高中生物选修一专题5课题353血红蛋白的提取与分离

1、课题课题 3 血红蛋白的提取和分离血红蛋白的提取和分离 蛋白质是生命活动不可缺少的物质。随着人类基因组蛋白质是生命活动不可缺少的物质。随着人类基因组计划的进展以及多种生物基因组测序工作的完成，人类跨计划的进展以及多种生物基因组测序工作的完成，人类跨入了后基因组和蛋白质组时代。入了后基因组和蛋白质组时代。对蛋白质的研究与应用，对蛋白质的研究与应用，首先需要获得纯度较高的蛋白质。因此，从复杂的细胞混首先需要获得纯度较高的蛋白质。因此，从复杂的细胞混合物中提取、分离高纯度的蛋白质是生物科学研究中经常合物中提取、分离高纯度的蛋白质是生物科学研究中经常要做的工作。要做的工作。 血红蛋白血红蛋白是人和其他

2、脊椎动物红细胞的主要组成成分是人和其他脊椎动物红细胞的主要组成成分负责血液中负责血液中O O2 2和和COCO2 2的运偷。在本课题中，我们将以血红的运偷。在本课题中，我们将以血红蛋白为实验材抖，学习蛋白质提取和分离的一些基本才技蛋白为实验材抖，学习蛋白质提取和分离的一些基本才技术术 课题背景课题背景 根据蛋白质各种特性的差异，根据蛋白质各种特性的差异，如如分子的形状和大小分子的形状和大小、所带、所带电荷的性质和多少电荷的性质和多少、溶解度溶解度和和吸附的性质吸附的性质和和对其他分子的亲和力对其他分子的亲和力等等，等等，可以用来分离不同蛋白质。可以用来分离不同蛋白质。基础知识基础知识1 1、凝

3、胶色谱法：、凝胶色谱法：分配色谱法分配色谱法 根据蛋白质根据蛋白质相对分子质量的大小，相对分子质量的大小，利用具有多孔利用具有多孔结构的凝胶的结构的凝胶的分子筛作用，分子筛作用，来进行来进行分离蛋白质的分离蛋白质的方法。方法。2 2、凝胶、凝胶性质：一些性质：一些微小的多孔球体微小的多孔球体，球球内含许多内含许多贯穿的通道；贯穿的通道； 化学本质：化学本质：多糖类化合物：多糖类化合物：实例：实例：葡聚糖、琼脂糖：葡聚糖、琼脂糖：基础知识（一）基础知识（一） 凝胶色谱法凝胶色谱法 原理：原理：当不同的蛋白当不同的蛋白质通过凝胶时，质通过凝胶时，相对分子相对分子质量较小质量较小的蛋白质容易进的蛋白

4、质容易进入凝胶内部的通道，路程入凝胶内部的通道，路程较长，较长，移动速度移动速度较慢较慢；而；而相对分子质量较大相对分子质量较大的蛋白的蛋白质无法进入凝胶内部的通质无法进入凝胶内部的通道，只能在道，只能在凝胶外部凝胶外部移动，移动，路程路程较短较短，移动速度，移动速度较快，较快，相对分子质量不同的蛋白相对分子质量不同的蛋白质因此得以分离。质因此得以分离。1 1、缓冲溶液概念、作用、缓冲溶液概念、作用 在一定的范围内，能抵制外界酸或碱对溶液在一定的范围内，能抵制外界酸或碱对溶液PHPH的的影响，维持其影响，维持其PHPH值基本不变，具有这样缓冲作用值基本不变，具有这样缓冲作用的溶液叫做缓冲溶液。

5、的溶液叫做缓冲溶液。2 2、缓冲溶液配制、缓冲溶液配制 通常由通常由1 12 2种缓冲剂溶解于水中配制而成。调种缓冲剂溶解于水中配制而成。调节缓冲剂的使用比例就可以制得在不同节缓冲剂的使用比例就可以制得在不同PHPH范围内范围内使用的缓冲液。使用的缓冲液。基础知识基础知识 （二）缓冲溶液（二）缓冲溶液弱酸和弱酸盐组合弱酸和弱酸盐组合3 3、缓冲溶液的组分分类、缓冲溶液的组分分类弱碱和弱碱盐弱碱和弱碱盐多元弱酸的酸式盐和其他所对应的次级盐多元弱酸的酸式盐和其他所对应的次级盐 该课题使用的是磷酸缓冲液，目的是利用缓冲液模拟该课题使用的是磷酸缓冲液，目的是利用缓冲液模拟细胞内的细胞内的PHPH环境，

6、保证血红蛋白的正常结构和功能，便于环境，保证血红蛋白的正常结构和功能，便于观察观察( (红色红色) )和科学研究和科学研究( (活性活性) )。2 2、原理：许多重要的生物大分子，（、原理：许多重要的生物大分子，（ ）等都具有等都具有( ) ( ) 在在( )( )下，这些基下，这些基团会带上（团会带上（ ） 。在电场的作用下，这些带。在电场的作用下，这些带电分子会向着与其（电分子会向着与其（ ）移动。电泳）移动。电泳利用了待分离样品中各种分子（利用了待分离样品中各种分子（ ）以）以及分子本身（及分子本身（ ）、（）、（ ）的不同使）的不同使带电分子产生不同的（带电分子产生不同的（ ），从而实

7、现样品），从而实现样品中各种分子的分离。中各种分子的分离。多肽、核酸多肽、核酸可解离的基团可解离的基团正电或负电正电或负电所带电荷相反的电极所带电荷相反的电极带电性质的差异带电性质的差异大小大小形状形状迁移速度迁移速度一定的一定的PHPH基础知识（三）电泳基础知识（三）电泳1 1、概念、概念带电粒子在电场作用下发生迁移的过程。带电粒子在电场作用下发生迁移的过程。琼脂糖凝胶电泳、琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳。聚丙烯酰胺凝胶电泳。3 3、电泳的类型、电泳的类型SDSSDS聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质分子量。测定蛋白质分子量。烯烯蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决于蛋白质在

8、聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决于它所带它所带静电荷的多少静电荷的多少以及以及分子的大小分子的大小等因素。等因素。原理原理4 4、实例、实例为了消除为了消除静电荷对迁移率的影响静电荷对迁移率的影响可以在凝胶中加可以在凝胶中加入入SDSSDS。 SDS SDS能能使蛋白质发生完全变性使蛋白质发生完全变性。由几条肽链组。由几条肽链组成的蛋白质复合体在成的蛋白质复合体在SDSSDS的作用下会解聚成单条肽的作用下会解聚成单条肽链，因此测定的结果只是链，因此测定的结果只是单条肽链的分子量单条肽链的分子量。SDSSDS能与各种蛋白质形成蛋白质能与各种蛋白质形成蛋白质SDSSDS复合物，复合物，SDSSDS所所

9、带负电荷的量大大超过了蛋白质分子原有电荷量。带负电荷的量大大超过了蛋白质分子原有电荷量。因而掩盖了不同种电荷间的电荷差别，使电泳迁因而掩盖了不同种电荷间的电荷差别，使电泳迁移率移率完全取决于分子的大小完全取决于分子的大小。 SDS SDS作用机理作用机理实验操作实验操作（一）样品处理（一）样品处理样品处理样品处理粗分离粗分离纯化纯化纯度鉴定纯度鉴定问：问：蛋白质提取和分离步骤？蛋白质提取和分离步骤？ 血液由血浆和各种血细胞组成，其中红细胞最多。在血液由血浆和各种血细胞组成，其中红细胞最多。在红细胞的组成中，约红细胞的组成中，约9090是血红蛋白。血红蛋白由四个肽是血红蛋白。血红蛋白由四个肽链组

10、成链组成( (如图如图) )，包括两个，包括两个-肽链和两个肽链和两个-肽链。其中每肽链。其中每条肽链环绕一个亚铁血红素基团，此基团可携带一分子氧条肽链环绕一个亚铁血红素基团，此基团可携带一分子氧或一分子二氧化碳。血红蛋白因含有血红素而呈现红色。或一分子二氧化碳。血红蛋白因含有血红素而呈现红色。选材选材 本课题可选用猪、牛、羊或其他本课题可选用猪、牛、羊或其他脊椎动物脊椎动物的的血液来分离血红蛋白。预先加入柠檬酸钠，防止血液来分离血红蛋白。预先加入柠檬酸钠，防止血液凝固。血液凝固。目的：目的：去除杂蛋白，以利于后续步骤的分离纯化。去除杂蛋白，以利于后续步骤的分离纯化。采集的血样采集的血样分离红

11、细胞：分离红细胞：分离时采用分离时采用低速短时间离心低速短时间离心，如，如500 500 r rminmin离心离心2min2min，然后用胶头吸管吸出上层透明，然后用胶头吸管吸出上层透明的黄色血浆，将下层暗红色的红细胞液倒入烧杯的黄色血浆，将下层暗红色的红细胞液倒入烧杯洗涤：洗涤：加入五倍体积的加入五倍体积的生理盐水生理盐水( (质量分数为质量分数为0.90.9的的NaClNaCl溶液溶液) )，缓慢搅拌，缓慢搅拌10min10min，低速短时间离，低速短时间离心，如此重复洗涤三次，心，如此重复洗涤三次，直至上清液中没有黄色，直至上清液中没有黄色，表明红细胞已洗涤干净。表明红细胞已洗涤干净。

12、 1.1.红细胞的洗涤红细胞的洗涤2.2.血红蛋白的释放血红蛋白的释放 将洗涤好的红细胞倒入烧杯中，加将洗涤好的红细胞倒入烧杯中，加蒸馏水蒸馏水到到原血液的体积，再加原血液的体积，再加4040体积的体积的甲苯甲苯，置于磁力，置于磁力搅拌器上充分搅拌搅拌器上充分搅拌10 min10 min。在蒸馏水和甲苯的作。在蒸馏水和甲苯的作用下，用下，红细胞破裂，释放出血红蛋白红细胞破裂，释放出血红蛋白。 蒸馏水作用：使细胞吸水胀破蒸馏水作用：使细胞吸水胀破甲苯的作用：溶解细胞膜，加速甲苯的作用：溶解细胞膜，加速细胞破裂，释放血红蛋白。细胞破裂，释放血红蛋白。3.3.分离血红蛋白溶液分离血红蛋白溶液离心分层

13、：离心分层：2000r/min 10min2000r/min 10min 第三层为血红蛋白溶液第三层为血红蛋白溶液过滤：除去脂溶性深沉层，取滤液（血红蛋白水溶液）过滤：除去脂溶性深沉层，取滤液（血红蛋白水溶液）分液漏斗：静置片刻，取下层分液漏斗：静置片刻，取下层 红色透明液体红色透明液体 取取1mL1mL的血红蛋白溶液装入透析袋中，将透析袋放入的血红蛋白溶液装入透析袋中，将透析袋放入盛有盛有300mL300mL的物质的量浓度为的物质的量浓度为20mmol/L20mmol/L的的磷酸缓冲液磷酸缓冲液中（中（pHpH为为7.07.0），透析），透析12h12h。4.4.透析透析透析目的是：透析目的

14、是：除去样品中分子量较小的杂质。除去样品中分子量较小的杂质。说明：说明：透析袋是一种半透膜，能使小分子自由进出，而大透析袋是一种半透膜，能使小分子自由进出，而大分分 子不能通过。子不能通过。实验操作实验操作 （二）凝胶色谱操作（二）凝胶色谱操作1.1.凝胶色谱柱的制作凝胶色谱柱的制作2.2.凝胶色谱柱的装填凝胶色谱柱的装填固定色谱柱固定色谱柱配凝胶悬液配凝胶悬液装填色谱柱装填色谱柱计算所需凝胶量计算所需凝胶量蒸馏水溶胀蒸馏水溶胀凝胶装填时尽量紧密，以降低凝胶颗粒之凝胶装填时尽量紧密，以降低凝胶颗粒之间的空隙；间的空隙； 装填凝胶柱时不得气泡存在。装填凝胶柱时不得气泡存在。（因为气泡会扰乱洗脱液

15、中蛋白质的洗脱因为气泡会扰乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果。）次序，降低分离效果。）垂直固定在支架上垂直固定在支架上装填完毕后，立即用缓冲液洗装填完毕后，立即用缓冲液洗脱瓶，在脱瓶，在50cm高的操作压下，高的操作压下，用用300mL的的20mmol/L的的磷酸缓磷酸缓冲液冲液（pH为为7.0）充分洗涤平衡）充分洗涤平衡12h。洗涤平衡洗涤平衡1 1、液面不要低于凝胶表面，否、液面不要低于凝胶表面，否则可能有气泡混入，影响液体在则可能有气泡混入，影响液体在柱内的流动与最终生物大分子物柱内的流动与最终生物大分子物质的分离效果；质的分离效果；2 2、不能发生洗脱液流干，露、不能发生洗脱液流

16、干，露出凝胶颗粒的现象。出凝胶颗粒的现象。3.3.样品的加入和洗脱样品的加入和洗脱调节缓冲液面调节缓冲液面 加样前，打开色谱柱下端的流出口，使柱内凝胶面加样前，打开色谱柱下端的流出口，使柱内凝胶面上的缓冲液缓慢下降到与凝胶面平齐，关闭出口。上的缓冲液缓慢下降到与凝胶面平齐，关闭出口。滴加透析样品滴加透析样品 吸管吸吸管吸1mL1mL样品加到色谱柱的顶端，滴加样品时，样品加到色谱柱的顶端，滴加样品时，吸吸管管口贴着管壁环绕移动加样，同时注意不要破坏凝胶面。管管口贴着管壁环绕移动加样，同时注意不要破坏凝胶面。实验操作实验操作 （二）凝胶色谱操作（二）凝胶色谱操作样品渗入凝胶床样品渗入凝胶床 加样后

17、，加样后，打开下端出口，使样品渗入凝胶床内。打开下端出口，使样品渗入凝胶床内。等样等样品完全进入凝胶层后，关闭下端出口。品完全进入凝胶层后，关闭下端出口。洗脱洗脱 小心加入物质的量浓度为小心加入物质的量浓度为20 mmol20 mmolL L的的磷酸缓冲液磷酸缓冲液(pH(pH为为7.0)7.0)到适当高度，连接缓冲液洗脱瓶，打开下端出到适当高度，连接缓冲液洗脱瓶，打开下端出口，进行洗脱。口，进行洗脱。实验操作实验操作 （二）凝胶色谱操作（二）凝胶色谱操作收集：收集： 待待红色的蛋白质红色的蛋白质接近色谱柱底端时，用试管收集流出接近色谱柱底端时，用试管收集流出液，每液，每5ml5ml一试管，连

18、续收集。（一试管，连续收集。（在分离过程中，如果红在分离过程中，如果红色区带均匀一致的移动，说明色谱柱制作成功色区带均匀一致的移动，说明色谱柱制作成功）。）。答：让血红蛋白处在稳定的答：让血红蛋白处在稳定的pHpH范围内，维持结构和功能。范围内，维持结构和功能。讨论：讨论： 1 1、在血红蛋白的整个过程中不断用磷酸缓冲液处、在血红蛋白的整个过程中不断用磷酸缓冲液处理的目的是什么？理的目的是什么？实验操作实验操作 （二）凝胶色谱操作（二）凝胶色谱操作讨论：讨论： 血红蛋白提取和分离的程序可分为四大步，包括：血红蛋白提取和分离的程序可分为四大步，包括：样品处理、粗分离、纯化和纯度鉴定。样品处理、粗分离、