第四章 工业微生物分离与筛选

1、LOGO第四章第四章 工业微生物工业微生物 分离与筛选分离与筛选Company Logo本章内容本章内容含微生物样品的富集培养含微生物样品的富集培养含微生物样品的采集含微生物样品的采集工业微生物的常规分离工业微生物的常规分离目的微生物的筛选目的微生物的筛选毒性试验及性能鉴定毒性试验及性能鉴定Company Logo定方案定方案：首先查阅资料，了解所需菌种的生长首先查阅资料，了解所需菌种的生长培养特性。培养特性。采样：采样：有针对性地采集样品。有针对性地采集样品。增殖：增殖：人为地通过控制养分或培条件，使所需人为地通过控制养分或培条件，使所需菌种增殖培养后，在数量上占优势。菌种增殖培养后，在数量

2、上占优势。分离：分离：利用分离技术得到纯种。利用分离技术得到纯种。发酵性能测定发酵性能测定：进行生产性能测定。这些特性进行生产性能测定。这些特性包括形态、培养特征、营养要求、生理生化特包括形态、培养特征、营养要求、生理生化特性、发酵周期、产品品种和产量、耐受最高温性、发酵周期、产品品种和产量、耐受最高温度、生长和发酵最适温度、最适度、生长和发酵最适温度、最适pHpH值、提取工值、提取工艺等。艺等。新菌种分离与筛选的步骤新菌种分离与筛选的步骤Company Logo（一）菌种的来源（一）菌种的来源根据资料直接向有科研单位、高等院校、根据资料直接向有科研单位、高等院校、工厂或菌种保藏部门索取或购买

3、；工厂或菌种保藏部门索取或购买；从大自然中分离筛选新的微生物菌种。从大自然中分离筛选新的微生物菌种。 Company Logo新菌种的分离是要从混杂的各类微生新菌种的分离是要从混杂的各类微生物中依照生产的要求、菌种的特性，物中依照生产的要求、菌种的特性，采用各种筛选方法，快速、准确地把采用各种筛选方法，快速、准确地把所需要的菌种挑选出。所需要的菌种挑选出。实验室或生产用菌种实验室或生产用菌种若不慎污染了杂若不慎污染了杂菌，也必须重新进行分离纯化。菌，也必须重新进行分离纯化。 （二）分离思路（二）分离思路Company Logo第一节第一节 含微生物样品的采集含微生物样品的采集一、从土壤中采集一

4、、从土壤中采集分布：细菌、放线菌、分布：细菌、放线菌、霉菌、酵母、霉菌、酵母、藻类、藻类、原生动物原生动物1、土壤特点：p有机质含量和通气状况 5-25cm细菌、放线菌；5-10cm酵母、霉菌p酸碱度和植被状况Company Logop地理条件p季节条件：以温度适中，雨量不多的以温度适中，雨量不多的秋秋 初初为好。为好。Company Logo二、根据微生物生理生化类型采样1、根据微生物营养类型采样 自养型、异养性（碳源不同）2、根据生理特性采样 温度敏感型、氧敏感性、渗透压敏感型、酸碱型等3.特殊环境下采样：极端微生物 Company Logo三、采样方式三、采样方式（1 1）土样采集）土样

5、采集v森林、旱地，草地可先掘洞，由土壤下层向上层森林、旱地，草地可先掘洞，由土壤下层向上层顺序采集；顺序采集；v用小铲子除去表土，取离地面用小铲子除去表土，取离地面5-25cm5-25cm处的土约处的土约10g10g，盛入清洁的牛皮纸袋或塑料袋中，扎好，标记，盛入清洁的牛皮纸袋或塑料袋中，扎好，标记，记录记录采样时间、地点、环境条件采样时间、地点、环境条件等。为使土样中等。为使土样中微生物的数量和类型尽少变化，样品要及时分离。微生物的数量和类型尽少变化，样品要及时分离。Company Logo水田等浸水土壤在不损土层结构的情况下插入水田等浸水土壤在不损土层结构的情况下插入圆筒采集。或可取离地面

6、圆筒采集。或可取离地面5 515cm15cm处的土。处的土。在采集植物根际土样时，一般是自土壤中慢慢在采集植物根际土样时，一般是自土壤中慢慢拔出植物根，在无菌水中浸渍约拔出植物根，在无菌水中浸渍约20min20min，洗去，洗去粘附在根上的土壤，然后再用无菌水漂洗下根粘附在根上的土壤，然后再用无菌水漂洗下根部残留的土，这部分即为部残留的土，这部分即为根际土样根际土样。采集工具采集工具：样本采集时所需的工具通常样本采集时所需的工具通常 有有无菌无菌刮铲、土样采集器、镊子、解剖刮铲、土样采集器、镊子、解剖 刀、手套、刀、手套、无菌无菌小塑料袋和塑料瓶等。小塑料袋和塑料瓶等。Company Logo

7、（2 2）植物体采集）植物体采集采集叶面一般用采集叶面一般用灭菌的剪刀、打孔器、安全刀片灭菌的剪刀、打孔器、安全刀片等，由几片新鲜叶片的同一部位切取一小块，并等，由几片新鲜叶片的同一部位切取一小块，并注意不要损伤周围边缘。注意不要损伤周围边缘。选择叶面时应考虑叶位、叶龄、叶片正反面和在选择叶面时应考虑叶位、叶龄、叶片正反面和在一片叶上的取样部位。一片叶上的取样部位。采集植物根及根系时，方法与根际土样采集方法采集植物根及根系时，方法与根际土样采集方法相似。采集根系时，一般与根际土样一起保存。相似。采集根系时，一般与根际土样一起保存。Company Logo （3 3）水样采集）水样采集水样应收集

8、于水样应收集于100m1100m1干净、灭菌的广口塑料瓶中；干净、灭菌的广口塑料瓶中；由于表层水中含有泥沙，故在采样时应在较深的由于表层水中含有泥沙，故在采样时应在较深的静水层静水层中采集水样；中采集水样；方法：握住采样瓶底浸入水中方法：握住采样瓶底浸入水中30-50cm30-50cm处处，然后，然后瓶口朝下打开瓶盖，让水样进入。水样不应装满瓶口朝下打开瓶盖，让水样进入。水样不应装满采样瓶。所有水样都应在采样瓶。所有水样都应在24h24h之内迅速进行检测，之内迅速进行检测，或者或者44下贮存。下贮存。Company Logo四、四、采样的注意事项采样的注意事项采样时应尽可能保持采样时应尽可能保

9、持相对无菌相对无菌；所采集的样本必须具有某种所采集的样本必须具有某种代表性代表性；完整地标上样本的种类及完整地标上样本的种类及采集日期、地点以采集日期、地点以及采集地点的地理、生态参数及采集地点的地理、生态参数等；等；应充分考虑采样的季节性和时间因素，因为应充分考虑采样的季节性和时间因素，因为真正的原地菌群的出现可能是短暂的；真正的原地菌群的出现可能是短暂的；采好的样应及时处理，暂不能处理的也应贮采好的样应及时处理，暂不能处理的也应贮存于存于44下，下，时间不宜过长时间不宜过长。Company Logo1 1、营养成分、营养成分2 2、培养时间、培养时间、温度、温度、pHpH3 3、抑制杂菌、

10、抑制杂菌等一切能提高目的微生物相对生长等一切能提高目的微生物相对生长速度的手段，培养（固体、液体；速度的手段，培养（固体、液体；分批连续）后使目的微生物在种群分批连续）后使目的微生物在种群中占优势。中占优势。第二节第二节 含微生物样品的富集培养含微生物样品的富集培养Company Logov从从自然界自然界中分离培养微生物是菌种选育的中分离培养微生物是菌种选育的重要和基础的步骤。重要和基础的步骤。v在任一试样中所存在的微生物仅为极少数在任一试样中所存在的微生物仅为极少数特定种类的菌株；所以筛选过程中，应及特定种类的菌株；所以筛选过程中，应及时时调整检测方法调整检测方法，以与各种不同类型的生，以

11、与各种不同类型的生长和代谢之微生物相适应。长和代谢之微生物相适应。第三节第三节 工业微生物的常规分离工业微生物的常规分离Company Logo一、一、对工业微生物的基本要求对工业微生物的基本要求 菌株应为菌株应为“纯种培养纯种培养”。镜检无其它微生。镜检无其它微生物。且无噬菌体感染。物。且无噬菌体感染。 菌种具稳定的遗传性。菌种具稳定的遗传性。 必须能生长出可再生的单位必须能生长出可再生的单位营养细胞、营养细胞、孢子孢子 种子质量好种子质量好各级种子罐的扩大培养要生各级种子罐的扩大培养要生长迅速、强健。长迅速、强健。微生物菌株是发酵生产成败的关键。微生物菌株是发酵生产成败的关键。Compan

12、y Logo1 1 在短时间内可获得目的产物在短时间内可获得目的产物3 3天或更天或更短。短。2 2 菌株的自我保护及采取措施菌株的自我保护及采取措施: :降低降低pHpH高温生长高温生长3 3 目的产物多，且在多组分中易分离。目的产物多，且在多组分中易分离。Company Logo二、含微生物样品的富集培养二、含微生物样品的富集培养v控制培养基的营养成分v控制培养条件v抑制不需要的菌Company Logo 从产物角度从产物角度在培养时以产物的形成有目的的设计培养基在培养时以产物的形成有目的的设计培养基利用简单、快速的鉴定方法，如抗生素利用简单、快速的鉴定方法，如抗生素 从形态的角度从形态的

13、角度菌落的外观形态，是微生物的一个重要表征。如菌落的外观形态，是微生物的一个重要表征。如多糖产生菌多糖产生菌在适当的培养基上生长，从具有在适当的培养基上生长，从具有粘液粘液性的菌落性的菌落外观上就可以初步识别。外观上就可以初步识别。三、分离方法确定三、分离方法确定从生理的角度从生理的角度 好氧型、厌氧型好氧型、厌氧型Company Logo1 1、生态学方法用于培养分离中、生态学方法用于培养分离中列出所要分离的微生物类群；列出所要分离的微生物类群；根据所采集样本的各种根据所采集样本的各种生态参数生态参数，描述所要分离，描述所要分离的微生物之生态系统或栖息地：列出所要考察和的微生物之生态系统或栖

14、息地：列出所要考察和测量的环境参数，如测量的环境参数，如pHpH、盐分、水分、氧化还原、盐分、水分、氧化还原电势及温度电势及温度等；等；将样本分成若干类型，如植物和植物各部，土壤将样本分成若干类型，如植物和植物各部，土壤( (类型和土层类型和土层) )、岩石、水、昆虫和发酵食品等；、岩石、水、昆虫和发酵食品等；列出生物系统中有用的自然底物，如森林土壤中列出生物系统中有用的自然底物，如森林土壤中的几丁质、葡萄表皮的果胶；的几丁质、葡萄表皮的果胶；Company Logo根据上述根据上述5 5项中所获得的数据，设计分离方项中所获得的数据，设计分离方法，即选择适宜的法，即选择适宜的稀释液、底物、试样

15、、天稀释液、底物、试样、天然浸出汁和培养条件然浸出汁和培养条件；用标准方法作对照来评价分离方法，根据待用标准方法作对照来评价分离方法，根据待检材料的生态参数需要，修改已知的方法；检材料的生态参数需要，修改已知的方法；运用特定的富集方法，富集那些可能具有筛运用特定的富集方法，富集那些可能具有筛选意义的微生物类群。选意义的微生物类群。Company Logo2 2、生态学参数及培养基的组成原则、生态学参数及培养基的组成原则部分分离培养基中必须含有部分分离培养基中必须含有10-50%10-50%的天然提取物的天然提取物。加入培养基中的天然提取物，应含有多种加入培养基中的天然提取物，应含有多种碳、氮碳

16、、氮源，如源，如几丁质、纤维素或果胶几丁质、纤维素或果胶。所有分离培养基中都应含有抗所有分离培养基中都应含有抗真菌剂真菌剂或或抗细菌制抗细菌制剂剂，浓度约为，浓度约为50g50gm1m1；琼脂平板使用前应置于琼脂平板使用前应置于3737培养箱中孵育培养箱中孵育l l、2 2天；天；培养基的生物物理学参数，如培养基的生物物理学参数，如pHpH及盐分及盐分也应调节也应调节到与试样的生态系统参数值相近。到与试样的生态系统参数值相近。Company Logo1 分离培养微生物的常规操作分离培养微生物的常规操作分离研究微生物要在分离研究微生物要在无菌条件无菌条件下进行。下进行。防杂菌污染防杂菌污染1 操

17、作在操作在无菌室、无菌箱、超净工作台无菌室、无菌箱、超净工作台上进行。使上进行。使 用前用用前用7075酒精棉球擦拭。酒精棉球擦拭。2 培养容器（培养容器（试管、培养皿试管、培养皿）要事先灭菌。培养时）要事先灭菌。培养时要加盖。以防污染。要加盖。以防污染。3 接种用具（接种用具（吸管、接种环吸管、接种环）要灭菌）要灭菌4 接种时塞子或盖要在火焰上过一下。接种时塞子或盖要在火焰上过一下。三、菌种分离方法三、菌种分离方法Company Logo2 采样分离方法采样分离方法（1）从自然界采样分离）从自然界采样分离 培养分离培养分离挖土挖土稀释稀释 接种接种 表面向下表面向下5cm，编号记录编号记录

18、1000100万倍万倍 取取0.10.2ml稀释液稀释液 选用易生长发育的培养基选用易生长发育的培养基Company Logo（2）从检样分离）从检样分离可采取下列方法从检样可采取下列方法从检样直接分离菌株直接分离菌株A A 把把检样土检样土直接混合到预先融化的固体培养基中培直接混合到预先融化的固体培养基中培养。养。B B 取稀释后检样的上清液混合到固体培养基中。取稀释后检样的上清液混合到固体培养基中。C C 把上清液接入液体培养基中培养一定时间再接入把上清液接入液体培养基中培养一定时间再接入固体培养基。固体培养基。D D 将土样连续几次在液体培养基中富集培养后，接将土样连续几次在液体培养基中

19、富集培养后，接入固体培养基中分离。入固体培养基中分离。Company LogoE组织分离法组织分离法一般有病组织分离法消毒冲洗放在培养基上分离单一菌落食用菌孢子分离法 多孢子分离法 单孢子分离法Company Logo3 3 微生物的接种培养方法微生物的接种培养方法（1）稀释平板培养法（定性、定量）稀释平板培养法（定性、定量）加上下面的辅助措施主要适用于厌氧菌的分加上下面的辅助措施主要适用于厌氧菌的分离培养离培养对绝对厌氧菌的对绝对厌氧菌的辅助措施辅助措施培养用培养箱要预先培养用培养箱要预先去除氧并密闭去除氧并密闭Company Logo加还原剂（p72) 加入半胱氨酸、维生素C、硫化钠等焦性

20、没食子酸法平皿厌氧培养法试管厌气培养法玻璃板隔绝空气培养法生物吸氧法Company Logo（2）厌氧菌的稀释）厌氧菌的稀释转动分离转动分离培养法培养法琼脂试管加热溶解冷却至琼脂试管加热溶解冷却至5050（保持（保持液态液态），），接种接种一一支试管，支试管，转动混合转动混合后取出后取出1/101/10接入第二支试管，转动接入第二支试管，转动混合后再取出混合后再取出1/101/10接入第三接入第三支试管，支试管，依次类推依次类推，连续接，连续接种种6 61010支支。冷却凝固。在。冷却凝固。在琼脂培养基表面倾注一层琼脂培养基表面倾注一层无无菌石蜡菌石蜡，防止空气中的氧气，防止空气中的氧气进入。

21、进入。Company Logo4 4 纯化分离菌种的方法纯化分离菌种的方法挑取首批菌落挑取首批菌落菌悬液菌悬液无菌稀释液稀释无菌稀释液稀释接种到培养皿培养接种到培养皿培养重复上述步骤重复上述步骤单孢子分离单孢子分离稀释转动培养稀释转动培养挑取一个菌落挑取一个菌落取一部分取一部分观察。必要时观察。必要时所有操所有操作在无作在无菌条件菌条件下进行下进行Company Logo第四节第四节 有用微生物的筛选有用微生物的筛选筛选有用微生物是工业生产过程的筛选有用微生物是工业生产过程的第一步第一步。筛选：从自然界某些含有菌群的材料中，用筛选：从自然界某些含有菌群的材料中，用特定特定的操作程序分离并发现有

22、用的微生物的操作程序分离并发现有用的微生物。一一 初筛初筛二二 复筛复筛三三 抗菌谱的测定抗菌谱的测定Company Logo（一）初（一）初 筛筛目的目的：得到具有：得到具有潜在应用价值潜在应用价值的目的微生物。的目的微生物。初筛初筛：一次或多次从现有菌群中把多数无用：一次或多次从现有菌群中把多数无用的微生物淘汰，把少量有用的微生物筛选出的微生物淘汰，把少量有用的微生物筛选出来。来。要求要求： 快速快速有预测或预见有预测或预见 敏捷敏捷迅速处理好众多的样品。迅速处理好众多的样品。 经济经济得到有广泛目标的有用微生物。得到有广泛目标的有用微生物。Company Logo筛选方法筛选方法琼脂平板

23、培养基上培养生产出群体琼脂平板培养基上培养生产出群体后初筛。后初筛。1 1、用、用pHpH指示剂检测有无有机酸或胺类。指示剂检测有无有机酸或胺类。中性麝香草中性麝香草酚蓝酚蓝: :pHpH6.06.0黄黄, ,pH pH 7.67.6蓝蓝, ,pH6.0-7.0pH6.0-7.0绿绿2 2、在培养基中加入、在培养基中加入碳酸钙检测有机酸碳酸钙检测有机酸。可在菌群周。可在菌群周围形成清晰的碳酸钙溶解区。围形成清晰的碳酸钙溶解区。3 3、在培养基中加入、在培养基中加入底物底物检测检测细胞外酶、酶抑制剂细胞外酶、酶抑制剂等等特定的底物可以与细胞外酶形成显色反应；酶的反特定的底物可以与细胞外酶形成显色

24、反应；酶的反应对特定底物形成溶解或沉淀。应对特定底物形成溶解或沉淀。Company Logo4 各种抗生素产生菌的初筛各种抗生素产生菌的初筛（1）有代表性的常用试验菌（部分是病原菌）有代表性的常用试验菌（部分是病原菌）细菌细菌真菌真菌原虫原虫革兰氏革兰氏阴性菌阴性菌革兰氏革兰氏阳性菌阳性菌金金黄黄色色葡葡萄萄球球菌菌枯枯草草杆杆菌菌八八叠叠球球菌菌肺肺炎炎双双球球菌菌产产气气杆杆菌菌大大肠肠杆杆菌菌痢痢疾疾杆杆菌菌普普通通变变形形杆杆菌菌黑黑曲曲霉霉产产黄黄青青霉霉烟烟曲曲霉霉菌菌白白色色念念珠珠痢痢疾疾阿阿米米巴巴球球虫虫Company Logo（2）各种抗生素产生菌的初筛）各种抗生素产生菌

25、的初筛采用抑菌圈法，亦称平板扩散法、杯碟法采用抑菌圈法，亦称平板扩散法、杯碟法方法方法培养菌液培养菌液溶化的琼脂溶化的琼脂48混合混合倒平板倒平板放检样杯碟放检样杯碟培养培养无菌操作无菌操作有抑菌圈为有抑菌圈为阳性反应阳性反应Company Logo （二）（二） 复复 筛筛 微生物初筛鉴定微生物初筛鉴定 发酵培养基的选择发酵培养基的选择 培养与发酵培养与发酵 抽提试验抽提试验Company Logo1、微生物初筛鉴定、微生物初筛鉴定 对初筛菌株进行分类对初筛菌株进行分类何属？何种何属？何种？ 目的：预知微生物对人、动物或植物是目的：预知微生物对人、动物或植物是 否有致病性。否有致病性。 或进

26、行毒理实验，最短或进行毒理实验，最短3月，长达月，长达 2-5年年 但分类复杂。以前轻易不作。但分类复杂。以前轻易不作。Company Logo放线菌放线菌细菌细菌霉菌霉菌植物病原菌植物病原菌碳源：葡萄糖、淀碳源：葡萄糖、淀粉、糊精、蔗糖、粉、糊精、蔗糖、麦芽糖麦芽糖葡萄糖、柠葡萄糖、柠檬酸钠檬酸钠乳糖、葡乳糖、葡萄糖、蔗萄糖、蔗糖糖葡萄糖、蔗葡萄糖、蔗糖糖氮源：大豆粉、蛋氮源：大豆粉、蛋白胨、牛肉膏、玉白胨、牛肉膏、玉米浆、硝酸铵米浆、硝酸铵肉汤、蛋白肉汤、蛋白胨、豆饼粉、胨、豆饼粉、酵母膏、硫酵母膏、硫酸铵酸铵玉米浆、玉米浆、蛋白胨蛋白胨蛋白胨蛋白胨无机盐：氯化钠、无机盐：氯化钠、碳酸钙、

27、磷酸氢二碳酸钙、磷酸氢二钾钾氯化钠、磷氯化钠、磷酸氢二钾、酸氢二钾、锰、铁锰、铁磷酸氢二磷酸氢二钾、锰、钾、锰、铁铁磷酸二氢钾、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、磷酸氢二钾、锰、铁锰、铁2 发酵培养条件及培养基的选择发酵培养条件及培养基的选择Company Logo3 3 培养与发酵培养与发酵（1 1）试管培养）试管培养 试管摇床培养。常用。试管摇床培养。常用。 目的：原种斜面培养后，为了提高初目的：原种斜面培养后，为了提高初筛效率。筛效率。（2 2）摇瓶培养（摇瓶发酵）摇瓶培养（摇瓶发酵） 250 250或或500500mlml锥形瓶再锥形瓶再200200rpmrpm摇床上培养。摇床上培养。 目的：培养基和培养条件的初筛。目的：培养基和培养条件的初筛。 Company Logo（3 3）玻璃自控发酵罐）玻璃自控发酵罐 容量容量5 55050L L。是摇床向发酵罐的过渡阶段。是摇床向发酵罐的过渡阶段。 目的：工艺参数、工艺条件的选择和考察。目的：工艺参数、工艺条件的选择和考察。（4 4）试验罐培养）试验罐培养 中间工业试验阶段中间工业试验阶段 目的：放大和验证摇床试验结果，积累发目的：放大和验证摇床试验结果，积累发酵工艺规律和发酵参数。为工业规模生产打基酵工艺