生物制片与显微摄影技术课件zyl

1、生物制片与显微摄影技术赵艳玲2013.08学时学分：18学时，1学分 课程性质：专业必修课/ 任选课适用专业：生物技术专业 课程内容：讲解植物显微技术的原理和方法，并最终使学生掌握植物石蜡制片的方法及其各个环节的原理和技术要点。 课程安排：课程安排： 概述讲授1次， 3个学时，了解植物显微制片技术的基本方法、程序和基本原理。其余时间分为5次实验，共计15学时，系统学习石蜡切片的制片技术，在实验中熟悉、巩固和扩展生物制片的基本理论和技能。所以本课程是以实验为主的课程。 讲课内容和学时安排：实验第实验第次次授课或实验题目授课或实验题目主要实验内容主要实验内容课时课时数数理论概述理论概述生物显微制片

2、与摄影概述、石蜡生物显微制片与摄影概述、石蜡切片制作程序、原理；切片制作程序、原理；3 31 1配制固定液等试配制固定液等试剂、取材、固定剂、取材、固定清洗容器、配制固定液、各级度清洗容器、配制固定液、各级度脱水剂、透明剂、取材、固定材脱水剂、透明剂、取材、固定材料、脱酸；料、脱酸；3 32 2脱水渗蜡观摩、脱水渗蜡观摩、包埋包埋脱水渗蜡观摩、包埋、清洗载玻脱水渗蜡观摩、包埋、清洗载玻片和盖玻片、配制粘片剂；片和盖玻片、配制粘片剂；3 33 3切片、贴片切片、贴片修整蜡块、切片、贴片；修整蜡块、切片、贴片；3 34 4苏木精染色、封苏木精染色、封片片染色及相关程序、封片、贴标签染色及相关程序、

3、封片、贴标签3 35 5番红番红-固绿染色、固绿染色、封片和显微摄影封片和显微摄影脱水、对染、封片等相关程序、脱水、对染、封片等相关程序、贴标签、显微摄影贴标签、显微摄影3 3实验分组：实验分组：实验中每八至十人组成为一个实验小组。每个实验小组从取材料开始，完成石蜡制片的全过程。如脱水、透明、浸蜡、包埋等环节是全天连续而不能间断的过程，需要实验小组的几个同学轮班完成。每个同学必需了解和掌握各个环节的工作技能。 实验要求：实验要求：要求每个小组制作合格的石蜡制片不少于20片。每人独立完成实验报告和实验记录，并且独立完成制作切片不少于2片。 成绩评定办法：成绩由五个部分构成 出勤占20% 。但实验

4、课旷课缺勤一次，扣20分，请假一次扣10分，迟到、早退、未完成预定工作适当扣分。平时工作及实验的卫生整理情况10%。实验报告占20%实验记录20%1.制片数量和质量占30%第一章 绪论一、生物制片的目的 把想要观察的材料制作成适合于在显微镜下观察的薄片，以显示其组织和细胞的结构。 二、生物制片的类型 显微制片法一般包括切片法、整体封片法、涂片法和压片法4大类。 （一）临时制片（一）临时制片 （二）永久制片（二）永久制片（一）临时制片（一）临时制片 多数用于活体制片观察（一种临时制片）。 将生物个体或一部分置于载玻片上，加水和盖玻片进行观察。包括：徒手切片、装片、涂片、解离压片等临时制片。（在植

5、物形态解剖学实验等课程已经讲授，详细过程不再赘述）优点：简单、省时，能进行活体观察；缺点：常因组织过厚光线不易透过，活体材料多为无色，未染色观察效果差，不易长期保存。 （二）永久制片（二）永久制片 1.切片法切片法 光学显微镜的切片厚度在 225微米之间，一般动植物材料的切片以厚10微米左右为合适。 用锋利的刀片将材料切成薄片，便于在显微镜下观察。为了能够切出薄而且完整的切片，对幼嫩的材料（如，幼嫩的根尖、茎尖、叶片等）必须进行包埋，对坚硬的材料（如木材、竹材）必须进行软化而不用包埋。切片法在生物制片技术中最为重要。 切片法分为：（1）徒手切片法 （不用包埋，徒手切片）（2）石蜡切片法 （见后

6、面详述） （3）火棉胶切片法 （4）冰冻切片法 （5）木材切片法（3）火棉胶切片法）火棉胶切片法 u把生物材料经火棉胶包埋后用滑动切片机切片。适用于特别坚硬的材料，或特别柔软而体积大的材料（如完整的大脑）。由于过程复杂，已经较少应用。u 火棉胶是一种硝化纤维素，易燃烧。火棉胶可以购买（火棉胶片或火棉胶乙醚或纯酒精液），也可以自制。 自制火棉胶：将照相的底片除去药膜，溶于等量的乙醚或纯酒精中，配制成不同浓度的火棉胶液。 u 制片原理：材料经过固定、脱水，火棉胶液浸泡，火棉胶包埋，滑动切片机切片，脱胶，染色，脱水，透明封片。 （4）冰冻切片法 特别适用于水分多，柔软，而且容易收缩的材料，如动物组织

7、，用滑动切片机或旋转切片机，配上制冷装置。 半自动冷冻切片机（jx4352525）（5）木材切片法）木材切片法（滑走切片法、软化切片法）该法适用于坚硬的木材、竹材、骨质的切片。 材料需要软化，常用的软化剂和软化法有： 甘油酒精法 氢氟酸法 醋酸纤维素法 石炭酸软化法 冰醋酸：双氧水（1：2）法 2.非切片法（不用刀）非切片法（不用刀）（1）离析法 （2）涂片法 （3）压片法 （4）整体封固法 （5）透明法（1）离析法 离析液种类很多，最常用的有： 铬酸-硝酸离析液 硝酸-氯化钾离析液 盐酸草酸氨离析液 氨水离析法 氯化钾（0.01M）或氯化镁（0.01M）离析法氢氧化钾（或氢氧化钠）离析法（2

8、）涂片法）涂片法 适用于单细胞生物或小型的群体藻类、组织疏松或易于分离的植物组织，如花粉囊中的花粉母细胞或花粉粒，根瘤组织、动物的血液等。将生物组织的少许置于载玻片上，涂成薄层后再经不同处理而作成制片，或再用另一片载玻片盖在上面用力压碎。 （3）压片法压片法 将生物组织的一部分置于载玻片上，并隔着盖玻片将其压散开来，而作成制片。 主要用于根尖、茎尖等解离材料的压片，染色体观察。与染色体涂抹法的区别是先把材料固定、软化和染色，再进行压片。 （4）整体封固法）整体封固法 将细小或扁平的材料经过染色等处理后，把整个材料用封固剂封起来作成制片。 如苔藓植物的叶子、丝状体和膜状体的藻类、扁形动物涡虫、昆

9、虫的鳞翅、荠菜的小花蕾等均可采用此法制片观察。 （5）透明法）透明法 用化学药剂处理，使组织变得透明而做成制片，例如将叶片处理，显示叶脉。 常用透明的方法乳酸石炭酸透明法 乳酸石炭酸液配制：石炭酸（结晶）10g，蒸馏水、乳酸、甘油各10毫升混合。 适用于小的材料的透明观察：材料放于载玻片上，加一滴乳酸石炭酸液，在酒精灯上来回移动加热，冷却后材料变为透明，再整体封片。 氢氧化钠透明法 氢氧化钠液配制：210氢氧化钠水溶液（通常为5），或者210氢氧化钠水溶液50酒精。 溶液的量大于材料体积的3050倍。 材料放于氢氧化钠溶液中24小时左右，细胞内的物质被溶解，所以材料变的透明。 第二章 石蜡制片

10、 第一节第一节 石蜡切片的应用范围石蜡切片的应用范围 制片的方法虽然很多，但是其基本点就是要求尽量保持原来的结构，切成适当的厚度，应用各种染色方法使内部各种结构清晰易见，使材料保持长久，不变形、不腿色。 石蜡制片的优点是一般的材料都适用、切片薄、能切成连续的蜡带，可以观察到细胞和组织结构的连续变化过程，这是其他方法所不及的。 缺点是制片过程复杂，不适合制作比较坚硬的材料，如木材切片、竹材切片等等。 第二节第二节 石蜡切片的步骤和原理石蜡切片的步骤和原理 石蜡切片包括：选材（取材）杀死、固定和保存冲洗和脱水透明浸蜡和包埋切片贴片染色封片等9个大步骤。下面依次介绍。 一、选材一、选材 根据所要观察

11、的对象和目的进行选材。通常选材时要考虑到以下几方面因素： 种类、 部位、 年龄或发育阶段、今后是观察横切面还是纵切面。取材时一般的要求是新鲜、健康、正常、有代表性，一般大小不超过1厘米，在能满足观察的前提下越小越好，以便能使固定液迅速进入组织、杀死细胞和便于切片。 最好先通过徒手切片在显微镜下观察，以便做到对目的部位心中有数，更准确地取材。 切割材料时，刀要锋利，用力要均匀，避免组织被挤压、撕裂等破裂，影响制片效果。 二、杀死、固定和保存二、杀死、固定和保存 （一）杀死和固定（一）杀死和固定 用物理的或化学的方法将生物材料迅速杀死、使蛋白质变性和凝固，达到保持生活细胞的形状和内部结构的目的，即

12、保持生活时的自然状态。固定要求是越快越好。 物理固定法物理固定法常用冷冻处理或火焰烘烤。 化学固定法化学固定法，主要是把生物材料迅速浸泡在固定剂中。固定剂常常是含有几种化合物的混合液，既有强烈凝固蛋白质的化合物，也有非凝固性的化合物，它们对蛋白质起交联和稳定作用，即所谓“鞣化作用”。 固定时要注意的事项：固定时要注意的事项： （1）固定液的用量要达到材料体积的5-20倍，否则，材料中的水分稀释固定剂的浓度， 降低固定效果。 （2）固定时要对材料进行真空抽气。组织、细胞中都有空气，会阻止固定剂渗透到组织中，使固定不全面和不彻底，影响后续的浸蜡、切片等等。抽气最好用抽气泵抽气，简易的可以用注射器针

13、筒抽气。 （二）保存（二）保存 材料经过固定后，需要保存下来以备利用，这一过程中，要求材料的结构不会发生变化。可以使一般的材料保存较长的时间而不至于变坏。保存时，通常还要求在冰箱中存放。 有些杀死剂和固定剂本身就是良好的保存剂，有些则不然。 塑料药瓶（三）好的固定剂的特点 1.渗透力强 迅速杀死原生质，并显示出其原来的细微结构； 2.增加细胞结构及内含物的折光程度，使各部结构更为清晰，有利于显微镜观察； 3.使组织适当地变硬，并具有一定的坚韧性，便于切片。但又不能过于坚硬或变为松脆，反而不利于切片； 4.促进生物组织对某些染色剂的媒染作用，能使组织增加染色能力； 5.使组织或细胞不发生收缩和膨

14、胀； 6.有良好的保存作用，使材料固定后能经久不坏。 （四）主要的固定剂及其性质（四）主要的固定剂及其性质1. 纯酒精纯酒精优点：渗透力强，有脱水作用 缺点：原生质收缩注意要点：单独用时，时间要短，几分钟到1小时足够。 酒精是还原剂，易被氧化成乙醛和乙酸，不宜与铬酸、重铬酸钾或锇酸等配合。能与甲醛、冰醋酸、丙酸等配合使组织中的蛋白质发生不溶性沉淀，使核酸发生可溶性沉淀，还可以溶解脂类物质，不适宜用于这一类材料的固定 2. 95%酒精酒精优点：材料固定后无需冲洗就可以脱水，使用简便 缺点：原生质收缩，但仍然能保持细胞壁的形状 注意要点：单独用时，时间十几分钟到1-2小时足够。固定时间长，材料变脆

15、、易折断，难以切片； 适宜制作无需保存细胞内含物的切片。3.甲醛甲醛(Formalin),HCOH福尔马林福尔马林 优点：市面出售为饱和液，浓度为40%，又称福尔马林，是很好的硬化剂， 缺点：材料易收缩。渗透力慢。与酒精混合，可以阻止材料过于坚硬注意要点：单独用时，浓度一般为5-10%。是强还原剂，易氧化为蚁酸，故不能与洛酸或锇酸等配合。 甲醛储存过久会变成蚁醛酸，可加入5%的吡啶中和。9.冰醋酸冰醋酸(glacial acetic acid) H3COOH 优点：渗透力强而快，能溶解脂肪，可保存蛋白质不变质，是染色体很好的保存剂 。缺点：组织发胀，可阻止酒精、甲醛等引起的收缩 注意要点：通常

16、以1-5%的浓度作固定剂4.铬酸（铬酸（cronic acid）H2CrO4优点：固定蛋白质、核蛋白、核酸等产生良好的不溶性沉淀。它对脂肪和拟脂类没有作用。生物制片中使用广泛，尤其在细胞学制片中不可缺少，是许多固定剂的基本成分。缺点：缺点是组织易收缩，渗透力弱，而且组织易过度硬化。 一般以0.5-1%水溶液用，用量要多，固定后用水彻底冲洗干净。 5.苦味酸（三硝基苯酚）苦味酸（三硝基苯酚）（picric acid）C6H2(NO2)3OH优点：常用其饱和水溶液(溶解度0.9-1.4%)固定，使蛋白质、核蛋白、核酸沉淀，对于胚囊自由核时期的固定效果很好，还可以阻止过度硬化和增进染色效果 缺点：渗

17、透力强，但组织收缩强，注意要点：很少单独使用；苦味酸是易爆品，如果单纯备以制片，保存苦味酸时，要适当加入水分，密封，防晒、防震，否则有爆炸的危险。6.锇酸锇酸OsO4（osmic acid） 优点：能良好固定细胞的细微构造，是脂肪类的唯一固定剂。是细胞学研究的最好固定剂，在电镜的超薄切片中作为主要的固定剂。材料经此固定后，能防止用酒精脱水时产生沉淀。缺点：是目前最昂贵最好的固定剂。渗透力很弱，因而往往材料外部已经固定过度，而内部还未完全固定，所以材料越小越好。 7.重铬酸鉀重铬酸鉀K2Cr7O7(potassiumdichromate) 优点：强烈硬化剂，但是渗透力很弱，所以材料越小越好。缺点

18、：强烈的氧化剂，不能与甲醛、酒精混合。很少单独使用。 注意要点：因配合物不同，具有不同的效果。与酸性液体混合时，在PH4.2以下，可以固定染色体，但不能固定线立体。PH5.2以上，可以溶解染色体，但是细胞质则保持得均匀一致，尤其固定线立体效果好。配置成1-3%水溶液使用，其饱和水溶液浓度约9%。 8.氯化汞氯化汞HgCl2（升汞）（升汞）(mercuric chloride) 优点：作用快，渗透力强，固定蛋白质，不足是细胞易收缩 。缺点：升汞留于细胞中会形成结晶，所以用升汞固定的材料一定要及时切片或处理。注意要点：用其固定的材料不能久留，要及时包埋，以免材料经久会变坏。要清洗干净。剧毒 。（五

19、）混合固定剂（五）混合固定剂 实际使用中几乎都是用混合固定剂，使单一固定剂的缺点得到弥补，如能使细胞收缩的试剂要与能使细胞膨胀的试剂配合使用等等。强氧化剂与强还原剂也不能同时配制在一起，如果需要混合使用，也要分开配制，用时再混合。 .产生酸性固定相的固定液产生酸性固定相的固定液 这类固定剂产生的固定相完全呈酸性反应，对染色质和核仁具有良好的固定，但是细胞内含物被溶解。植物制片中应用的固定剂大多数属于这类固定剂。 （1）酒精）酒精-甲醛固定剂甲醛固定剂 70%酒精100ml+甲醛10-20ml 用于固定一般生物组织，不发生收缩，效果很好。尤其用于在柱头上萌发的花粉管的固定。染色质和核仁固定良好，

20、内含物被溶解。固定的时间通常为24小时，也可以作保存剂。甲醛的用量可视材料而定。 （2）F.A.A.固定剂固定剂（酒精-甲醛Formalin-冰醋酸glacial acetic acid固定剂） 配方： 50%-70%酒精 90ml + 冰醋酸5ml + 甲醛（40%）5ml 使用方便、效果较好、应用也最广。可以固定一般植物材料和昆虫、甲壳类动物。又是良好的保存液。固定时间几个小时以上。 不适宜细胞学和藻类学用途的固定，因为酒精可以溶解脂类及使原生质收缩。 保存时，在上述的配方中按体积的5%加入甘油（体积比）能防止液体蒸发和材料变硬，保存效果更佳。 经过FAA固定的材料，用50-70%的酒精换

21、洗2次就可以进行脱水。 （3）酒精）酒精-醋酸固定液醋酸固定液 (卡卡诺（诺（carnoy）固定液）固定液)： 甲液：纯酒精 15ml + 冰醋酸5ml 现用现配，不能久放 乙液：纯酒精 30ml + 冰醋酸5ml + 氯仿15ml 现用现配，不能久放 可以甲液、乙液等量混合使用，但是使用时现配现混合。 渗透力强，只需要20分钟至3小时，时间太久则材料受到破坏，材料膨胀、发粘。固定毕，需要用纯酒精洗涤2-3次，直至材料不含冰醋酸及氯仿的气味为止。 2. 产生碱性固定相的固定液产生碱性固定相的固定液 这类固定液产生的固定相完全为碱性反应，所有的染色质均可以溶解，该类固定液适合线粒体和液泡线粒体和

22、液泡等的固定。产生碱性固定相的固定液主要有以下两种产生碱性固定相的固定液主要有以下两种： （1）齐欧氏液）齐欧氏液（Zirkle-Erliki） 重铬酸氨1.25克+硫酸铜1克+蒸馏水200毫升 （2）齐氏还原铬酸液）齐氏还原铬酸液 硫酸铬5克+ 氧化铜 稍过量（即饱和并稍过量）+ 甲醛 1050毫升 + 蒸馏水5090毫升（最后使溶液总量为100毫升） 三、冲洗与脱水三、冲洗与脱水 （一）冲洗的意义 材料经固定后，在进行下一步或将材料保存起来前，一般都要把材料冲洗干净，作用是让冲洗液渗透到材料中，把固定液彻底替换出来。 常用的冲洗液是蒸馏水或一定浓度的酒精。一般水溶性的固定液用水来冲洗，酒精

23、溶液的固定液用同浓度的酒精来冲洗。 （二）冲洗的方法 1.一般材料在试管或试剂瓶中更换数次（倾倒或用吸管吸出），每次1-2小时即可。 2.某些难洗净的材料用流水冲洗一定时间。 指管和胶塞（三）脱水的作用（三）脱水的作用 脱水就是把材料浸泡到能够与水分混溶的药剂中，使材料中的水分逐步（逐级）被吸出，最后全部被代替干净，有两个作用： 1.使材料变硬，形状更加稳定。 2.除净材料中的水分，才能使包埋剂和封固剂渗透到组织中。因为通常的包埋剂和封固剂都不能与水混合，把水除净才能进行包埋和封固。 务必注意：脱水剂的浓度要分为多级从低到高逐级进行。 （四）常用的脱水剂（四）常用的脱水剂 脱水剂应该具备2个特

24、点： 第一，必须是亲水性的，能与水成任何比例的混溶； 第二，必须能与其他有机溶剂（透明剂）互相混合和取代。 常用的脱水剂有以下几种： 酒精酒精、氧化二乙烯、正丁醇、叔丁醇、丙酮、甘油、氧化二乙烯、正丁醇、叔丁醇、丙酮、甘油、酒精酒精：是最广泛的脱水剂，主要是价格较低，方法易掌握。不足之处是易引起组织收缩或硬化，不利于切片（尤其是纯酒精脱水，时间要短）。氧化二乙烯氧化二乙烯：可以和水、酒精及油类混合，优点是具有脱水和透明的作用，也不会使组织硬化和收缩，经过30%-70%-90%-100%各级，就可以进行浸蜡。缺点是它的比重比较溶化的石蜡重，所以在包埋前要务必除掉之，一般是用一次二甲苯或氯仿，然后

25、再浸蜡，就可以避免上述的缺点。另外，挥发性大，易燃，多吸入它的气体对人体有害。 正丁醇正丁醇：通常与酒精合成一定的比例使用，到最后才经过100%的正丁醇，优点是具有脱水和透明的作用，用它脱水后不必经过透明就可以浸蜡，使手续简化。 叔丁醇叔丁醇：可与水、酒精、二甲苯等混合。可单独或与酒精混合使用。优点是不会使组织收缩和变硬，也不必再透明，而且比溶化的石蜡轻，所以在包埋时很容易被从组织中除去。此法可以简化脱水、透明等过程，已经逐渐替代了酒精。但是价格比酒精贵3倍。 丙酮丙酮：可以代替酒精，脱水作用比一般的要快，但是不能溶解石蜡，所以仍需经过二甲苯或其他透明剂，才能进行浸蜡和包埋。 甘油甘油：较少用

26、。 四、透明四、透明 材料脱水之后，一般要经过一种既能与脱水剂又能与包埋剂（石蜡、火棉胶）相混合的溶剂来处理，以便于包埋剂渗入到组织中。由于这种溶剂能使材料透明，因此这个过程称为“透明”。 在制片中除了应用一些既能脱水又能透明的脱水剂（氧化二乙烯、正丁醇、叔丁醇等）外，一般用酒精脱水的材料，都要经过透明。常用的透明剂有下列几种： 二甲苯、氯仿、甲苯、苯、丁香油1二甲苯：是应用最广的透明剂，作用迅速，能溶解石蜡、加拿大树胶。缺点是易使材料收缩变脆。使用时，材料必须彻底脱尽水分，否则发生乳状浑浊。 为了避免材料收缩，采取逐步从纯酒精中过渡到二甲苯中，如 纯酒精2/3纯酒精+1/3二甲苯1/2纯酒精

27、+1/2二甲苯1/3纯酒精+2/3二甲苯纯二甲苯（最后的时间不能过长，否则材料收缩和变脆） 2氯仿氯仿：火棉胶的制片都采用氯仿作透明剂，也可应用于石蜡法中。挥发性比二甲苯快，渗透力较挥发性比二甲苯快，渗透力较弱，使材料的收缩性也小弱，使材料的收缩性也小。氯仿能破坏染色，所以不能对已经染色的切片进行透明（不能用于封片前的透明）。3甲苯甲苯：性能与二甲苯相同，价格较便宜，可作二甲苯的代用品。 4苯苯：性能与二甲苯相似，可作二甲苯的代用品。 5丁香油丁香油（clove oil）：切片染色后，在封固前最好的透明剂。固绿、桔红G等可以溶解于丁香油中成饱和剂，待染色到最后一步时，可以作为染色、分色、透明的

28、综合溶剂，效果较好。但是经过丁香油透明后的制片，还需要在二甲苯中处理，将组织中的残油除净，否则制片混暗不清。还有，丁香油挥发很慢，如果不经过二甲苯处理，制片封片后不易干固。注意：丁香油价格昂贵，要节约使用。 五、浸透（透蜡）和包埋五、浸透（透蜡）和包埋 （一）石蜡浸透法 材料完全透明以后，就要浸蜡。浸蜡的目的在于用融化的石蜡（或火棉胶）代替材料中的透明剂。最重要的是使融化的石蜡完全浸入到细胞的每个部分，并使石蜡紧密地贴在细胞壁的内外，成为不可分离的状态，这样切片时材料才不会切坏。 注意：这是最重要的一步，如果透蜡不彻底，材料中有空洞，切片时会使材料切坏。 浸蜡一般要从低温至高温，从低浓度到高浓

29、度，使石蜡慢慢渗入组织内，将透明剂替代出来。操之过急，则石蜡浸入不彻底，影响切片。 浸蜡的步骤： 低熔点碎石蜡少许溶化在有材料的透明剂中（36-40度恒温箱中微加热），溶化后不断加入碎石蜡直至达到1/2透明剂:1/2石蜡（体积比）为止（每次加蜡后都将透明剂瓶盖上，以免透明剂过渡蒸发）。几小时后，移入58-60度的温箱中，打开瓶塞让透明剂蒸发（几小时）。之后，将材料移入装有溶化石蜡的小杯中（换容器的目的是便于下一步操作）换上高熔点蜡液（仍然在58-60度温箱中），数小时后换纯蜡一次，至数小时后材料完全被石蜡浸透（通常换三次），透明剂也已被石蜡完全替代。数显组织自动脱水机恒温箱（二）包埋 包埋就是

30、将完成渗透蜡的材料移至包埋剂（石蜡）中，以便切片。 生物组织包埋机六、切片 （一）修蜡块和粘蜡块 1修蜡块 用锋利的单面刀片将包有材料的蜡块小心地切削成规则的形状，最好为梯形或方块形，要求：蜡块不能有裂缝或裂纹，蜡块中的材料要在蜡块的中央，绝对不能使材料直接露出来。 2125轮转切片机莱卡2235切片机2粘蜡块 （焊蜡块）准备好若干载蜡器（台木 约122 cm3的小木块，事先用废蜡浸泡一周左右），废弃的手术刀或或单面刀片，用果刀亦可，点燃酒精灯； 先将碎石蜡熔化在台木的一端； 在酒精灯上加热的小铁片或废弃的手术刀的帮助下，将修理好的蜡块的一端牢固地粘连在小木块上。 要求：蜡块要端正地粘连在小木

31、块上，粘连越牢固越好。 （二）切片将蜡块切成很薄的片石蜡切片用切片机切可以形成蜡带。 七、展片和粘片（贴片）七、展片和粘片（贴片） 这是同时进行和完成的两个步骤。 切片经过镜检可用后，就要用粘贴剂将具有目的材料的蜡片粘贴在载玻片上，并要使材料在后续的溶蜡、染色、脱水等过程中都不会从载玻片上脱落下来。 粘片和展片的方法常用的有两种：烤片贴片法水浴（用水浴锅或摊片机）展片法烘片机和烤片台生物组织摊烤片机晾片板晾片板切片盒常用的粘贴剂有以下几种： 明胶粘贴剂 火棉胶粘贴剂 蛋白粘贴剂 明胶粘贴剂明胶粘贴剂（Haupt affixative，郝伯特粘贴剂） 使用最为广泛 配方：明胶（粉状）1g + 蒸

32、馏水100ml（36）（明胶溶化后）+石炭酸（结晶）2g + 甘油15ml（溶化），最后用滤纸过滤。 火棉胶粘贴剂 火棉胶1-2g溶解在纯酒精和乙醚各半的混合液中，即为火棉胶粘贴剂。 较厚的材料(如木材切片、种子切片等等)，如果只用普通的粘贴剂贴片，往往容易脱落。可以在上述操作的基础上（干后），再用1-2%的火棉胶粘贴剂滴在材料上，并使之干燥。染色时，可用石炭酸：二甲苯（1：4）除去石蜡，再置入95%的酒精，顺次进行染色。 蛋白粘贴剂（梅耶尔氏粘片剂）蛋白粘贴剂（梅耶尔氏粘片剂） 新鲜鸡蛋青25ml + 甘油25ml + 石炭酸0.5g（为防腐剂） 配制：鸡蛋打孔，倒出蛋青，加入甘油和防腐剂，

33、用力摇动，产生很多泡沫，静止片刻，使泡沫上升到液面，倒去泡沫或用纱布过滤，即可。 此剂在动物上应用更广，在植物上效果也很好。两点注意： 其一，粘性比明胶弱； 其二，配好后1-2个月内易失效，所以一般是每次实验临时配。 八、染色八、染色 染色是为了使不同的细胞结构或组织表现出明显的区别，更好地弄清楚它们的结构。 九、九、脱水脱水十、十、透明透明十一、十一、封藏封藏十二、贴标签十二、贴标签 染色之前首先要进行脱蜡、复水，染色之后还需有分色、冲洗等相关步骤，染色之后再经脱水、透明，最后封藏及完成制片。 下面以番红番红-固绿对染法固绿对染法和海登汉氏苏木精海登汉氏苏木精染色法染色法的全部流程来说明以上

34、几个过程：卧式染色缸染色架染色架二甲苯10分种以上二甲苯10分种以上1/3二甲苯+ 2/3无水乙醇5-10分钟2/3二甲苯+ 1/3无水乙醇5-10分钟无水乙醇5分种无水乙醇5分种95%乙醇5-10分钟85%乙醇5-10分钟70%乙醇5-10分钟50%乙醇5-1分钟30%乙醇5-10分钟海氏苏木精染色约15-30分钟自来水流水冲洗或浸泡冲洗几遍约15分钟左右3%硫酸铁铵水液媒染3分钟左右媒染和染色媒染和染色脱蜡脱蜡复水复水海登汉氏苏木精染色流程海登汉氏苏木精染色流程自来水流水冲洗或浸泡冲洗几遍约10分钟饱和苦味酸液分色5分钟左右自来水流水冲洗几遍或少加1-几滴氨水浸泡约10分钟，镜检细胞质呈天

35、蓝色即可30%乙醇5-10分钟50%乙醇5-1分钟70%乙醇5-10分钟85%乙醇5-10分钟95%乙醇5-10分钟无水乙醇5分种无水乙醇5分种1/3二甲苯+ 2/3无水乙醇5-10分钟2/3二甲苯+ 1/3无水乙醇5-10分钟二甲苯10分种以上二甲苯10分种以上封藏封藏冲洗、分色冲洗、分色脱水脱水透明透明二甲苯5分种以上二甲苯10分种以上二甲苯10分种以上1/3二甲苯+ 2/3无水乙醇5-10分钟2/3二甲苯+ 1/3无水乙醇5-10分钟无水乙醇3-5分种无水乙醇3-5分种95%乙醇3-10分钟85%乙醇3-10分钟70%乙醇3-10分钟50%乙醇3-10分钟30%乙醇5-10分钟1g固绿+

36、95%酒精100毫升对染 0.5-1分钟1%番红50%乙醇2-24小时1%番红水液2-24小时脱蜡脱蜡染色染色脱水和对染（返脱水和对染（返回）回） 透明（返回）透明（返回）封藏封藏番红番红-固绿对染流程固绿对染流程下行流程返回流程复水复水全自动生物组织脱水机LS-3050B（三）染色剂的种类（三）染色剂的种类 1根据化学性质分根据化学性质分：依据染料的主要有色部分是正离子或负离子，或正负离子都有来区分。染料的酸碱类型与染料溶液的酸碱反应无直接关系 （）碱性染料（）碱性染料：主要有色部分是正离子，具有一种有色的有机盐基，能与无色的醋酸盐、氯化盐、硫酸根等结合，一般溶于水或酒精，如番红、苏木精。

37、（）酸性染料（）酸性染料：主要有色部分是负离子，具有钠或钾的金属基，能与一种有色的有机酸根结合，溶于水和酒精，如，固绿、曙红。 （）中性染料（）中性染料：正、负离子都有色，由碱性染料和酸性染料结合而成，也称复合染料。其正离子和负离子都有一个发色团。溶于水和酒精，如，吉姆萨。 2根据对生物组织着色情况分：根据对生物组织着色情况分： （1）组织染料）组织染料：能够使植物组织染色 （2）细胞染料）细胞染料： 细胞质染料：能使细胞质染色 细胞核染料：能使细胞核染色 3根据染色剂的来源分根据染色剂的来源分 （1）天然染料）天然染料 从动植物体中提取、纯化而成。 （2）合成染料（煤焦燃料）合成染料（煤焦燃料） 1）苏木精）苏木精（hematoxylin）：从苏木中提取。苏木是云实科一种植物，原产墨西哥。 苏木精结构式C16H14O6，配制好后最终成为有色可用的氧化苏木精时为C16H12O6。 优点有对细