已更新完毕植物生物技术

1、 植物生物技术 朱华国第一章 思考题1、 生物技术的概念？答：指人们以现代生命科学为基础，结合其他基础学科的科学原理，采用先进的科学技术手段，按照预先设计改造生物体或加工生物原料，为人类生产出所需产品或达某种目的。2、 农业生物技术包括哪些内容？细胞工程、基因工程、酶工程、发酵工程、蛋白质工程3、 谈谈目前农业生物技术的应用情况？农业生物技术应用包括三个方面： (一)植物组织培养（细胞工程）1、种苗脱毒 茎尖培养可以得到无病毒苗木，已成为解决病毒病危害和品种退化问题的一个重要途径。兰花、草莓、柑橘、土豆等； 脱毒方法： 物理脱毒方法: 热处理 生物脱毒方法：茎尖培养；愈伤组织培养；微体嫁接离体

2、培养；珠心组织培养； 化学脱毒方法：在组织培养过程中加入化学物质（三氮唑核苷等） 综合脱毒方法：比如热处理与茎尖培养结合等； 2、快速繁殖 操作过程 1. 无菌培养物的建立； 2. 茎芽的增殖； 3. 离体枝条的生根； 4. 植株的移栽； 4、 细胞工程育种 （1） 利用培养变异，筛选优良突变体 （2） 利用远缘杂交幼胚培养，获得杂种植株，克服其杂交不亲和性 （3）利用细胞融合技术，克服远缘杂交不亲和性 （4）倍性育种，缩短育种年限 4、离体种质保存 利用组织培养法，低温保存（196）或试管保存，为保存和抢救濒临灭绝的生物带来希望。 5、细胞培养生产有用物质（生物制品） 利用细胞培养生产次生物

3、质，如药物、色素、食品添加剂、酶、农药等。 （2） 基因工程方面 1、植物种子品质改良 2、抗虫、抗除草剂作物育种 3、 生物能源生产 4、转基因植物生产疫苗或治疗蛋白 5、利用秸杆喂养动物发展养殖业 6、遗传转化与酿酒工业 7、遗传转化与花卉工业 （三）分子标记辅助育种 4、 生物技术的发展历程中重要事件，包括细胞工程和基因工程两个方面的（选几条回答）A、探索阶段（1902-1929） 1902年，德国植物学家Haberlandt提出了高等植物的器官和组织可以不断分割，直至分到单个细胞的观点。他认为，如果每个细胞都有植物个体一样的性质和能力，那么可以通过植物细胞培养，把单个细胞培养成一个新个

4、体。 在此思想指导下，许多科学家从事组织培养研究. 1904年，德国植物胚胎学家Hanning 用萝卜和辣根的胚进行离体培养，提早长成了小植株，首次获得胚培养成功。 1922年，Knudson 对兰花幼胚进行培养获得幼苗，克服了兰花种子发芽难的困难。 1922，Kotte和Robbins对豌豆、玉米、棉花等的茎尖、根尖进行了离体培养。发现了培养的分生组织只能进行有限的生长 1925年，Laibach 进行亚麻种间杂种幼胚培养，成功地得到了杂种植物。证明了胚培养在植物远源杂交中利用的可能性 B、培养技术建立阶段（1930-1959） 1934年，White 等用番茄根尖的组织培养，建立了第一个活

5、跃生长的无性繁殖系。1934年，Gautheret 培养山毛柳、黑杨的形成层组织，获得愈伤组织形成。 1937年，White 和Went 等分别发现B族维生素和吲哚乙酸（IAA）对培养的离体根生长具有重要作用。 1937-1938年，Gautheret 在1934年培养山毛柳、黑杨成功获得愈伤组织的基础上，在培养柳树的培养基中，加入IAA 和B族维生素等，使形成层的生长大为增加。 1937-1938年，Nobecourt 培养胡萝卜根和马铃薯的块茎薄壁组织，获得愈伤组织。将愈伤组织置于琼脂培养基上继续培养，可无限发生细胞增殖，形成愈伤组织。首次从液泡化的薄壁细胞建立愈伤组织培养物。 40年代末

6、开始，进行从脱分化细胞组织培养进入探讨器官再分化的研究。 脱分化：离体培养条件下，一个已分化的细胞回复到原始无分化状态或分生组织细胞状态或胚性细胞的状态的过程就是细胞脱分化 再分化：脱分化后的分生细胞（愈伤组织）在特定的条件（离体培养）下，重新恢复细胞分化能力，并经历器官发生形成单极性的芽或根，或经历胚胎发生形成双极性的胚状体，进一步发育成完整生物体，这一过程称为细胞再分化。 1957年Skoog和Miller提出了植物激素控制器官形成的概念，指出通过改变培养基中生长素和细胞分裂素的比率，可以控制器官的分化，即生长素和细胞分裂素高促进根的分化，低促进茎和芽的分化。 1958年，Steward

7、和Reinert以胡萝卜根的悬浮细胞诱导分化成完整的小植株，发现了体细胞胚，为细胞离体培养中研究形态发生机制开拓了新的领域。 C、应用研究阶段（1960- ） （1）、原生质体培养和细胞融合。 1971年，Takebe 等从烟草原生质体得到再生植株，首次获得原生质体植株再生成功。 1972年，Carlson 等通过两个烟草物种原生质体的融合，获得了第一个体细胞杂种植株。 1978年，Melchers进行了马铃薯和番茄的融合实验，获得了第一个属间杂种植株 基因工程，就是通过基因操作，将目的基因或DNA片段与合适的载体连接转入目标生物细胞，通过复制、转录、翻译外源目的基因以及蛋白质的活性表达，使转

8、基因生物获得新的遗传性状的操作。 1860至1870年奥地利学者孟德尔根据豌豆杂交实验提出遗传因子概念，并总结出孟德尔遗传定律。1909年丹麦植物学家和遗传学家约翰逊首次提出“基因”这一名词，用以表达孟德尔的遗传因子概念。1944年3位美国科学家分离出细菌的DNA（脱氧核糖核酸），并发现DNA是携带生命遗传物质的分子。1953年美国人沃森和英国人克里克通过实验提出了DNA分子的双螺旋模型。1969年科学家成功分离出第一个基因。1990年10月被誉为生命科学“阿波罗登月计划”的国际人类基因组计划启动。1998年一批科学家在美国罗克威尔组建塞莱拉遗传公司，与国际人类基因组计划展开竞争。1998年1

9、2月一种小线虫完整基因组序列的测定工作宣告完成，这是科学家第一次绘出多细胞动物的基因组图谱。1999年9月中国获准加入人类基因组计划，负责测定人类基因组全部序列的1%。中国是继美、英、日、德、法之后第6个国际人类基因组计划参与国，也是参与这一计划的惟一发展中国家。1999年12月1日国际人类基因组计划联合研究小组宣布，完整破译出人体第22对染色体的遗传密码，这是人类首次成功地完成人体染色体完整基因序列的测定。2000年4月6日美国塞莱拉公司宣布破译出一名实验者的完整遗传密码，但遭到不少科学家的质疑。2000年4月底中国科学家按照国际人类基因组计划的部署，完成了1%人类基因组的工作框架图。200

10、0年5月8日德、日等国科学家宣布，已基本完成了人体第21对染色体的测序工作。2000年6月26日科学家公布人类基因组工作草图，标志着人类在解读自身“生命之书”的路上迈出了重要一步。2000年12月14日美英等国科学家宣布绘出拟南芥基因组的完整图谱，这是人类首次全部破译出一种植物的基因序列。2001年2月12日中、美、日、德、法、英6国科学家和美国塞莱拉公司联合公布人类基因组图谱及初步分析结果。5、 农业生物技术的发展趋势如何？ 相信在不远的将来，人们可以利用克隆技术将优良的畜禽品种进行大批量的复制繁殖，人们也可以利用不同的基因片断按照自己的愿望来组合新物种用于农业生产，未来的农业生产将不仅仅局

11、限在农田牧场，大型的细菌发酵罐与藻类培养箱将把农业生产带入工厂化的时代，主要依靠动物、植物进行生产的二维农业结构，将变成动物、植物、微生物并举的三维农业生产结构。 工业技术的发展给人类带来了环境污染问题，与之类似农业生物技术的发展也可能会给人类带来新的困扰，目前人们对农业生物技术的担心主要有：各种转基因抗逆作物如抗旱作物、耐热作物的出现，能否以其强大的生存竞争力而破坏整个生态系统；一些具有抗性基因的作物如抗虫、抗除草剂作物能否通过天然杂交将其抗性基因转移到其它物种中去而造成严重的后果，如造成大量杂草也具有抗除草剂基因等等；大量抗除虫基因的使用与蔓延能否造成害虫的抗性增强；大量的目的基因及其产物

12、对人畜是否安全；大量地将人的基因向动植物中转移，是否会带来人们伦理观念的混乱，如此等等都值得人们的警惕与重视 面对农业生物技术取得的进展及可能出现的各种问题，盲目乐观或望而却步都是错误的。科技进步的确能够给人类社会带来种种麻烦，但这些问题的解决最终还要依靠科技进步，只要我们能够对各种潜在问题进行认真地研究，并制定出相应的解决对策，现代农业生物技术就一定能够为人类造福第二章 思考题1、 植物组织培养室由哪些部分构成，各有何功能？答：（1）培养基室（培养基制备、灭菌）：清洗和贮存玻璃器皿塑料器皿和其他；培养基的制备；灭菌和贮存 （2）接种室（接种、无菌操作等）:植物材料的无菌操作； （3）培养室（

13、组织、细胞的光照培养、暗培养，悬浮培养等）：可控温度、光照、温度的条件，以使对材料进行体外培养2、植物离体培养包含的哪些仪器设备？简述高温高压灭菌锅和超净工作台的使用步骤？灭菌锅：1 在外层锅内加适量的水，将需要灭菌的物品放入内层锅，盖好锅盖并对称地扭紧螺旋。2 加热使锅内产生蒸气，当压力表指针达到 33.78kPa时，打开排气阀，将冷空气排出，此时压力表指针下降，当指针下降至零时，即将排气阀关好3 继续加热，锅内蒸气增加，压力表指针又上升，当锅内压力增加到所需压力时，将火力减小，按所灭菌物品的特点，使蒸气压力维持所需压力一定时间，然后将灭菌器断电或断火，让其自然冷后再慢慢打开排气阀以排除余气

14、，然后才能开盖取物超净工作台：超净工作台使用方法（放置在清洁干净的房间） 1、打开电源，调节风速（中速即可），打开紫外灯杀菌20-30分钟； 2、关闭紫外灯，打开日光灯，使用70%酒精擦拭台面；3、点燃酒精灯，放置在中央前方处，操作时在酒精灯附近进行； 4、按照实际情况放置物品（右手边放置镊子、手术刀片等常用器械），不必要物品不要放入； 5、操作时，手臂和手掌用70%酒精消毒，主要不要被酒精灯点燃； 6、外焰灼烧操作器械，待冷却后使用； 7、操作动作要轻，不要再打开的无菌物品上操作； 8、操作完后，待材料完全清理后关闭酒精灯，擦拭台面，关闭电源；2、 几种常用培养基的主要成分？哪些成分是不能通

15、过高温高压灭菌的？不同类型培养基的主要特点是什么？答：（1）主要成分：无机营养物、有机营养成分、植物生长调节物质、其他（如凝固剂） 抗生素不能通过高温高压灭菌（2）下列物品不能高温高压灭菌，否则会破坏结构而失去活性： 多糖；秋水仙素（Colchicine）；玉米素（Zeatin）；赤霉素（GA）；VB1、VB12、Vc、泛酸；抗生素（Antibiotics）；植物提取物（Plant extracts）；酶（Enzymes）（1） MS、B5培养基：适合愈伤组织的诱导和细胞培养（2） N6：多用于一些禾本科的花药培（3） WPM：一些禾本植物试管苗的培养（4） White培养基：用于生根培养4、

16、 常用的灭菌消毒方法有哪些？外植体材料如何消毒？（1）物理灭菌：高温高压灭菌、干热灭菌、射线照射灭菌、过滤灭菌 化学灭菌：熏蒸灭菌、消毒液灭菌（2）消毒前，用清水冲洗外植体表面的污染物。用滤纸吸干水分后用相应的消毒剂进行消毒处理，消毒后，用无菌蒸馏水清洗3-5次，每次至少停留3min，停留期间摇动容器，促使消毒剂脱离外植体表面。5、 生长素和细胞分裂素在植物组织培养过程中的作用？答：生长素被用于诱导细胞的分裂和根的分化；细胞分裂素促进细胞分裂、不定芽的分化和试管苗的增值。第三章 思考题1、离体快繁的概念与特点？离体快繁指植物在离体培养条件下进行无性或营养繁殖。特点：1、繁殖速率高2、培养条件可

17、以人为控制，可进行周年生产 3、占地空间小4、管理方便，利于自动化控制2、 离体快繁的发生方式有哪些？各自的特点？1、不定芽增殖 a) 不定芽：从现存的芽以外的任何器官、组织上通过器官发生重新形成的芽称之为不定芽。 b) 特点：繁殖系数高、遗传稳定性较好、继代次数有限2、腋芽增殖 腋芽进行离体培养时可不断生长，逐渐形成芽丛，反复切割和转移可不断形成新的芽丛，因此可在短时间内获得大量芽3、愈伤组织增殖 a) 愈伤组织增殖培养：即愈伤组织继代培养以扩大愈伤组织量进而分化形成更多苗。 b) 特点：成功率高，繁殖

18、系数大，但遗传稳定性较差4、体细胞胚增殖 a) 特点：增长率高；双极性免去生根环节3、 离体快繁的一般程序？（1） 无菌母株的制备（2） 不定芽增殖（3） 完整植株的形成（4） 再生植株的锻炼和移植、（5） 再生植株的鉴定第四章 思考题1、植物脱毒的方法与原理？茎尖培养脱毒：（1）在植物体内，病毒通过维管束系统移动，而分生组织中不存在维管系统。病毒通过胞间连丝在细胞间移动，但其速度很慢，难以侵入活跃生长的茎尖。（2）同一病毒在植株的不同部位分布不一致（3）茎尖越小对培养基的要求越高，成功率越低（4）越靠近生长点的部位病毒含量越低愈伤组织培养脱毒：反复继代兼热处理，经一定时间

19、后热处理过的愈伤组织转移到分化培养基中，诱导器官分化 热处理脱毒法：（1）不能杀死病毒，只能钝化病毒 高温下病毒有不稳定的特性 热空气处理：处理时间因植物而异 微体嫁接脱毒法：茎尖培养与嫁接方法结合，用以获得无病毒苗木的一种新技术，将0.1-0.2mm的接穗茎尖嫁接到由试管中培养出来的无菌实生砧上，继续进行试管培养，愈合后成为完整植株2、 植物脱毒的一般程序？1 材料准备（1）决定植物种类极品种（2）了解该植物体内所有的病毒种类及危害程度（3）决定脱除病毒的方法2 生长点分离和培养（1）从患病的植株上顶芽或腋芽（2）材料表面灭菌、决定灭菌药剂、浓度时间（3）根据病毒在寄主内分布位置决定切去茎尖

20、大小（4）接种成功率与茎形大小3 对无病毒植株鉴定：直接检查法；指示植物法；生物鉴定法4 脱毒植株的应用：研究特定病毒对寄主植株的影响3、 无病毒苗木鉴定的方法有哪些？1、 指示植物法2、抗血清鉴定法3、电子显微镜检测法4、电泳检测技术5、点免疫结合测试法五章 思考题1、植物的体细胞胚胎发生的理论基础是什么？体细胞胚胎发生： 指从体细胞进行的类胚结构的生产。体细胞胚是一个二极结构，不物理地附着于原组织，每一个体细胞胚称为胚状体，它可以同合子胚一样发育成植株2、 什么是细胞全能性？何谓脱分化？何谓再分化？继代培养？愈伤组织？细胞全能性：单个植株具有发育成为一个完整个体的能力脱分化：一个成熟细胞转

21、变为分生状态的过程再分化：已经脱分化的愈伤组织在一定条件下，再分化出胚状体，形成完整植株的过程。继代培养：愈伤组织培养一段时间后必须转移到新鲜培养基上以保持培养物的继续正常生长，更换一次培养基称继代培养愈伤组织：植物外植体脱分化，经过细胞分裂形成的一团无序生长的薄壁细胞。3、 影响愈伤组织诱导的影响因素有哪些？1、外植体2、培养基3、激素4、其他因素（碳水化合物、氮源、多胺、凝固剂、光照）4、 体细胞发生和器官发生的区别？体细胞途径（1）细胞内出现相反的两极分化，具有根端和芽端两个分生中心（2）不定芽维管组织不相连（3）具有典型的胚形态发生过程，形成的幼苗具有子叶（4）胚状体发育的苗、根和芽齐

22、全器官途径：（1）单向极性单个分生中心（2）不定芽和不定根与愈伤组织的维管相连（3）无胚胎形态，分生器官直接分化为器官，不定芽的苗无子叶（4）一般先长芽后长根或先长根后长芽5、何谓悬浮培养？它有哪些特点和用途？悬浮培养一般是指把一些小块生长旺盛的愈伤组织放入液体培养基中，进行振荡培养，使愈伤组织块变成良好分散性的细胞和小的细胞聚集体的一种培养方法。特点：愈伤组织通过悬浮培养能产生大量的比较均一的细胞，而且细胞增殖速度快。 悬浮培养的用途  1. 提供一个相对一致的细胞群体（供生化研究、胚胎发生研究、胚的同步化研究等）； 2. 能快速吸收外源物质

23、，检查药效；  3. 研究次生代谢、酶诱导、基因表达、抗生素的降解的良好实验体系；  4. 多数悬浮细胞缺乏叶绿体、色素，对酶和次生物质的分离及纯化十分有利； 5. 细胞增殖速度快，适于进行大规模培养；  6. 分离原生质体的良好细胞来源，常用于原生质体的分离；6、 体细胞胚胎发生的概念？体细胞胚胎发生一般指诱导体细胞形成胚，进而形成完整植株的过程7、 体细胞胚胎发生的方式有哪些？胚状体产生的方式可以分为以下五种： 1. 胚状体起源于外植体表面已分化的细胞； 2. 在外植体的已分化的组织中,由少数薄壁细胞转变成迅速

24、分裂的细胞,形成拟分生组织的细胞团和小块愈伤组织,由这些小块愈伤组织形成胚状体； 3. 在外植体切口表面形成大量愈伤组织,然后从愈伤组织的表面产生胚状体； 4. 在悬浮培养时,游离细胞可以生长和分裂产生细胞团,这些细胞团长大变成胚性细胞复合体,胚性细胞复合体的表面细胞可产生胚状体； 5. 在个别情况下,由单个游离细胞发育成胚状体；8、 如何调控体细胞胚胎发生？常用的有哪些方法？体细胞胚胎发生的方式有直接和间接两种。一种是从培养中的器官、组织、细胞或原生质体直接分化成胚一种是外植体先愈伤化，然后由愈伤组织细胞分化成胚第六章 思考题1、何谓原生质体？原生质体培养有哪些用途？原生质体指去掉细胞壁后的

25、单个生活细胞。用途：（1）用作细胞杂交服务于作物改良（2）用作遗传转化的对象（3）研究细胞壁的发生过程（4）筛选突变体（5）膜的结构、运输、激素接受位点等的研究（6）用于分离细胞器和大分子（7）种质资源保存 2、 原生质体分离的方法有哪些？各有什么特点？机械分离：原生质体产量低，并限于使用成熟的、能进行明显质壁分离的组织，不能从分生组织及其他幼嫩的组织分离原生质体。酶法分离：可在短时间获得大量原生质体，但是不纯的酶制剂所含杂质对原生质体可能有不同程度的毒害作用3、 酶法分离原生质体的过程？（1） 预处理：质壁分离（2）叶片表面分离（3）去表皮（4）酶解分离原生质体（5）原生质体钝化4、 原生质

26、体的培养及再生植株过程？P196原生质体：指用特殊方法脱去了植物细胞壁的、裸露的、 有生活力的原生质团。没有细胞壁，经原生质体培养的植株再生一般经过细胞壁再生，细胞分裂成细胞团、愈伤组织（或胚状体）、植株再生这几个过程。细胞壁再生：原生质体在合适条件下短时间内开始膨胀，叶绿体重排，并开始合成新的细胞壁，进而由球形变成椭圆形。细胞分裂：不同的植物细胞分裂时间不同。为了细胞能持续分裂，应注意及时添加新鲜培养液。愈伤组织：细胞不断分裂形成细胞团，并进一步形成愈伤组织。一些植物由细胞系形成胚状体。愈伤组织诱导：在合适的培养基，通过调节生长素和细胞分裂素的比例。植株再生，诱发芽和根的生成。 诱导胚状体：

27、在原生质体培养时直接诱发胚状体的生长，从而发育成完整植株。但具有活细胞的一切特征。5、 何谓体细胞杂交？有哪些应用？体细胞杂交指不同植物培养细胞的原生质体融合。应用：获得体细胞杂种和细胞质杂种，转移细胞质雄性不育性状（CMS）；转移抗低温性状；创造属间、科间杂种（如玉米、小麦融合，C4向C3转移）；转移抗病性研究双受精过程 6、 原生质体融合过程包括哪三过程？原生质体的融合、杂种细胞的选择及植株再生、体细胞杂种植株的鉴定和优良农艺性状的遗传稳定性培育7、 原生质体融合的方法有哪些？物理的，化学的？（1） 自发融合：小孢子来源的原生质体融合（2） 诱发融合：NaNO3处理（化学）、高PH-高浓度

28、高钙处理（化学）、PEG处理（化学）、电融合（物理）8、 原生质体融合的方式有哪些？对称融合、非对称融合、配子体细胞融合、亚原生质体融合原生质体融合9、体细胞杂种如何鉴定？方法：形态学、细胞学、遗传标记、染色体原位杂交技术如，杂种染色体数目、核型和染色体带型观测分析；同工酶酶谱分析第七章 思考题1、何谓单倍体？产生单倍体的途径和单倍体的应用价值？单倍体：只含一组染色体的细胞或生物体。绝大部分动、植物的配子为单倍体，配子未经结合而直接发育起来的生物也是单倍体。诱发植株产生单倍体的方法：（1）种间和属间杂交（2）物理照射和化学诱变（3）双生苗筛选（4）花药和花粉培养应用价值：1 作物育种（1）缩短

29、育种周期（2）提高了目标基因的选择效率（3）诱变育种中的应用2 物种进化研究3 遗传分析4 构建连锁图谱5 用于遗传转化2、 花药培养的概念及花药培养获得再生植株两种方式？花药培养的概念是将花药作为外植体，接种在合成培养基上，改变花粉的发育途径，使其不能形成配子，而像体细胞一样进行分裂、分化，最终发育成植株的技术。胚状体发生途径、愈伤组织发生途径3、 花药培养的操作步骤及影响因素？（1） 确定取样时期（2）预处理（3）花药表面消毒和接种培养4、 单倍体加倍如何进行及倍性鉴定的方法？加倍方法：1、自然加倍2、秋水仙素诱导3、氟乐灵 倍性鉴定的方法（1）染色体直接计数法（2）间接鉴定：流式细胞仪鉴

30、定；细胞形态学鉴定5、 花粉培养和花药培养的区别？花药培养属于器官培养，花粉培养属于细胞培养；从花药培养来源的植株中，由于药壁组织细胞分裂分化，可能出现与母株基因型一致的二倍体植株，而不是单倍体植株加倍而来的植株。在某些特殊情况下，花药培养中没有小孢子来源的植株产生。而花粉培养只能诱导产生单倍体或双倍体植株。6、 花粉培养的过程？什么叫做花粉的二型性？花粉的二型性：在花粉培养时，由于对培养条件反应不同，花粉在形态上形成两类，一类是具胚性的，花粉小，染色浅；另一类花粉大，染色深，这种现象称为花粉的二型性 7、 花粉分离和培养的方法有哪些？花粉分离法：自然释放法、 挤压法 、机械游离法 培养方法：

31、液体浅层培养、平板培养法 、看护培养法、微室悬滴培养法、条件培养法 8、 单倍体育种的技术路线？代表：花药离体培养：首先的基本原理是细胞具有全能型，运用了植物组织培养的技术。 单倍体育种：取植物的配子（花粉）培养，这里单倍体指的是细胞内的染色体数为体细胞的一半。单倍体育种的过程中需要用到秋水仙素处理正在发育的幼苗，对DNA进行加倍，使其成为纯合植株。 秋水仙素处理：秋水仙素具有抑制纺锤体形成的作用，使产生的细胞DNA含量加倍。在运用秋水仙素时，一般使用其处理正在萌发的种子或幼苗第八章 思考题1、简述转基因过程。(1）提取目的基因 从生物有机体复杂的基因组中,分离出带有目的基因的DNA片段，或者

32、人工合成目的基因，或从基因文库中提取相应的基因片段和PCR技术进行目的基因的增殖。(2)将目的基因与运载体结合 在细胞外, 将带有目的基因的DNA片段通过剪切、粘合连接到能够自我复制并具有多个选择性标记的运输载体分子（通常有质粒、T4噬菌体、动植物病毒等）上， 形成重组DNA分子。(3)将目的基因导入受体细胞 将重组DNA分子注入到受体细胞(亦称宿主细胞或寄主细胞) 。将带有重组体的细胞扩增，获得大量的细胞繁殖体。(4)目的基因的筛选 从大量的细胞繁殖群体中，通过相应的试剂筛选出具有重组DNA分子的重组细胞。(5)目的基因的表达 将得到的重组细胞，进行大量的增殖，得到相应表达的功能蛋白，表现出

33、预想的特性，达到人们的要求。2、基因、基因工程和质粒的概念。基因：编码蛋白质或RNA等具有特定功能产物的遗传信息的基本单位，是染色体或基因组的一段DNA序列(对以RNA作为遗传信息载体的RNA病毒而言则是RNA序列)。基因工程（Genetic engineering），是指利用基因工程技术的方法改造和修饰生物体，使其产生新的性状或产品，从而达到改良生物体，为人类生产服务的一种遗传学手段。质粒：细菌染色体外存在的一种能够自我复制的双链闭合环状DNA分子，其大小从1kb到200kb不等，可以自我复制和转录，在子代中保持恒定的拷贝数。3、 PCR的原理，一般反应体系构成及反应条件？原理：PCR技术的

34、基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性-退火-延伸三个基本反应步骤构成：模板DNA的变性：模板DNA经加热至93左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；引物的延伸：DNA模板-引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链重复循环变性-退火-延

35、伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板PCR反应体系： （1）DNA模板；（2）引物（引物长度15-30bp、GC含量40-60%）；专门软件设计：Primer premier 5.0（3）反应缓冲液（Tris-Cl, KCl, MgCl2）；（4）dNTPs（20-200）；（5）Taq DNA聚合酶； PCR反应过程（模拟DNA半保留复制过程）：变性（94 ） 复性（50-70 ） 延伸（72）4、 基因分离的方法有哪些？（1） 、图位克隆法Map-based cloning（未知序列的基因克隆） （2）、mRNA 差异显示法(未知序列基因克隆） （3

36、）、基因组扣除杂交法(未知序列基因克隆） 原理：首先，把两个群体分离的mRNA反转录成cDNA；我们把含有特异基因表达的群体的cDNA做 “tester”，参照群体的cDNAs为 driver；然后在driver过量的情况下将两者进行杂交，除去杂交的序列；结果，那些未杂交的cDNAs即是tester中特异表达的mRNA. （4）、转座子、T-DNA标签法 原理：利用同源或异源转座子、T-DNA随机插入基因组中引起基因失活，产生出易识别的突变表型的特点，鉴定未知基因。然后，通过分离转座子两侧的宿主基因组的DNA序列，从文库中分离目的基因 （5）、同源序列法（6）、酵母双杂交系统5、 植物转基因载

37、体应具备怎样的特点？常用的植物转基因载体包括哪两类？各有何特点？（1）作为植物基因转化的载体，必须具有两种功能： 一是它能作为媒介将外源基因导入到植物细胞中去，并且整合到宿主细胞的基因组DNA上；二是它能提供被寄主细胞的复制和转录系统所识别的DNA序列，即启动子和复制子起始位点，以保证转化的外源基因能在植物细胞中进行复制和表达。 （2）1、 病毒载体 以植物病毒作为植物基因工程的克隆载体有以下优点： 第一，植物病毒载体能把外源基因直接导入植物细胞，并且系统地分布到整个植株，而无需经过从原生质体再生植株的过程，简化了植物基因工程中外源基因的传递过程。 第二，由于病毒具有较高的自我复制能力，在转化

38、植物中可以得到高拷贝的外源基因，有利于外源基因的表达和功能的实现。 第三，植物病毒载体感染植物后，载体的DNA一般不整合到植物细胞核DNA上，不影响植物基因组的其它功能基因的表达。 缺陷：第一，病毒载体不能把携带的外源基因整合到寄主染色体上，不能按孟德尔规律传递给后代；第二，病毒载体仍然存在致病的可能性，可能会诱发植物产生病害；第三，由于病毒载体本身的不稳定性，病毒载体中的外源基因很容易丢失。 2 质粒载体 6、 Ti质粒的致瘤基因主要包括两类基因是？ T-DNA的概念TMS基因：质粒上面T区的一个致瘤基因TMR基因：仍然是质粒T区致瘤基因T-DNA：农杆菌Ti(tumor inducing)

39、或Ri(root inducing)质粒中的一段DNA序列,可以从农杆菌中转移并稳定整合到植物核基因组中,植物分子生物学中广泛应用的遗传转化载体7、 影响农杆菌介导的遗传转化的因素包括哪些方面？(1) 农杆菌菌株(2) 农杆菌菌株的生长时期(3) 基因活化的诱导物(4) 外植体的类型和生理状态（5） 外植体的预培养 8、常用的选择标记有哪些？举例说明3个以上。NPT II、GUS （-葡萄糖苷酶基因）、bar、GFP等9、 转基因技术有哪些？就某一种方法简要说明操作过程。（1） 、整株感染（2）、叶盘法（3）、基因枪介导法 ：在微粒子表面衣裹DNA，然后用粒子加速器将粒子加速，高速粒子可以穿入

40、各种组织或组织，从而完成DNA的输送。（4）电激法（5）、PEG转化法 (6) 超声波转化法(7) 花粉管通道法: 原理是授粉后使外源DNA能沿花粉管渗入，经过珠心通道进入胚囊，转化尚不具备正常细胞壁的卵、合子或早期胚胎细胞。(8) 浸泡法 10、分子检测转基因植株的方法有哪些？一、外源基因整合的分子检测 1、PCR检测2、Southern杂交检测3、PCR-Southern杂交检测 二、外源基因表达的检测 1、GUS基因检测2、Northern 杂交3、RT-PCR 4、Western杂交11、请你谈谈对转基因安全性的看法？P362（答案还是略了吧）12. 真核生物的mRNA加工过程是如何的

41、？信使RNA加工过程包括：1. 5端加帽子：在转录的早期或转录终止前已经形成。首先从5端脱去一个磷酸，再与GTP生成5，5三磷酸相连的键，最后以S-腺苷甲硫氨酸进行甲基化，形成帽子结构。帽子结构有多种，起识别和稳定作用。2. 3端加尾：在核内完成。先由RNA酶III在3端切断，再由多聚腺苷酸聚合酶加尾。尾与通过核膜有关，还可防止核酸外切酶降解。3. 内部甲基化：主要是6-甲基腺嘌呤，在hnRNA中已经存在。可能对前体的加工起识别作用13. 根据拷贝数的多少，可将质粒分为严紧型和松弛型，基因工程载体属于哪一种？质粒的复制分松弛型和严谨型两种。松弛型质粒是指质粒的复制跟细菌染色体的复制不同步，一般

42、在一个菌体内能复制10-200拷贝；严紧型质粒是指质粒复制跟细菌染色体同步，一般含有1-10拷贝 基因工程载体属于严紧型14. 用pBR322作克隆载体的筛选方式是？用pUC18/19作克隆载体的筛选方式是？ 利用氨苄青霉素和四环素双抗菌素选择；氨苄青霉素抗性15. 质粒DNA具有三种不同的构型电泳时的表现？ 最前的是超螺旋DNA，然后依次是线性DNA和开环DNA第九章 思考题1、 遗传标记和分子标记的概念。分子标记指能反映生物个体或群间基因组中某种差异的特异性DNA片段。遗传标记指可追踪染色体、染色体某一节段、某个基因座在家系中传递的任何一种遗传特性。2、 分子标记的分类和工作原理？ (一)RFLP标记(特点) 原理：限制酶切Southren杂交（1） RFLP标记的检测不受环境条件和发育阶段的影响。 （2）RFLP标记在等位基因之间是共显性的，因此在配制杂交组合时不受杂交方式的影响。 （3）在非等位的RFLP标记之间不存在上位效应，因而互不干扰 （4）RFLP标记起源于基因组DNA的自身变异，在数量上几