分子生物学基因突变

1、基基 因因 突突 变变 & 相相 关关 技技 术术Dr. Liu J Natural SelectionFebruary 12th ,2009 marked the 200th birthday for famous evolution scientist Charles Darwin (02/12/1809-04/19 /1882), who laid the foundations for the evolution theory - mutation & natural selection. As per Darwin, mutation provides new tra

2、its for species, and then the nature selects those species with advantageous heritable traits - the process Darwin called natural selection. Natural SelectionScience and Research如果要对近几年的社会话题按如果要对近几年的社会话题按照照“敏感指数敏感指数”排出一个名次排出一个名次的话，转基因食品的安全问题的话，转基因食品的安全问题恐怕至少要入围三甲。究其背恐怕至少要入围三甲。究其背后的原因，如果不是转基因食后的原因，如果

3、不是转基因食品在安全性问题上确有遮掩、品在安全性问题上确有遮掩、隐瞒的话，那么我们就该反思，隐瞒的话，那么我们就该反思，是不是真正地了解了是不是真正地了解了“转基因转基因食品的安全性到底是怎么一回食品的安全性到底是怎么一回事儿？事儿？”转基因食品的安全问题转基因食品的安全问题Evolution Mutations are engines of natural selection Spiral goat George was all mouth The eyes have itBack to the WaterScience: 科学家揭示科学家揭示人类长相各异的原因人类长相各异的原因 人类的长相

4、各异，没有两个人长相完全相同的。是什么导致了人面部形态各人类的长相各异，没有两个人长相完全相同的。是什么导致了人面部形态各异呢？遗传学证据显示父母和子女长相类似，但是哪些因素使得异呢？遗传学证据显示父母和子女长相类似，但是哪些因素使得DNA调控如此精调控如此精确，使得两个人长相不同呢？确，使得两个人长相不同呢？ 伯克利国家重点实验室的科学家揭示了增强子在面部发育中发挥重要作用。伯克利国家重点实验室的科学家揭示了增强子在面部发育中发挥重要作用。相关报道发表在近期的相关报道发表在近期的Science杂志上。该文章的通讯作者杂志上。该文章的通讯作者Axel Visel博士称其博士称其研究结果表明很可

5、能人类基因组中的数千个增强子都不同程度的参与到面部发育研究结果表明很可能人类基因组中的数千个增强子都不同程度的参与到面部发育过程中。过程中。v该研究总共分析了四千多个可能与面部发育相关的增强子序该研究总共分析了四千多个可能与面部发育相关的增强子序列，建立了增强子序列的基因组图谱。此外他们还细致分析列，建立了增强子序列的基因组图谱。此外他们还细致分析了其中了其中200个基因增强子的活性。子女遗传了父母的基因，个基因增强子的活性。子女遗传了父母的基因，但是由于增强子的存在，在面部发育过程中基因活性不尽相但是由于增强子的存在，在面部发育过程中基因活性不尽相同，最终导致面部发育结果不完全相同。该结果还

6、提示遗传同，最终导致面部发育结果不完全相同。该结果还提示遗传学家，增强子的特异突变也会在新生儿缺陷中发挥作用。有学家，增强子的特异突变也会在新生儿缺陷中发挥作用。有助于开发更好的诊断和治疗措施助于开发更好的诊断和治疗措施。vFine Tuning of Craniofacial Morphology by Distant-Acting Enhancers Catia Attanasio, Alex S. Nord, Yiwen Zhu, Matthew J. Blow, Zirong Li, Denise K. Liberton, Harris Morrison, Ingrid Plajzer

7、-Frick, Amy Holt, Roya Hosseini, Sengthavy Phouanenavong, Jennifer A. Akiyama, Malak Shoukry, Veena Afzal, Edward M. Rubin, David R. FitzPatrick, Bing Ren, Benedikt Hallgrmsson, Len A. Pennacchio, Axel ViselvThe shape of the human face and skull is largely genetically determined. However, the genomi

8、c basis of craniofacial morphology is incompletely understood and hypothesized to involve protein-coding genes, as well as gene regulatory sequences. We used a combination of epigenomic profiling, in vivo characterization of candidate enhancer sequences in transgenic mice, and targeted deletion expe

9、riments to examine the role of distant-acting enhancers in craniofacial development. We identified complex regulatory landscapes consisting of enhancers that drive spatially complex developmental expression patterns. Analysis of mouse lines in which individual craniofacial enhancers had been deleted

10、 revealed significant alterations of craniofacial shape, demonstrating the functional importance of enhancers in defining face and skull morphology. These results demonstrate that enhancers are involved in craniofacial development and suggest that enhancer sequence variation contributes to the diver

11、sity of human facial morphology.doi: 10.1126/science.1241006运动和咖啡因运动和咖啡因会改变你的会改变你的DNA你可能会认为不管做任何事情，自己的DNA都是不会受影响而改变的。但在某种意义上说，这一想法是错误的。在3月Cell出版社的细胞代谢细胞代谢杂志上，研究人员发表报告称当身体处于健康状态时，不怎么运动的男性和女性在运动锻炼几分钟后，他们体内的DNA会出现瞬间变化。更让人惊奇的是，这项研究表明我们早晨喝的咖啡中咖啡因成分也可能会以相同方式影响肌肉中的DNA。doi:10.1016/j.cmet.2012.01.001女性携带离婚基因

12、女性携带离婚基因 A-allele 者离婚率高出五成者离婚率高出五成v很多时候，当婚姻出现问题时，人们会把责任怪罪在男方头上，认为男士的花心导致了婚姻破裂。v在近期的Biological Psychiatry杂志上刊登的一项研究成果表明，据瑞典斯德哥尔摩卡罗林斯卡医学院的最新研究发现，婚姻出现破裂也有可能是女性体内携带的一种基因作祟所致。一种叫A-allele的催产素受体基因会在女性体内搞怪，让女性对婚姻关系中偶尔出现的不和谐插曲缺乏耐心，脾气暴躁，从而提高离婚率。v女性处于生产期和哺乳期时体内会自行分泌催产素，这种激素能拉近女性和后代间的关系。不过若催产素分泌异常就会搅乱大脑对感情问题的处理

13、能力，催生叫A-allele的“离婚基因”。研究人员调查了1800名女性后发现携带这种基因的女性离婚率高50%。doi:10.1016/j.biopsych.2011.09.002v概念及分类概念及分类v诱因与特点诱因与特点v突变与疾病突变与疾病v突变与遗传工程技术突变与遗传工程技术v突变的检测突变的检测基因突变概要基因突变概要A mutation has caused this garden moss rose(百叶百叶蔷薇蔷薇) to produce flowers of different colors. This is a somatic mutation that may also

14、be passed on in the germ line 概概 念：念：v基因突变：基因组基因突变：基因组DNADNA分子中发生分子中发生碱基碱基的的增添、缺失增添、缺失或改变或改变而引起的基因结构的改变，进而引起遗传表而引起的基因结构的改变，进而引起遗传表型的改变。型的改变。一、概一、概 念念 及及 分分 类类Illustrations of five types of chromosomal mutations.Cells with one additional set of chromosomes, for a total of 69 chromosomes, are called t

15、riploidWhen an individual has two or more cell populations with a different chromosomal makeup, this situation is called chromosomal mosaicism.In a balanced translocation, pieces of chromosomes are rearranged but no genetic material is gained or lost in the cell.Mitochondria provide the cells energy

16、.基因突变基因突变指一个基因变为它的指一个基因变为它的等位基因等位基因，是基因分子，是基因分子结构或化学组成上的改变。结构或化学组成上的改变。突突 变变 分分 类类（遗传信息的改变）（遗传信息的改变）突变突变分类分类碱基改变碱基改变密码效应密码效应点突变点突变（point mutation）碱基插入突变碱基插入突变（base insert ）碱基缺失突变碱基缺失突变（base deletion）同义突变同义突变（synonymous mutation）错义突变错义突变（missense mutation）无义突变无义突变（nonsense mutation）移码突变移码突变（frame-shi

17、fting mutation）碱基改变碱基改变v点突变点突变：DNADNA被化学修饰或复制时发生错配被化学修饰或复制时发生错配 ，使一个碱基，使一个碱基变成另一个碱基变成另一个碱基。v碱基插入突变碱基插入突变：DNADNA链中插入链中插入1 1个或多个碱基（转座子个或多个碱基（转座子TnTn），突变后可引起），突变后可引起DNADNA序列阅读框架改变序列阅读框架改变。v碱基缺失突变碱基缺失突变：DNADNA链中链中1 1个或多个碱基发生丢失，突变个或多个碱基发生丢失，突变后可引起后可引起DNADNA序列阅读框架改变序列阅读框架改变。突变分类突变分类基因突变的基因突变的密码效应密码效应分类分类v

18、同义突变：碱基被替代后没有密码子改变，其产物同义突变：碱基被替代后没有密码子改变，其产物AAAA序序列也无变化。列也无变化。v错义突变：碱基序列的改变引起错义突变：碱基序列的改变引起AAAA序列改变。序列改变。v无义突变：某个碱基改变使某个无义突变：某个碱基改变使某个AAAA的密码子成为蛋白质的密码子成为蛋白质合成的终止密码子。合成的终止密码子。缬氨酸缬氨酸G U AHb中一条链中一条链 谷氨酸谷氨酸 G A A基因突变的其他分类方式基因突变的其他分类方式 形态突变形态突变生化突变生化突变致死突变致死突变按突变的表型特征分类按突变的表型特征分类: : 突变发生后出现的表型改突变发生后出现的表型

19、改变是多种多样的，有的可能十分微弱，需要精细的生化技变是多种多样的，有的可能十分微弱，需要精细的生化技术才能检测出与术才能检测出与野生型（野生型（WT)WT)的差别的差别，有的突变的表型效应，有的突变的表型效应可能如此之大，以致产生形态上的严重缺陷甚至死亡可能如此之大，以致产生形态上的严重缺陷甚至死亡。1 1、形态突变、形态突变(morphological mutation):(morphological mutation): 突变主要影响生物体突变主要影响生物体的外在可见的形态结构，故又称可见突变。的外在可见的形态结构，故又称可见突变。如形状、大小、如形状、大小、色泽等的改变。色泽等的改变。

20、2 2、生化突变、生化突变(biochemical mutations): (biochemical mutations): 突变影响生物的代谢突变影响生物的代谢过程。导致一个特定的生化功能的改变或丧失。过程。导致一个特定的生化功能的改变或丧失。 （1 1）失去功能的突变：突变事件通常是破坏性的）失去功能的突变：突变事件通常是破坏性的，多数情况下，突变事，多数情况下，突变事件导致功能的丧失，完全丧失基因功能的突变称为无效突变件导致功能的丧失，完全丧失基因功能的突变称为无效突变(null (null mutation) mutation) 。通常丧失功能的突变是隐性的，。通常丧失功能的突变是隐性

21、的，有时候也可以是显性的。有时候也可以是显性的。 （2 2）获得功能的突变）获得功能的突变: :突变事件引起的遗传随机变化有可能使之获得某种突变事件引起的遗传随机变化有可能使之获得某种新的功能。新的功能。3 3、致死突变致死突变(lethal mutation):(lethal mutation): 影响生物体的生活力，导致个体死亡的一类突变。影响生物体的生活力，导致个体死亡的一类突变。 条件致死突变条件致死突变(conditional lethal mutations)(conditional lethal mutations)：在某些条件下能成活，：在某些条件下能成活，而在某些条件下是致死

22、的。例如而在某些条件下是致死的。例如T4T4噬菌体的温度敏感突变型在噬菌体的温度敏感突变型在2525时能在时能在E E. .colicoli 宿主细胞中正常生长，形成噬菌斑，但在宿主细胞中正常生长，形成噬菌斑，但在42 42 时就不能生长。时就不能生长。按发生突变的细胞分类按发生突变的细胞分类 基因突变可以发生在体细胞或生殖细胞基因突变可以发生在体细胞或生殖细胞中，这两种突变有完全不同的后果。中，这两种突变有完全不同的后果。体细胞体细胞突变突变生殖细胞生殖细胞突变突变1 1、体细胞突变体细胞突变( (somatic mutations): ): 在保持分裂的身体组织的一个细胞发生突在保持分裂的

23、身体组织的一个细胞发生突变，这个细胞便成为一群相同突变细胞的祖先。在发育过程中，体细胞突变事变，这个细胞便成为一群相同突变细胞的祖先。在发育过程中，体细胞突变事件发生的愈早，对表型的影响就愈大。体细胞突变一般不能遗传给后代。件发生的愈早，对表型的影响就愈大。体细胞突变一般不能遗传给后代。2 2、生殖细胞突变、生殖细胞突变(germinal mutation) ：生殖细胞突变发生在种系生殖细胞突变发生在种系(germ line)中。中。如果突变的性细胞参与受精过程，那么突变基因就会传给下一代。如果突变的性细胞参与受精过程，那么突变基因就会传给下一代。最典型的例最典型的例子是性连锁遗传的血友病突变

24、在欧洲王室通过维多利亚女王子是性连锁遗传的血友病突变在欧洲王室通过维多利亚女王在其整个家系中的在其整个家系中的遗传遗传。二、突变诱因及特点二、突变诱因及特点v自发性突变自发性突变 DNADNA复制过程中偶然碱基配对出现复制过程中偶然碱基配对出现错误错误 ，突变频率低突变频率低 (10-9 10-10) 。v诱变剂的作用诱变剂的作用 诱变剂（诱变剂（mutagen）外源诱发突）外源诱发突变的因素，种类繁多，突变频率高变的因素，种类繁多，突变频率高，是自然突变是自然突变的的100-1000100-1000倍倍 。主要有以下几种：。主要有以下几种：突变诱因突变诱因（1 1）物理因素物理因素 ：紫外线

25、、电离辐射等。紫外线、电离辐射等。（2 2） 生物因素生物因素 ：病毒、真菌、细菌等病毒、真菌、细菌等（3 3）化学因素化学因素 ： 烷化剂烷化剂 碱基类似物碱基类似物 : : 如如5-BrU5-BrU5-BrU 5-BrU 引起引起DNADNA碱基碱基改变示意图改变示意图 其他化学诱变剂其他化学诱变剂: : 羟胺、亚硝酸盐等羟胺、亚硝酸盐等基因突变表现出以下几个方面的普遍特征：基因突变表现出以下几个方面的普遍特征： (一一) 突变的平行性、重演性和可逆性突变的平行性、重演性和可逆性 (二二) 突变的多方向性与复等位基因突变的多方向性与复等位基因 (三三) 随机性随机性生物个体发育的任何时期生

26、物个体发育的任何时期 体细胞突变体细胞突变 不遗传给后代不遗传给后代 生殖细胞突变生殖细胞突变遗传给后代遗传给后代 (四四) 广泛性和有害性（多数）广泛性和有害性（多数）基因突变的一般特征基因突变的一般特征1.1.平行性平行性 是指亲缘关系相近的物种因遗传基础较近似而是指亲缘关系相近的物种因遗传基础较近似而发生相似基因突变的现象。发生相似基因突变的现象。 如小麦有早熟、晚熟的变异类型，属于禾本科的其它物种如大麦、如小麦有早熟、晚熟的变异类型，属于禾本科的其它物种如大麦、黑麦、燕麦、水稻、玉米等同样存在这些变异类型。黑麦、燕麦、水稻、玉米等同样存在这些变异类型。 2.2.重演性重演性 相同的基因

27、突变可以在同种生物的不同个体间相同的基因突变可以在同种生物的不同个体间重复发生，称为重演性。重复发生，称为重演性。 同一基因突变在不同的个体上均可能发生。同一基因突变在不同的个体上均可能发生。 不同群体中发生同一基因突变的频率相近。不同群体中发生同一基因突变的频率相近。突变的平行性、突变的平行性、重演性重演性和可逆性和可逆性 3. 可逆性可逆性：基因突变的发生方向是可逆的。：基因突变的发生方向是可逆的。正突变正突变(forward mutation)：显性基因显性基因A隐性基因隐性基因a ；反突变反突变(reverse mutation)： 隐性基因隐性基因a显性基因显性基因A 。通常认为：野

28、生型基因是正常、有功能基因；而最初基因突通常认为：野生型基因是正常、有功能基因；而最初基因突变往往是野生型基因突变而丧失功能、发生功能改变，表现为变往往是野生型基因突变而丧失功能、发生功能改变，表现为隐性基因。所以反突变又称为隐性基因。所以反突变又称为回复突变回复突变(back mutaiton)。 通常用通常用u表示正突变频率、表示正突变频率、v表示反突变频率，则：表示反突变频率，则： 正突变正突变u 野生型野生型=突变型突变型 一般一般 uv 反突变反突变v突变的多方向性：突变的多方向性：指基因突变可以多方向指基因突变可以多方向发生，即基因内部多个突变部位分别改变发生，即基因内部多个突变部

29、位分别改变后会产生多种等位基因形式。后会产生多种等位基因形式。例如：例如：A基因不同部位发生改变产生突变基因基因不同部位发生改变产生突变基因a1、a2、a3等对等对A均表现为隐性的基因。新基因可能均均表现为隐性的基因。新基因可能均是无功能的，也可能各具不同功能。这些复等位基是无功能的，也可能各具不同功能。这些复等位基因可以从野生型基因突变产生，也可以从其它任何因可以从野生型基因突变产生，也可以从其它任何一个突变基因突变产生。一个突变基因突变产生。 突变的突变的多方向性多方向性与与复等位基因复等位基因 复等位基因复等位基因(multiple allele)(multiple allele)： 位

30、于同一基因位点上的多种等位基因。位于同一基因位点上的多种等位基因。在二倍体与异源多倍体中，在二倍体与异源多倍体中，同一位点只能有一对同一位点只能有一对基因基因，最多存在两种等位基因形式；因此复等位，最多存在两种等位基因形式；因此复等位基因的各种形式会存在于基因的各种形式会存在于生物群体生物群体的的不同个体不同个体中。中。等位基因概念等位基因概念 人类红细胞表面抗原的特异性由人类红细胞表面抗原的特异性由3个个复等位基因复等位基因IA，IB，i决定。决定。其中其中IA，IB对对i均为显性；均为显性； IA，IB间为共显性。间为共显性。 3种基因两两组合可能形成种基因两两组合可能形成6种基因型、种基

31、因型、4种红细胞表面抗种红细胞表面抗原反应类型，如下表所示原反应类型，如下表所示(其中用其中用IO表示表示i)：人类人类ABO血型的复等位基因血型的复等位基因三、基因突变与疾病三、基因突变与疾病v人类所有疾病均可视为基因病v按照参与疾病发生过程的基因性质和来源，基因病可分为三按照参与疾病发生过程的基因性质和来源，基因病可分为三种种：Gene Mutations and Disease基因型基因型genotype表型表型phenotype正常正常/异常异常单基因病单基因病多基因病多基因病获得性基因病获得性基因病正常正常/异常异常基因突变与疾病基因突变与疾病v代谢性疾病代谢性疾病v神经肌肉系统疾病

32、神经肌肉系统疾病v发育缺陷发育缺陷v肿瘤肿瘤v早老症早老症No Symptoms Severe Symptoms Mild Symptoms No Symptoms Disease Inheritance is ComplexSearching Disease Families血友病突变在维多利亚女王血友病突变在维多利亚女王及及其整个家系中的遗传其整个家系中的遗传突突 变变 与与 疾疾 病病Tumor / Cancer早早 老老 症症早衰症早衰症全称早年衰老综合症，又称儿童早老症，属遗传病。Hutchinson于1886年首先报告虽然本病为一种先天遗传性疾病，但还不能确定是常染色体隐性还是显性

33、遗传。本病为一综合征，特点为发育延迟，至婴儿时期就发生进行性老年性退行性改变。患者身体的老化过程十分快速。而罹患此病孩童的年龄很少超过13岁，大约每八百万个新生儿之中有一位患有此疾。赫赫-吉综合征吉综合征(HGPS)日本京都大学灵长类研究所副教授大日本京都大学灵长类研究所副教授大石高生的研究小组发现了年龄小但面石高生的研究小组发现了年龄小但面相衰老的相衰老的“早衰症早衰症”猴子，并将此发猴子，并将此发现发表在了美国科学杂志上。现发表在了美国科学杂志上。该小组目标通过猴子细胞制造出的人该小组目标通过猴子细胞制造出的人工多功能干细胞工多功能干细胞(iPS)使机体各种细使机体各种细胞变异，体外再现早

34、衰症病状，以此胞变异，体外再现早衰症病状，以此帮助衰老研究。大石教授表示帮助衰老研究。大石教授表示“不仅不仅希望揭开早衰症的病理，同样想要研希望揭开早衰症的病理，同样想要研究人类正常衰老的课题究人类正常衰老的课题”。着色性干皮病（着色性干皮病（XP） 着色性干皮病着色性干皮病( xroderma pigmentosa XP)与共济失调毛细与共济失调毛细血管扩张症一样，属血管扩张症一样，属DNA修复缺陷所致的遗传性共济失调综合征。修复缺陷所致的遗传性共济失调综合征。XP是常染色体隐性是常染色体隐性遗传病遗传病，具有遗传异质性。，具有遗传异质性。 着色性干皮病是着色性干皮病是一种发生在暴露部位的色

35、素变化，一种发生在暴露部位的色素变化，萎缩萎缩，角化及，角化及癌变癌变的遗传性疾的遗传性疾病，属病，属常染色体隐性遗传病常染色体隐性遗传病。21三体综合三体综合症患儿症患儿（先天愚型）（先天愚型）唇裂与腭裂Mitochondrial Mutator Mice Validate the mtDNA Mutation Theory for Mammalian Aging研究基因突变与疾病关系时应注意的问题研究基因突变与疾病关系时应注意的问题v致病突变与基因多态性致病突变与基因多态性：基因中某种突变在人群中发生频率基因中某种突变在人群中发生频率1%，属，属于基因多态性，该突变为中性突变。发生频率于基

36、因多态性，该突变为中性突变。发生频率80%）而受到普遍欢迎，光是2012年的前9个月就有超过400篇发表的论文中用到这个产品。多位点定点突变多位点定点突变v在改造酶的活性或者动力学特性，研究蛋白之间的相互作用位点等研究过程中，单点突变不能满足实验的需要，重复进行单点突变也非常浪费时间。因而Stratagene公司又推出了QuikChange Multi Site-Directed Mutagenesis kit。最多一次实验可以引入5个定点突变。原理就是准备多个带突变的引物（同方向，对同一单链模版），退火后全部突变引物（不超过5个）都结合在同一环状单链模版，PfuTurbo聚合酶延伸，碰到下一

37、个引物就停止，各片断经连接成环，和单链模版组成杂和环，DpnI消化双链模版，也消化杂和环中的模版，只留下新合成的带多个突变的单链环（mutant ssDNA），得以转化E.coli，形成双链质粒。资料表明，引入3个定点突变的效率为60%，5个定点突变的效率为30%。得到的其他质粒是带有较少定点突变的质粒。这样，一次实验可以得到不同数目突变的质粒，对于研究蛋白质结构和功能的关系也是有用的。PCR定点突变定点突变_重叠延伸重叠延伸PCR诱变诱变v 试验概要试验概要：扩增的扩增的DNA片段在预设突变处重叠片段在预设突变处重叠(2次次PCR)，再与两，再与两 个与原始片段互补的侧翼引物进行第个与原始片

38、段互补的侧翼引物进行第3次次PCRv特点特点：需两个突变诱导引物，两个侧翼引物，需两个突变诱导引物，两个侧翼引物，3次次PCR。诱变率极高。诱变率极高大引物大引物PCR定点诱变定点诱变v试验概要试验概要：两轮两轮PCR，2个侧翼引物，其中一个为预设突变引物，第个侧翼引物，其中一个为预设突变引物，第一轮一轮PCR后，大引物不需纯化，第一轮退火温度较低，第二轮较高后，大引物不需纯化，第一轮退火温度较低，第二轮较高（72）v特点特点：简单，经济，平均诱变效率可达：简单，经济，平均诱变效率可达80PCR原理示意图原理示意图PA5PA5PA5PA5PA5PA5PA5PA5PB5PC5PA5PB5PA5P

39、C555PCR-1PCR-1PCR-2PCR-2混合，变性混合，变性 ，退火，退火重叠延伸重叠延伸PCR定点突变定点突变5555PB5PC555PCR-3DNA 聚合酶聚合酶大引物大引物PCR定点诱变定点诱变5353引物引物2引物引物3PCR产生大引物产生大引物引物引物1突变体突变体PCR2五、突变的检测五、突变的检测v限制性片段长度多态性（限制性片段长度多态性（restriction fragment length polymorphism，RFLP）v单链构象多态性（单链构象多态性（ single-strand conformation polymorphism ,SSCP ）v等位基因特

40、异性等位基因特异性PCR （ allele specific PCR ）v毛细管电泳法（毛细管电泳法（capillary electrophoresis）v测序（测序（sequencing）vDNA 芯片（芯片（chip）PCR-RFLP: 多聚酶链反应多聚酶链反应(PCR)-限制性片段长度多态限制性片段长度多态性性 (Restriction fragment length Polymorphism，RFLP) 原理原理：PCR产物限制性内切酶切多态性分产物限制性内切酶切多态性分 析，析，DNA发生重排后，酶切位点发生改变。发生重排后，酶切位点发生改变。 优点优点：具有分辩率高，无需标记：具有

41、分辩率高，无需标记,重复性好，重复性好， 简便快速直观等。主要用于核酸变异性分析简便快速直观等。主要用于核酸变异性分析 与比较与比较, 微生物的分群分型分亚型，癌基因微生物的分群分型分亚型，癌基因 分析，遗传病的诊断等。分析，遗传病的诊断等。 局限局限：只能应用突变引起限制性酶切位点改变：只能应用突变引起限制性酶切位点改变 的情况下，一次只能完成一个特定位点突变的情况下，一次只能完成一个特定位点突变 筛选，检测效率低。筛选，检测效率低。限制性片段长度多态性限制性片段长度多态性PCR-RFLP原理示意原理示意聚合酶链反应一单链构象多态性聚合酶链反应一单链构象多态性（ PCR-SSCP）原理：是将

42、经扩增的原理：是将经扩增的DNADNA片段经过变性处理，形成单链，由片段经过变性处理，形成单链，由于序列不同，单链构象就有差异，在中性聚丙烯酰胺凝胶中于序列不同，单链构象就有差异，在中性聚丙烯酰胺凝胶中电泳的迁移率不同，通过与标准物的对比，即可检测出有无电泳的迁移率不同，通过与标准物的对比，即可检测出有无变异。变异。刚建立时是将同位素掺入刚建立时是将同位素掺入PCRPCR扩增的产物中，通过放射自显扩增的产物中，通过放射自显影显示结果。后用银染取代同位素显示影显示结果。后用银染取代同位素显示DNADNA带型，大大降低带型，大大降低了成本，具有经济、快速、灵敏等特点。了成本，具有经济、快速、灵敏等

43、特点。19931993年起用年起用EBEB染色染色法显示法显示DNADNA带型，使得带型，使得SSCPSSCP操作更简单，更经济，更迅速。操作更简单，更经济，更迅速。单链构象多态性单链构象多态性 在引物设计中将在引物设计中将3端和端和/或附近设计一碱基，使其仅或附近设计一碱基，使其仅能与突变型或野生型相同（能与突变型或野生型相同（正链引物正链引物）或互补（）或互补（反链引反链引物物），），从而只扩增突变型或野生型基因，根据扩增带的有从而只扩增突变型或野生型基因，根据扩增带的有无进行突变纯合子、杂合子或野生型的判断。无进行突变纯合子、杂合子或野生型的判断。 M 1 2 3左图左图 AS-PCR检测两个基因检测两个基因突变位点。突变位点。M-Marker，1, 2-正常组，正常组，3-突变组突变组等位基因特异性等位基因特异性PCR (AS-PCR) 根据根据PCR产物的有无直接进行突变分析的方法。产物的有无直接进行突变分析的方法。1、高效毛细管电泳技术简介、高效毛细管电泳技术简介 毛细管电泳毛细管电泳(capillary electrophoresis)又称高效毛细管电泳又称高效毛细管电泳(high-performance capillary electrophoresis, HPCE)，是，是20世世纪纪80年代中期问世的一种高效液相分离法，是经典电泳技术年代中期问世的