一、目的基因的获得一、目的基因的获得1、从供体细胞的、从供体细胞的DNA中分离中分离 （基因文库基因文库的构建）的构建）基因文库：某基因文库：某生物染色体基因组各生物染色体基因组各DNA片段的克隆总体。片段的克隆总体。如如“鸟枪法鸟枪法”(Shotgun Method)第39页/共74页41步骤步骤 提取染色体提取染色体DNA 限制酶解限制酶解 电泳分

23、离电泳分离 与载体连接与载体连接 导入宿主导入宿主 筛选阳性克隆筛选阳性克隆第40页/共74页422、从、从mRNA合成合成cDNA (cDNA文库构建）文库构建）所谓所谓cDNA文库是指某生物体全部文库是指某生物体全部mRNA的的cDNA克隆总体。克隆总体。第41页/共74页43步骤步骤 提取提取mRNA 反转录合成反转录合成cDNA第一链第一链 合成合成cDNA第二链第二链 与载体连接与载体连接 导入宿主细胞导入宿主细胞 筛选阳性克隆筛选阳性克隆第42页/共74页443、PCR体外扩增目的基因体外扩增目的基因PCR（Polymerase Chain Reaction）聚合酶链式反应聚合酶链

24、式反应：利用特殊的利用特殊的DNA聚聚合酶，在体外扩增位于两段已知序列之间的特定合酶，在体外扩增位于两段已知序列之间的特定DNA区段的方法。区段的方法。(1) PCR组成：组成： 含目标含目标DNA序列的模板序列的模板DNA 寡核苷酸引物寡核苷酸引物 DNA聚合酶：聚合酶：Taq 或或 Pfu dNTPs 缓冲体系和金属离子缓冲体系和金属离子第43页/共74页45(2) PCR过程过程 变性变性( denaturation)：90以上以上 退火退火( annealing)：4060 延伸延伸(extension)：72 如此进行如此进行2040 个循环，个循环，DNA量扩增量扩增106107倍

25、。倍。第44页/共74页46第45页/共74页47第46页/共74页484、基因的化学合成、基因的化学合成 主要应用于已知核苷酸序列的、分子量较小的基因的制备。主要应用于已知核苷酸序列的、分子量较小的基因的制备。 通常先合成一定长度的具有特定序列的寡核苷酸片段，然后再组装成完整通常先合成一定长度的具有特定序列的寡核苷酸片段，然后再组装成完整的基因。的基因。 方法主要有：磷酸二酯法、磷酸三酯法、亚磷酸三酯法、固相合成法和自方法主要有：磷酸二酯法、磷酸三酯法、亚磷酸三酯法、固相合成法和自动化法等。动化法等。第47页/共74页49二、目的二、目的DNA与载体的连接与载体的连接1、粘性末端连接、粘性末

26、端连接2、平齐末端连接、平齐末端连接3、同聚末端连接、同聚末端连接4、人工接头连接、人工接头连接第48页/共74页50三、重组三、重组DNA导入宿主细胞导入宿主细胞1、转化或转染、转化或转染2、体外包装与感染、体外包装与感染3、电穿孔法、电穿孔法electroporationv 常用宿主系常用宿主系统统第49页/共74页51过程：连接反应的混合液过程：连接反应的混合液+感受态细胞感受态细胞;冰浴冰浴10至至30分钟分钟;热休克热休克0.5至至2分钟分钟;加入培养基加入培养基37C振荡培养振荡培养1小时小时;涂布平板，培养。涂布平板，培养。第50页/共74页52四、重组体的筛选与鉴定四、重组体的

27、筛选与鉴定1、遗传学方法遗传学方法：检测选择性标记：检测选择性标记2、核酸杂交方法核酸杂交方法：检测目的基因：检测目的基因3、免疫化学方法免疫化学方法：检测目的基因产物：检测目的基因产物4、直接检出法：检测目的基因产物、直接检出法：检测目的基因产物第51页/共74页53五、五、DNA序列测定序列测定Sanger双脱氧链终止法双脱氧链终止法1、试剂、试剂引物引物模板：待测序模板：待测序DNADNA聚合酶聚合酶dNTPsddNTP第52页/共74页542、测序反应、测序反应3、制备聚丙烯酰胺凝胶、制备聚丙烯酰胺凝胶3、凝胶加样、凝胶加样4、电泳、电泳5、结果记录与分析、结果记录与分析第53页/共7

28、4页55第54页/共74页56第55页/共74页57六、外源基因的表达六、外源基因的表达影响表达的因素影响表达的因素 细胞中基因拷贝数：拷贝数多，产物多细胞中基因拷贝数：拷贝数多，产物多 转录水平：启动子与转录水平：启动子与RNA多聚酶的统一多聚酶的统一 翻译水平：翻译水平：mRNA的核糖体结合部位与宿主核糖体的统一；密码子与的核糖体结合部位与宿主核糖体的统一；密码子与tRNA的统一；的统一； mRNA的稳定性的稳定性 外源基因的插入方向外源基因的插入方向 转录后的修饰及翻译后的修饰转录后的修饰及翻译后的修饰第56页/共74页58第四节第四节 基因工程的实际应用基因工程的实际应用 微生物发酵微

29、生物发酵 病毒疫苗病毒疫苗 哺乳动物蛋白（人源蛋白药物）哺乳动物蛋白（人源蛋白药物） 转基因动植物转基因动植物 环境生物技术环境生物技术 基因诊断与基因治疗基因诊断与基因治疗 蛋白质工程（定点突变、定向进化）蛋白质工程（定点突变、定向进化） 代谢工程代谢工程第57页/共74页59复习题复习题1、何谓基因工程？基因工程操作主要步骤。、何谓基因工程？基因工程操作主要步骤。2、何谓限制性核酸内切酶？、何谓限制性核酸内切酶？型限制性核型限制性核 酸内切酶有何特点？酸内切酶有何特点？3、克隆载体的基本要求。、克隆载体的基本要求。4、质粒的表型效应、分类、命名。、质粒的表型效应、分类、命名。5、目的基因的

30、获得途径、目的基因的获得途径6、名词：基因文库、名词：基因文库、cDNA文库、文库、PCR、 质粒不亲和性质粒不亲和性第58页/共74页60插入钝化插入钝化/失活失活（insertional inactivation)由于外源由于外源DNA插入到某插入到某一基因内而使其功能丧一基因内而使其功能丧失的现象。失的现象。 受体细胞是受体细胞是Amp、Tet的的敏感型敏感型在在Amp+Tet培养基上生培养基上生长的是野生型质粒长的是野生型质粒只在只在Amp培养基上生长培养基上生长的带有重组质粒的带有重组质粒选择性标记筛选选择性标记筛选第59页/共74页61b b-半乳糖苷酶显色反应（蓝白斑筛选）半乳糖

31、苷酶显色反应（蓝白斑筛选） -半乳糖苷酶能将无色底物半乳糖苷酶能将无色底物X-gal切割成半乳糖切割成半乳糖和深蓝色的和深蓝色的5-bromo-4-chloroindigo，菌落呈，菌落呈蓝蓝色色宿主基因合成的是缺失宿主基因合成的是缺失N-末端末端1141氨基酸的缺氨基酸的缺陷型酶，无活性陷型酶，无活性pUC系列等质粒具有系列等质粒具有lacZ基因，所编码酶的基因，所编码酶的N-末端片段与宿主基因产物组成有活性的酶（末端片段与宿主基因产物组成有活性的酶（-互补），菌落呈互补），菌落呈蓝色蓝色pUC质粒上在质粒上在lacZ中间具有中间具有MCS，外源，外源DNA片段的插入，使片段的插入，使lac

32、Z无完整产物，不能与宿主无完整产物，不能与宿主产物组成有活性的酶，菌落呈无色产物组成有活性的酶，菌落呈无色第60页/共74页62转化子电泳分析转化子电泳分析第61页/共74页63第62页/共74页64常用宿主系统常用宿主系统受体细胞应具备的条件受体细胞应具备的条件v限制性缺陷型限制性缺陷型RecB-，RecC-，hsdR-；v重组整合缺陷型重组整合缺陷型RecA-（对于用于基因扩增（对于用于基因扩增或基因高效表达的受体）；或基因高效表达的受体）； v具有较高的转化效率具有较高的转化效率 v具有与重组体互补的遗传性状具有与重组体互补的遗传性状 v无毒，无致病性，感染与寄生缺陷型无毒，无致病性，感

33、染与寄生缺陷型 （安（安全角度的要求）全角度的要求）v生长迅速，容易培养生长迅速，容易培养v遗传背景清楚，遗传性状稳定遗传背景清楚，遗传性状稳定第63页/共74页65各种生物受体细胞的特性各种生物受体细胞的特性v 大肠杆菌：繁殖迅速，载体系统完备，遗传背景清楚；产内毒素，潜在致病性，大肠杆菌：繁殖迅速，载体系统完备，遗传背景清楚；产内毒素，潜在致病性，蛋白质分泌难蛋白质分泌难v 枯草杆菌：无潜在致病性，不产内毒素，蛋白质分泌枯草杆菌：无潜在致病性，不产内毒素，蛋白质分泌 ；遗传不稳定性，高蛋白酶；遗传不稳定性，高蛋白酶活性活性v 链霉菌：原核生物基因的克隆表达及蛋白产物的分泌链霉菌：原核生物基

34、因的克隆表达及蛋白产物的分泌v 酿酒酵母：繁殖迅速，遗传背景清楚，真核性；蛋白质产物含量太高，基因表达酿酒酵母：繁殖迅速，遗传背景清楚，真核性；蛋白质产物含量太高，基因表达产物难于分离纯化，适用于真核生物基因的表达产物难于分离纯化，适用于真核生物基因的表达第64页/共74页66 各种生物受体细胞的特性各种生物受体细胞的特性v 毕赤酵母：繁殖迅速，可以高密度培养，甲醇营养型，真核性，本身蛋白质产物分毕赤酵母：繁殖迅速，可以高密度培养，甲醇营养型，真核性，本身蛋白质产物分泌少；翻译后过度修饰泌少；翻译后过度修饰（ ？）？）v 高等动物细胞：分子重组表达系统健全，真核性；细胞培养要求苛刻，生长缓慢。

35、高等动物细胞：分子重组表达系统健全，真核性；细胞培养要求苛刻，生长缓慢。适用于人源基因产物的表达适用于人源基因产物的表达v 高等植物细胞：农作物的经济意义重大，转基因细胞易于分化，细胞培养简单；遗高等植物细胞：农作物的经济意义重大，转基因细胞易于分化，细胞培养简单；遗传操作困难繁琐。适用于植物基因的表达及植物品种的改良传操作困难繁琐。适用于植物基因的表达及植物品种的改良第65页/共74页673、限制性核酸内切酶的命名、限制性核酸内切酶的命名用产生菌的用产生菌的属名一个字母属名一个字母(大写，大写，斜体斜体)种名两个字母种名两个字母(小写，小写，斜体斜体)菌株菌株名一个字母名一个字母编号编号（罗马数字罗马数字） 例例EcoRI, EcoRII：从：从E.coli Rye13菌株中获得菌株中获得HindI，HindII，HindIII：从：从Haemophilus influenzae d菌株获得菌株获得 第66页/共74页68（2） 切割：切割：产生平末端：产生平末端：SmaI5-CCCGGG-33-GGGCCC-5产生产生3-OH单链粘性末端单链粘性末端: PstI5-C TGCA G -33-G ACGT C-5 产生产生5-P单链粘性末端单链粘性末端: EcoRI5-GAATT C -33-C TTAA G-5 第67页/