微生物的生长及其控制

1、第六章第六章 微生物的生长及其控制微生物的生长及其控制通过本章的学习，要求掌握通过本章的学习，要求掌握：1 1、微生物生长的研究方法；、微生物生长的研究方法；2 2、细菌纯培养生长曲线各个时期的主要特点；、细菌纯培养生长曲线各个时期的主要特点；3 3、物理因子，化学药物对微生物生长的影响；、物理因子，化学药物对微生物生长的影响；4 4、微生物生长的控制。、微生物生长的控制。 重点：重点：细菌纯培养生长曲线，微生物生长的控制。细菌纯培养生长曲线，微生物生长的控制。 难点：难点： 如何利用细菌纯培养生长曲线的对数生长期来计算细菌的如何利用细菌纯培养生长曲线的对数生长期来计算细菌的代时和代数。代时和

2、代数。 第一节第一节 微生物生长的研究方法微生物生长的研究方法生长生长: : 微生物在适宜的环境条件下，不断地吸收营微生物在适宜的环境条件下，不断地吸收营养物质，并按照自己的代谢方式进行代谢活动，养物质，并按照自己的代谢方式进行代谢活动，如果同化作用大于异化作用，则细胞质的量不断如果同化作用大于异化作用，则细胞质的量不断增加，体积得以加大，于是表现为生长。简单地增加，体积得以加大，于是表现为生长。简单地说，生长说，生长growthgrowth就是有机体的细胞组分与结构在就是有机体的细胞组分与结构在量方面的增加。量方面的增加。繁殖繁殖: : 单细胞微生物如细菌，生长往往伴随着细胞单细胞微生物如细

3、菌，生长往往伴随着细胞数目的增加。当细胞增长到一定程度时，就以二数目的增加。当细胞增长到一定程度时，就以二分分裂方式形成两个基本相同的子细胞。这种由分分裂方式形成两个基本相同的子细胞。这种由于细胞分裂而引起的个体数目的增加，称为繁殖于细胞分裂而引起的个体数目的增加，称为繁殖reproductionreproduction。在多细胞微生物中，如某些霉菌，细胞数目的增在多细胞微生物中，如某些霉菌，细胞数目的增加（菌丝细胞的不断延长或分裂）如不伴随着个加（菌丝细胞的不断延长或分裂）如不伴随着个体数目的增加，只能叫生长。只有通过形成无性体数目的增加，只能叫生长。只有通过形成无性孢子或有性孢子使得个体数

4、目增加的过程才叫做孢子或有性孢子使得个体数目增加的过程才叫做繁殖。繁殖。发育发育: :在一般情况下，当环境条件适合，生长与在一般情况下，当环境条件适合，生长与繁殖始终是交替进行的。从生长到繁殖是一个由繁殖始终是交替进行的。从生长到繁殖是一个由量变到质变的过程，这个过程就是量变到质变的过程，这个过程就是发育发育developmentdevelopment。如果某一或某些环境条件发生改变，并超出了生如果某一或某些环境条件发生改变，并超出了生物可以适应的范围时，就会对机体产生抑制乃至物可以适应的范围时，就会对机体产生抑制乃至杀灭作用。杀灭作用。一、纯培养技术一、纯培养技术 微生物在自然界总是混杂地生

5、活在一起，要微生物在自然界总是混杂地生活在一起，要想研究某一种微生物，必须把研究对象从混想研究某一种微生物，必须把研究对象从混杂群体中分离出来。杂群体中分离出来。微生物学中将在实验室微生物学中将在实验室条件下由一个细胞或一种细胞群繁殖的后代条件下由一个细胞或一种细胞群繁殖的后代称为纯培养称为纯培养pure culturepure culture。获得纯培养的方法获得纯培养的方法: : 1 1、稀释倒平板法、稀释倒平板法 2 2、稀释涂布法、稀释涂布法3 3、划线分离法、划线分离法 streak plate methodstreak plate method平行划线连续划线 此法主要用于杂菌不多

6、的标本。分区划线 本法适用于杂菌量较多的标本。获得单个菌落。4、显微操作仪直接挑取单个细胞（适于原生动物、单细胞藻类等）5、稀释摇管法 （分离厌氧菌）6、液体培养基稀释分离7、选择性培养基分离 根据所要分离的菌种的特性选用培养基，如：根据所要分离的菌种的特性选用培养基，如：分离真菌用分离真菌用马丁氏培养基马丁氏培养基，pHpH偏酸；分离放线菌用偏酸；分离放线菌用高氏高氏1 1号培养基号培养基，pHpH中性偏碱。中性偏碱。不同微生物对化学试剂的敏感性不同：从土壤中分离细不同微生物对化学试剂的敏感性不同：从土壤中分离细菌在培养基中加制霉菌素抑制真菌生长；从土壤中分离菌在培养基中加制霉菌素抑制真菌生

7、长；从土壤中分离真菌时，在培养基中加孟加拉红和链霉素抑制细菌生长。真菌时，在培养基中加孟加拉红和链霉素抑制细菌生长。根据分离对象的营养特征分离特殊微生物：分离纤维素根据分离对象的营养特征分离特殊微生物：分离纤维素分解菌时，培养基以纤维素为唯一碳源。分离固氮菌，分解菌时，培养基以纤维素为唯一碳源。分离固氮菌，用无氮培养基，以用无氮培养基，以N N2 2作氮源。作氮源。 1测定总菌数（即总的细胞数量）：测定总菌数（即总的细胞数量）： 计数板直接测数计数板直接测数 染色涂片计数法染色涂片计数法 比浊法比浊法 2. 测定活菌数：测定活菌数： （1）稀释平板测数法）稀释平板测数法 （2）稀释培养测数法）

8、稀释培养测数法 （3）薄膜过滤计数法）薄膜过滤计数法 3.测定细胞生物量：测定细胞生物量： （1 1）测定细胞干重）测定细胞干重 （2 2）测定总氮量）测定总氮量 （3 3）测定）测定DNADNA含量含量 (4) (4) 测定测定ATPATP含量含量 (5 (5）测定代谢活性）测定代谢活性显微计数法 染色涂片计数法染色涂片计数法 取取0.01ml的菌悬液放在的菌悬液放在1cm2 的玻片的玻片上，让其干燥，然后固定染色，再置显上，让其干燥，然后固定染色，再置显微镜下计数每一视野中的菌数，算出视微镜下计数每一视野中的菌数，算出视野面积，按下列公式即可求出每野面积，按下列公式即可求出每ml原菌原菌液

9、中的含菌数。液中的含菌数。 每每ml菌液中的含菌数菌液中的含菌数=视野中的平均视野中的平均菌数菌数1cm2/视野面积视野面积100 比浊法比浊法 比浊法的原理是利用细菌细胞在溶液中数比浊法的原理是利用细菌细胞在溶液中数量越多，浊度越大，在光电比色计中测定时所量越多，浊度越大，在光电比色计中测定时所吸收的光线越多（即透过的光线少）吸收的光线越多（即透过的光线少） 方法是先要测定出一条标准曲线，即将菌方法是先要测定出一条标准曲线，即将菌液制成不同浊度的稀释液，将此不同浊度的稀液制成不同浊度的稀释液，将此不同浊度的稀释液用光电比色计测出其消光值，再把这各种释液用光电比色计测出其消光值，再把这各种浊度

10、的稀释液用显微镜直接计数法测出其中的浊度的稀释液用显微镜直接计数法测出其中的含菌数，以不同浊度的稀释液的消光值作纵坐含菌数，以不同浊度的稀释液的消光值作纵坐标，以不同浊度稀释液所含的菌数作横坐标，标，以不同浊度稀释液所含的菌数作横坐标，绘出标准曲线。有了标准曲线，就可以取未知绘出标准曲线。有了标准曲线，就可以取未知菌液测消光值后通过查此曲线得知未知菌液中菌液测消光值后通过查此曲线得知未知菌液中的含菌数。此方法在工业发酵中应用较多，因的含菌数。此方法在工业发酵中应用较多，因为它快速，节约时间。为它快速，节约时间。测定微生物的活菌数viable count 稀释平板测数法dilute plate

11、count以CFU(colony forming units)表示 稀释培养测数法稀释培养测数法（又称最大概率法，（又称最大概率法，MPN most probable number）例如：某细菌在稀释培养法中生长情况如下：例如：某细菌在稀释培养法中生长情况如下：稀释度稀释度: 103 104 105 106 107 108重复数重复数: 5 5 5 5 5 5有菌生有菌生长管数：长管数： 5 5 5 4 1 0 根据上述结果，数量指标为根据上述结果，数量指标为“541”，查表，查表得近似值为得近似值为17，乘以第一位数的稀释倍数，得出，乘以第一位数的稀释倍数，得出原始培养物的活菌数原始培养物的

12、活菌数=17105个 薄膜过滤计数法；薄膜过滤计数法； 此法用于计数空气中的含菌数此法用于计数空气中的含菌数 当一定体积的空气通过滤膜后，将滤当一定体积的空气通过滤膜后，将滤膜培养后计数滤膜上的菌落数即可求出膜培养后计数滤膜上的菌落数即可求出单位体积空气中的含菌数。单位体积空气中的含菌数。细胞生物量测定细胞生物量测定1.1.细胞干重测定：单位体积的培养液中的微生物细胞的干重。细胞干重测定：单位体积的培养液中的微生物细胞的干重。（如菌丝干重（如菌丝干重g/100mlg/100ml）2.2.总氮量测定法：用化学分析方法测出微生物细胞中蛋白质总氮量测定法：用化学分析方法测出微生物细胞中蛋白质或氮元素

13、的含量。或氮元素的含量。 蛋白质的含量蛋白质的含量= =氮量氮量6.256.253.DNA3.DNA含量测定法：用荧光法测定微生物细胞中含量测定法：用荧光法测定微生物细胞中DNADNA含量。含量。 细菌平均每个含细菌平均每个含DNADNA的量为的量为8.48.410105 5 ngng，若测得某样若测得某样品中的品中的DNADNA含量为含量为8.48.41010-2-2ngng，则测定样品中含有则测定样品中含有10001000个个细菌细菌 4.ATP4.ATP含量测定法含量测定法: : 以分光光度法测定它的荧光素以分光光度法测定它的荧光素荧光素荧光素酶反应的强度酶反应的强度, ,经换算即可求得

14、生物量。经换算即可求得生物量。5.5.代谢活性法：根据微生物生命活动的强度来估算生物量。代谢活性法：根据微生物生命活动的强度来估算生物量。如单位体积培养物在单位时间内的如单位体积培养物在单位时间内的O O2 2消耗、糖消耗或产酸消耗、糖消耗或产酸产产COCO2 2量等，它们在一定程度上间接地反映细胞生物量。量等，它们在一定程度上间接地反映细胞生物量。三、同步培养三、同步培养在分批培养中，各个细胞的生理状态、代谢活动并不在分批培养中，各个细胞的生理状态、代谢活动并不完全一样。如果以群体测定结果的平均值来代表单个完全一样。如果以群体测定结果的平均值来代表单个细胞的生长或生理特性是不符合客观实际的，

15、然而利细胞的生长或生理特性是不符合客观实际的，然而利用单个细胞进行研究又是很困难的。为了解决这一问用单个细胞进行研究又是很困难的。为了解决这一问题，就必须设法使群体处于同一发育阶段，使群体和题，就必须设法使群体处于同一发育阶段，使群体和个体行为变得一致，因而发展了单细胞的同步培养技个体行为变得一致，因而发展了单细胞的同步培养技术。术。 同步培养法：同步培养法：能使培养的微生物处于比较一致的生长能使培养的微生物处于比较一致的生长发育阶段上的培养方法叫同步培养法发育阶段上的培养方法叫同步培养法synchronous culture。 过滤分离法过滤分离法 1、机械法、机械法 区带离心法区带离心法

16、膜洗脱法膜洗脱法 温度调整法温度调整法2 2、诱导法、诱导法 营养调整法营养调整法 芽孢萌发法芽孢萌发法 3 3、 解除抑制法：采用碟呤等代谢抑制剂阻断细解除抑制法：采用碟呤等代谢抑制剂阻断细 胞胞DNADNA的合成，然后大量稀释解除的合成，然后大量稀释解除抑抑 制，使细胞同步生长。制，使细胞同步生长。 机械法对细胞正常生理代谢影响很少；而诱机械法对细胞正常生理代谢影响很少；而诱导同步分裂虽然方法多，应用较广，但对正常导同步分裂虽然方法多，应用较广，但对正常代谢有时有影响，而且对其诱导同步化的生化代谢有时有影响，而且对其诱导同步化的生化基础了解很少，化学诱导同步化的本质还是一基础了解很少，化学

17、诱导同步化的本质还是一个尚待研究的问题。个尚待研究的问题。 同步生长的时间，因菌种和条件而变化，同步生长的时间，因菌种和条件而变化，由于同步群体的个体差异，同步生长不能无限由于同步群体的个体差异，同步生长不能无限地维持，往往会逐渐破坏，最多能维持地维持，往往会逐渐破坏，最多能维持23个世个世代，又逐渐转变为随机生长，即非同步化。代，又逐渐转变为随机生长，即非同步化。第二节、微生物的生长规律第二节、微生物的生长规律 以少量纯培养细菌接种一定容积的培养基中经过培养生以少量纯培养细菌接种一定容积的培养基中经过培养生长，最后一次收获，此称分批培养长，最后一次收获，此称分批培养( (batch cult

18、ure)batch culture)。利用分批培养可以测定细菌纯培养生长曲线。利用分批培养可以测定细菌纯培养生长曲线。一、细菌纯培养生长曲线一、细菌纯培养生长曲线: : 将少量细菌的纯培养体接种到新鲜的液体培养基中，将少量细菌的纯培养体接种到新鲜的液体培养基中，定期测定菌体数量，开始时生长缓慢，然后细菌数目以对定期测定菌体数量，开始时生长缓慢，然后细菌数目以对数增加，继而稳定在最高生长量上，最后逐渐降低，进入数增加，继而稳定在最高生长量上，最后逐渐降低，进入衰老死亡阶段，如用座标法作图，以时间为横座标，以菌衰老死亡阶段，如用座标法作图，以时间为横座标，以菌数的对数增长量为纵座标，可以绘出一条曲

19、线，我们将此数的对数增长量为纵座标，可以绘出一条曲线，我们将此曲线叫做细菌纯培养生长曲线。曲线叫做细菌纯培养生长曲线。细菌纯培养生长曲线衰亡期稳定期对数期滞留期细菌纯培养生长曲线的分期及各期特点细菌纯培养生长曲线的分期及各期特点: :延滞期延滞期 lag phase （滞留适应期）（滞留适应期） 菌种初接入新鲜培养液内，微生物细胞需要通菌种初接入新鲜培养液内，微生物细胞需要通过自身生理机能的调节逐步适应新环境。表现为细过自身生理机能的调节逐步适应新环境。表现为细胞数量不增加但细胞个体体积增大，代谢活跃。胞数量不增加但细胞个体体积增大，代谢活跃。对数期对数期 logarithmic growth

20、 phase 细菌在这个时期生长旺盛，代谢活力强。分裂细菌在这个时期生长旺盛，代谢活力强。分裂速度快，菌数以指数级数增加，代时稳定。细胞在速度快，菌数以指数级数增加，代时稳定。细胞在形态、生理等方面较为一致，是研究微生物生理代形态、生理等方面较为一致，是研究微生物生理代谢和遗传变异的好材料。在工业生产中，也用对数谢和遗传变异的好材料。在工业生产中，也用对数期细胞作为扩大培养的种子液。期细胞作为扩大培养的种子液。利用对数生长期测定细菌的代时和代数利用对数生长期测定细菌的代时和代数: 在对数生长期内，细菌数目的增加是按在对数生长期内，细菌数目的增加是按指数指数级数增级数增加的加的 即即 20 2

21、1 22 23 2n 这里的指数这里的指数 n 为细菌分裂的次数或者增殖的代数，为细菌分裂的次数或者增殖的代数，也就是一个细菌繁殖也就是一个细菌繁殖n代产生代产生2n 个细菌。个细菌。 如果在对数期如果在对数期 开始时间开始时间 t1的菌数为的菌数为 x1 ， 繁殖繁殖 n 代后到对数期代后到对数期 后期后期t2的菌数为的菌数为 x2， 则代时（则代时（Generation time，G）（）（即每增加一代所即每增加一代所需要的时间）应为：需要的时间）应为： G=（t2 - t1）/n 先求代数先求代数n 由于由于x2 = x1 2n lgx2 = lgx1 + nlg2 ； n=（lgx2

22、- lgx1）/lg2 n = 3.3 lg (x2 /x1 ) 即即G =（t2 - t1 ）/3.3 lg (x2 /x1) 例如：在一细菌培养液中第一次测得的细菌数为例如：在一细菌培养液中第一次测得的细菌数为 104 /ml，经过培养经过培养 4 h后，又测得菌液中的细菌数后，又测得菌液中的细菌数为为 108 /ml，求此菌的世代时间和在此时间内繁殖求此菌的世代时间和在此时间内繁殖的代数。的代数。 根据公式：根据公式： G = （t2 - t1 ）/3.3 lg (x2 /x1) t2 - t1 = （4 - 0） 60 min = 240 min x2 = 108 x1 = 104 l

23、g(x2 /x1 ) = lg108 lg104 = 8 - 4 = 4 代入上式代入上式 G = 240/3.3 4 = 240/13.2 = 18 min 即在上述培养液中，即在上述培养液中，世代时间为世代时间为 18 min。 细菌繁殖代数细菌繁殖代数 n = (t2 - t1)/G = 240/18 = 13.3 代。代。稳定期稳定期(stationary phase) 又称恒定期或最高生长期。处于稳定期又称恒定期或最高生长期。处于稳定期的微生物，新增殖的细胞数与老细胞的死亡的微生物，新增殖的细胞数与老细胞的死亡数几乎相等，整个培养物中二者处于动态平数几乎相等，整个培养物中二者处于动态

24、平衡，此时生长速度，又逐渐趋向零。衡，此时生长速度，又逐渐趋向零。 在一定容积的培养基中，细菌为什么不在一定容积的培养基中，细菌为什么不能按对数期的高速率无限生长呢能按对数期的高速率无限生长呢? 这是由于对数期细菌活跃生长引起周围这是由于对数期细菌活跃生长引起周围环境条件条件发生了一系列变化，某些营养环境条件条件发生了一系列变化，某些营养物质消耗，有害代谢产物的积累，以及诸如物质消耗，有害代谢产物的积累，以及诸如pH、氧化还原电位、温度等的改变，限制了氧化还原电位、温度等的改变，限制了菌体细胞继续以高速度进行生长和分裂。菌体细胞继续以高速度进行生长和分裂。 稳定期的细胞内开始积累贮藏物，如肝稳

25、定期的细胞内开始积累贮藏物，如肝糖、异染颗粒、脂肪粒等，大多数芽孢细菌糖、异染颗粒、脂肪粒等，大多数芽孢细菌也在此阶段形成芽孢。如果为了获得大量菌也在此阶段形成芽孢。如果为了获得大量菌体，就应在此阶段收获，因这时细胞总数量体，就应在此阶段收获，因这时细胞总数量最高；最高； 这一时期也是发酵过程积累代谢产物这一时期也是发酵过程积累代谢产物的重要阶段，某些放线菌抗生素的大量形成的重要阶段，某些放线菌抗生素的大量形成也在此时期。也在此时期。 从上可以看出，稳定期的微生物，在从上可以看出，稳定期的微生物，在数量上的达到了最高水平，产物的积累也达数量上的达到了最高水平，产物的积累也达到了高峰，此时，菌体

26、的总产量与所消耗的到了高峰，此时，菌体的总产量与所消耗的营养物质之间存在着一定关系，这种关系，营养物质之间存在着一定关系，这种关系，生产上称为产量常数。生产上称为产量常数。衰亡期衰亡期(decline phase) 细菌死亡率逐渐增加，群体中活菌数目细菌死亡率逐渐增加，群体中活菌数目急剧下降，出现了急剧下降，出现了“负生长负生长”。其中有一。其中有一段时间，活菌数换几何级数下降，故有人段时间，活菌数换几何级数下降，故有人称之为称之为“对数死亡阶段对数死亡阶段”。 这一阶段的细胞，有的开始自溶，产生这一阶段的细胞，有的开始自溶，产生或释放出一些产物，如氨基酸、转化酶、或释放出一些产物，如氨基酸、

27、转化酶、外肽酶或抗生素等。菌体细胞也呈现多种外肽酶或抗生素等。菌体细胞也呈现多种形态，有时产生畸形，细胞大小悬殊，有形态，有时产生畸形，细胞大小悬殊，有的细胞内多液泡，革兰氏染色反应的阳性的细胞内多液泡，革兰氏染色反应的阳性菌变成阴性反应等。菌变成阴性反应等。 二、二次生长：二、二次生长：当培养液中同时存在两种均能被微生物利用的主要营养物时，当培养液中同时存在两种均能被微生物利用的主要营养物时，微生物将首先利用其中较易利用的营养物开始生长。当较易微生物将首先利用其中较易利用的营养物开始生长。当较易利用的营养物被消耗利用的营养物被消耗完，进入稳定期后，完，进入稳定期后，微生物经过短暂的适微生物经

28、过短暂的适应，开始利用第二种应，开始利用第二种营养物，再次开始新营养物，再次开始新的对数生长，并进入的对数生长，并进入新的稳定期，表现为新的稳定期，表现为二阶式的双峰生长曲二阶式的双峰生长曲线，称为二次生长曲线，称为二次生长曲线。线。当微生物在一个固定的容器中生长时，由于当微生物在一个固定的容器中生长时，由于养料的消耗，代谢产物的积累，必然会导致养料的消耗，代谢产物的积累，必然会导致微生物生长速度减慢，为了保持微生物能长微生物生长速度减慢，为了保持微生物能长时期的处于对数生长期，就要采用连续培养时期的处于对数生长期，就要采用连续培养continuous culture，即，即在一个恒定容积的流

29、在一个恒定容积的流动系统中，一方面以一定的速度不断地加入动系统中，一方面以一定的速度不断地加入新的培养基，另一方面又以相同的速度流出新的培养基，另一方面又以相同的速度流出培养物，这样就可以使容器中微生物的数量培养物，这样就可以使容器中微生物的数量和营养状态保持恒定，使微生物长期处于旺和营养状态保持恒定，使微生物长期处于旺盛生长阶段。盛生长阶段。 连续培养的原理是利用连续培养的原理是利用细菌细菌在在生长曲线生长曲线中的对中的对数期生长最快。数期生长最快。 恒化连续培养恒化连续培养 连续培养连续培养 恒浊连续培养恒浊连续培养 恒浊连续培养：恒浊连续培养： 不断调节流速而使细菌培养物浊度保持恒定的连

30、不断调节流速而使细菌培养物浊度保持恒定的连续培养叫恒浊连续培养续培养叫恒浊连续培养。 由光电装置检测培养容器中的浊度，根据浊度变由光电装置检测培养容器中的浊度，根据浊度变化控制新鲜培养液流入和旧培养流出速度，使容器化控制新鲜培养液流入和旧培养流出速度，使容器内菌液浓度恒定。内菌液浓度恒定。 工业发酵中用此法可获得大量菌体及代谢产物。工业发酵中用此法可获得大量菌体及代谢产物。 恒化连续培养：恒化连续培养： 控制恒定流速，使由于细菌生长而耗去的营控制恒定流速，使由于细菌生长而耗去的营养物及时得到补充，又叫恒组成连续培养养物及时得到补充，又叫恒组成连续培养。这样，。这样，细菌的生长速率将取决于限制性

31、因子的浓度。细菌的生长速率将取决于限制性因子的浓度。 恒化连续培养多用于微生物学的研究工作中。恒化连续培养多用于微生物学的研究工作中。从遗传学角度来讲，它允许我们作长时间的细菌从遗传学角度来讲，它允许我们作长时间的细菌培养而能从中分离不出的变种；从生理学方面看，培养而能从中分离不出的变种；从生理学方面看，能帮助我们观察细菌在不同生活条件下的变化，能帮助我们观察细菌在不同生活条件下的变化，尤其是尤其是DNADNA、RNARNA及蛋白质合成的变化；同时它也及蛋白质合成的变化；同时它也是研究自然条件下微生物生态体系比较理想的实是研究自然条件下微生物生态体系比较理想的实验模型，因为，生长在自然界的微生

32、物一般都处验模型，因为，生长在自然界的微生物一般都处于低营养浓度条件下，生长也较慢。而恒定连续于低营养浓度条件下，生长也较慢。而恒定连续培养正好可通过调节控制系统来维持培养基成分培养正好可通过调节控制系统来维持培养基成分的低营养养浓度，使之与自然条件相类似。的低营养养浓度，使之与自然条件相类似。四、真菌的生长四、真菌的生长1、丝状真菌在固体培养基上的生长繁殖、丝状真菌在固体培养基上的生长繁殖 丝状真菌菌丝生长与营养有关。营养丰富，丝状真菌菌丝生长与营养有关。营养丰富，分支多而密，营养贫乏，分支少而稀。分支多而密，营养贫乏，分支少而稀。 菌丝的生长是顶端生长，菌丝各个部分都有菌丝的生长是顶端生长

33、，菌丝各个部分都有极性之分，即位于前端的为幼龄菌丝，位于后面极性之分，即位于前端的为幼龄菌丝，位于后面的为老龄菌丝。的为老龄菌丝。菌丝生长与营养有关，营养丰富菌丝生长与营养有关，营养丰富则分支点与菌丝生长顶端的距离短，即分支多而则分支点与菌丝生长顶端的距离短，即分支多而频繁；营养贫乏分支点同菌丝生长顶端距离长，频繁；营养贫乏分支点同菌丝生长顶端距离长，即分支少即分支少。菌丝在固体培养基培养时形成菌落。菌丝在固体培养基培养时形成菌落。2、丝状真菌在液体培养基中的生长、丝状真菌在液体培养基中的生长丝状真菌在液体培养基中的生长可分为三个生长阶段丝状真菌在液体培养基中的生长可分为三个生长阶段即即: 延

34、缓期延缓期 迅速生长期迅速生长期 衰退期衰退期3、孢子生长、孢子生长 真菌无性孢子的形成可分为五个阶段：真菌无性孢子的形成可分为五个阶段： 1、分生孢子梗形成、分生孢子梗形成 2、核移动到分生孢子梗内、核移动到分生孢子梗内 3、分生孢子梗膨胀、分生孢子梗膨胀 4、顶端出芽，并形成一串互相连通的芽、顶端出芽，并形成一串互相连通的芽 5、芽与芽之间产生横隔，将它们分隔成成串孢子、芽与芽之间产生横隔，将它们分隔成成串孢子无性孢子繁殖过程：无性孢子繁殖过程： 孢子肿胀（外源肿胀，不需营养；孢子肿胀（外源肿胀，不需营养； 内源肿胀，需要营养）内源肿胀，需要营养） 萌发管形成萌发管形成 菌丝生长菌丝生长

35、包括包括 真菌有性孢子形成是由于性激素产生，研究较真菌有性孢子形成是由于性激素产生，研究较多的几种性激素是：多的几种性激素是： 1、三孢酸、三孢酸 2、诱雄激素、诱雄激素 3、成精激素和成卵激素、成精激素和成卵激素 绵霉的有性孢子形成过程分为以下几个步骤绵霉的有性孢子形成过程分为以下几个步骤1、首先由雌性菌体分泌一种类固醇性质的成精激、首先由雌性菌体分泌一种类固醇性质的成精激素（素（antheridiol），），它可以连续不断地产生，并扩它可以连续不断地产生，并扩散到基质中；散到基质中；2、雄性菌体在接受成精激素后，会发生多方面反雄性菌体在接受成精激素后，会发生多方面反应，促进其本身产生雄器或

36、精子，同时，它可以反应，促进其本身产生雄器或精子，同时，它可以反过来合成另一种激素称为成卵激素（过来合成另一种激素称为成卵激素（oogoniol hormone）；）；3、雌性菌体在接受成卵激素以前，没有任何形态雌性菌体在接受成卵激素以前，没有任何形态变化，直到接受了成卵激素后，才促进形成藏卵器，变化，直到接受了成卵激素后，才促进形成藏卵器，并大量产生成精激素，以吸引雄器或精子；并大量产生成精激素，以吸引雄器或精子；4、吸引和识别的结果使藏卵器与雄器结合，进行、吸引和识别的结果使藏卵器与雄器结合，进行有性生殖。有性生殖。4、真菌的二型现象有些真菌，尤其是丝状真菌如毛霉和假有些真菌，尤其是丝状真

37、菌如毛霉和假丝酵母，在不同环境下，可以丝酵母，在不同环境下，可以从菌丝型从菌丝型变为单细胞出芽酵母型，或者相反，由变为单细胞出芽酵母型，或者相反，由酵母型转变为菌丝型，这种生长型的转酵母型转变为菌丝型，这种生长型的转变称为二形现象变称为二形现象。二型转变受环境因子。二型转变受环境因子的控制。的控制。第三节第三节 影响微生物生长的主要因素影响微生物生长的主要因素 生长是微生物与外界环境因素共同作生长是微生物与外界环境因素共同作用的结果。环境条件的改变，在一定限度内，用的结果。环境条件的改变，在一定限度内，可能引起：可能引起： A. 微生物形态，生理、生长、繁殖等微生物形态，生理、生长、繁殖等特征

38、的改变，特征的改变， B. 微生物抵抗、适应了环境条件的某微生物抵抗、适应了环境条件的某些改变；些改变； C. 导致微生物的死亡。导致微生物的死亡。一、温度对微生物生长的影响一、温度对微生物生长的影响微生物生长的温度类型微生物生长的温度类型低温型微生物低温型微生物psychrophiles 又称嗜冷微生物，可分为专性嗜冷和兼性嗜冷两种。又称嗜冷微生物，可分为专性嗜冷和兼性嗜冷两种。 它们或者分布在地球两极地区的水域和土壤中，它们或者分布在地球两极地区的水域和土壤中，这里大部分地区几乎终年冰冻，即使在其微小的液态这里大部分地区几乎终年冰冻，即使在其微小的液态水间隙中也有微生物的存在；它们或者分布

39、在平均温水间隙中也有微生物的存在；它们或者分布在平均温度为度为5左右的海洋中左右的海洋中;或者分布在只有或者分布在只有12的海洋深的海洋深处；还有的分布于冷泉。处；还有的分布于冷泉。 冷藏食物的腐败往往由这类微生物引起。冷藏食物的腐败往往由这类微生物引起。嗜冷微生物嗜冷机理：嗜冷微生物嗜冷机理： 1、细胞内的酶在低温下酶活性高；、细胞内的酶在低温下酶活性高； 2、细胞膜中不饱和脂肪酸含量较高，细胞膜在低温、细胞膜中不饱和脂肪酸含量较高，细胞膜在低温下仍保持半流动状态，从而能进行下仍保持半流动状态，从而能进行活跃的物质代谢。活跃的物质代谢。中温型微生物中温型微生物mesophiles 它们又可分

40、为室温性微生物和体温性微生物。它们又可分为室温性微生物和体温性微生物。室温性微生物适于室温性微生物适于2030生长，如土壤微生物、生长，如土壤微生物、植物病原微生物。体温性微生物多为人及温血动植物病原微生物。体温性微生物多为人及温血动物的病原菌，它们生长的极限范围在物的病原菌，它们生长的极限范围在1045，最，最适生长温度与其宿主体温相近，在适生长温度与其宿主体温相近，在2540之间，之间，人体寄生菌为人体寄生菌为37左右。左右。中温型微生物不能在低温条件下生长是由于：中温型微生物不能在低温条件下生长是由于： 1、中温型微生物在低温下蛋白质的合成过程、中温型微生物在低温下蛋白质的合成过程不能启

41、动；不能启动； 2、低温下，受代谢产物的反馈抑制。、低温下，受代谢产物的反馈抑制。 高温型微生物高温型微生物themophiles 它们适于在它们适于在4550以上的温度中生长，在自然界中的分以上的温度中生长，在自然界中的分布仅局限制于某些地区，比如堆肥在发酵过程中温度常高达布仅局限制于某些地区，比如堆肥在发酵过程中温度常高达6070。能在。能在5570中生长的微生物有中生长的微生物有Bacillus、Methanobacterium等。分布于温泉中的细菌，有的可在近于等。分布于温泉中的细菌，有的可在近于100的高温中生长。这些耐高温的微生物，经常给罐头工业、的高温中生长。这些耐高温的微生物，

42、经常给罐头工业、发酵工业带来麻烦。发酵工业带来麻烦。 微生物的耐热性一般而言：微生物的耐热性一般而言： 原核生物大于真核生物原核生物大于真核生物 非光合微生物大于光合微生物非光合微生物大于光合微生物 简单生物大于复杂生物简单生物大于复杂生物 高温微生物耐高温的主要原因：高温微生物耐高温的主要原因： 1、具耐热的酶和蛋白质及其合成系统、具耐热的酶和蛋白质及其合成系统 2、细胞膜富含饱和脂肪酸，利于膜在高温下保持稳定、细胞膜富含饱和脂肪酸，利于膜在高温下保持稳定 二、二、 pH pH 值对微生物生长的影响值对微生物生长的影响 微生物在微生物在 pH49 之间都可以生长。之间都可以生长。 细菌最适细

43、菌最适 pH 为为7.08.0 放线菌最适放线菌最适 pH 7.58.5 霉菌、酵母最适霉菌、酵母最适 pH 4.06.0 藻类藻类 6.07.0 原生动物原生动物 6.08.0pH 值影响微生物生长的主要作用在于：值影响微生物生长的主要作用在于： 引起细胞膜电荷的变化，从而影响了微生物对引起细胞膜电荷的变化，从而影响了微生物对营养物质的吸收；营养物质的吸收； 影响代谢过程中酶的活性；影响代谢过程中酶的活性； 改变营养物质的可给性以及有害物质的毒性。改变营养物质的可给性以及有害物质的毒性。微生物生长繁殖的最适微生物生长繁殖的最适pH与其合成某种代谢与其合成某种代谢产物的产物的pH通常是不一样的

44、。通常是不一样的。 例如丙酮丁醇梭菌生长繁殖最适例如丙酮丁醇梭菌生长繁殖最适 pH 是是 5.57.0，丙酮丁醇梭菌合成丙酮丁醇的最适，丙酮丁醇梭菌合成丙酮丁醇的最适 pH 是是 4.35.3。 微生物在不同的微生物在不同的 pH 下积累的代谢产物下积累的代谢产物不一样。不一样。 黑曲霉在黑曲霉在 pH 23 的环境中发酵蔗的环境中发酵蔗糖以产柠檬酸为主，产草酸极少；而在糖以产柠檬酸为主，产草酸极少；而在 pH 近中性时发酵蔗糖产生大量的草酸，柠檬酸近中性时发酵蔗糖产生大量的草酸，柠檬酸产量很低。产量很低。 可利用微生物对可利用微生物对pH要求的不同，控制杂菌要求的不同，控制杂菌的污染。的污染

45、。 无机酸如硫酸、盐酸等杀菌力虽强，但无机酸如硫酸、盐酸等杀菌力虽强，但腐蚀性大腐蚀性大,很少应用很少应用；某些有机酸如苯甲酸某些有机酸如苯甲酸可用作防腐剂；酸菜、饲料青贮则是利用乳可用作防腐剂；酸菜、饲料青贮则是利用乳酸菌发酵产生的乳酸抑制腐败性微生物的生酸菌发酵产生的乳酸抑制腐败性微生物的生长。长。 强碱可用作杀菌剂，但由于其毒性大，强碱可用作杀菌剂，但由于其毒性大，用途有局限性。如生石灰用于对排泄物及仓用途有局限性。如生石灰用于对排泄物及仓库、棚舍等环境的消毒。强碱对库、棚舍等环境的消毒。强碱对G+与病毒比与病毒比对对G-作用强。结核分枝杆菌抗碱力特强。作用强。结核分枝杆菌抗碱力特强。三

46、、氧与氧化还原电位三、氧与氧化还原电位根据氧与微生物根据氧与微生物生长生长的关系，可将微生物分的关系，可将微生物分成五类：成五类： 专性好氧微生物专性好氧微生物Strict aerobes 专性厌氧微生物专性厌氧微生物Strict anaerobes 兼性厌氧微生物兼性厌氧微生物facultative aerobes 微好氧微生物微好氧微生物microaerophilic bacteria 耐氧微生物耐氧微生物aerotolerant anaerobes 五类微生物的比较五类微生物的比较 微生物微生物 超氧化物歧化酶超氧化物歧化酶 过氧化氢酶过氧化氢酶 过氧化物酶过氧化物酶专性好氧微生物专性好

47、氧微生物 + + -+ + -专性厌氧微生物专性厌氧微生物 - - - - -兼性厌氧微生物兼性厌氧微生物 + + -+ + -微好氧微生物微好氧微生物 + + -+ + -耐氧微生物耐氧微生物 + - + - +氧化还原电位（氧化还原电位（EhEh值值）与微生物与微生物生长生长的关系的关系 影响影响EhEh的因素很多，分子态氧的影响尤为重要。的因素很多，分子态氧的影响尤为重要。其次是培养基中氧化还原物质的影响。其次是培养基中氧化还原物质的影响。不同的微生物对氧化还原电位的要求不一样。不同的微生物对氧化还原电位的要求不一样。 好气微生物要求好气微生物要求EhEh值在值在 +0.1 +0.1 伏

48、以上，以伏以上，以 0.30.3至至 0.4 0.4 伏为宜。伏为宜。 兼性好氧微生物兼性好氧微生物EhEh值在值在 0.1 0.1 伏以上行呼吸作用，伏以上行呼吸作用，在在 0.1 0.1 伏以下行发酵作用。伏以下行发酵作用。 厌气性微生物厌气性微生物 EhEh 值在值在 0.1 0.1 伏以下为宜。伏以下为宜。 向培养基中通入空气或加入氧化剂可提高基质中的向培养基中通入空气或加入氧化剂可提高基质中的 EhEh 值，以培养好气微生物。在培养基中加入还原性值，以培养好气微生物。在培养基中加入还原性物质如半胱氨酸物质如半胱氨酸、亚硫酸钠、亚硫酸钠、NaNa2 2S S 等可降低基质中的等可降低基

49、质中的氧化还原电位，以培养厌气性微生物。氧化还原电位，以培养厌气性微生物。 第四节 微生物的培养方法一、实验室培养法1、固体培养法好氧菌的固体培养主要用试管斜面、培养皿琼脂平板及较大型的克氏扁瓶、茄子瓶等进行培养。厌氧菌的固体培养A、高层琼脂柱B、厌氧培养皿C、亨盖特滚管技术D、厌氧罐E、厌氧手套箱2、液体培养法好氧菌的液体培养A、试管培养B、三角瓶浅层液体培养C、摇瓶培养D、台式发酵罐厌氧菌的液体培养 加巯基乙酸、半胱氨酸、维生素C等降低氧化还原电位，以适合厌氧菌的生长。二、生产实践中培养微生物的装置1、固态培养法好氧菌的曲法培养厌氧菌的堆积培养法2、液体培养法好氧菌的培养A、浅盘培养B、深

50、层液体通气培养三、发酵罐（1）斜面培养：用于微生物形态观察或菌种保藏。（2）培养皿平板培养：用于分离和活菌计数。为了获得较多菌体提高培养效率，采用增大培养表面积的办法，实验室采用克氏瓶（茄子瓶）、罗氏瓶、锥形瓶。工厂采用曲盘、帘子以及通风制曲池等方法培养菌体。厌氧菌在有氧的情况下不能生长。要培养厌氧菌，必须创造一个无氧的环境。通常用培养基中加入还原剂，或用物理、化学方法去除环境中的游离氧，以降低氧化还原电势。如疱肉培养基、硫基乙酸钠培养基，牛心脑浸液培养基等。常用的厌氧培养方法有许多，可根据实际情况选用。1厌氧缸法 接种好标本的平板或液体培养基试管，可放入厌氧缸内培养，厌氧缸是普通的干燥缸，用

51、物理化学的方法使缸内造成厌氧环境，从而将厌氧菌培养出来。2厌氧袋（Bio-bag） 即在塑料袋内造成厌氧环境来培养厌氧菌。塑料袋透明而不透气，内装气体发生管（有硼氢化钠的碳酸氢钠固体以及5%柠檬酸安瓿）、美兰指示剂管、钯催化剂管、干燥剂。放入已接种好的平板后，尽量挤出袋内空气，然后密封袋口。先折断气体发生管，后折断美兰指示剂管，命名袋内在半小时内造成无气环境。如不突变表示袋内已达厌氧状态，可以孵育。3厌氧手套箱（Anaerobie glove box）是迄今为止国际上公认的培养厌氧菌最佳仪器之一。它是一个密闭的大型金属箱，箱的前面有一个有机玻璃做的透明面板，板上装有两个手套，可通过手套在箱内进

52、行操作，故名。箱侧有一交换室，具有内外二门，内门通箱内先关着。欲放物入箱，先打开外门，放入交换室，关上外门进行抽气和换气（H2，CO2，N2）达到厌氧状态，然后手伸入手套把交换室内门打开，将物品移入箱内，关上内门。箱内保持厌氧状态，也是利用充气中的氢在钯的催化下和箱中钱残余氧化合成水的原理。该箱可调节温度，本身是孵箱或孵箱即附在其内，还可放入解剖显微镜便于观察厌氧菌菌落，这种厌氧箱适于作厌氧细菌的大量培养研究，大量培养基可放入作预还原和厌氧性无菌试验。金属硬壁型厌氧箱的抽气、充气、厌氧环境和温度等均系自动调节。 4.厌氧盒：原理同厌氧袋，有成品销售。 5.生物耗氧法：在一密闭的容器内放以生物（

53、多是植物），消耗氧气，同时产生二氧化碳，供细菌生长用。我没见过。 6.焦性末食子酸法：在一洁净的玻片上铺上纱布或滤纸，均匀撒上焦性末食子酸，然后再混入NaHCO3粉末或NaOH溶液，迅速将已接种细菌的平板倒扣在上面，用融化的白蜡封边，造成一个封闭空间。焦性末食子酸与碱反应后耗氧。该法用于厌氧不严格的厌氧菌的培养，简单。如有梭状芽孢杆菌。 7.疱肉培养基：本身就是一个不需特殊设备的厌氧培养法。疱肉和肉汤装入大试管，液面封凡士林，造成无氧环境。 液体培养法液体培养法将微生物接种到液体培养基中进行培养的方法叫液体培养法。该类方法有：1静止培养是指接种后的液体静止不动。由于所用容器不同，培养法也不同。

54、试管培养法将菌接种到装有10 ml液体培养基的试管后摇匀，放入试管架上，置于培养箱中培养，定时观察微生物液体培养特征；浅盘培养法，将菌接入装有液体培养基的搪瓷盘内，使液面与空气广泛接触。早年柠檬酸发酵培养黑曲霉时曾用此法。2摇瓶振荡培养 由于其简便、实用，自本世纪30年代问世以来，很快发展成为微生物培养中极重要的技术，广泛用于种子培养、扩大发酵用。摇瓶培养设备主要有旋转式摇床和往复式摇床两种类型（一般摇床须放入恒温室，现已用自动控温的台式摇床）。用旋转式摇床进行微生物振荡培养时，固定在摇床上的锥形瓶随摇床以 200250 rmin的速度运动，由此带动培养物围绕着锥形瓶内壁平稳转动。在用往复式摇

55、床进行振荡培养时，培养物被前后抛掷，引起较为激烈的搅拌和撞击。如要获得更大的氧供应，可在较大的烧瓶（250500 ml锥形瓶）中装相对较小容积的培养基（2030 ml）。由此可获得更高的氧传递速率，便于细胞的迅速生长。若要获得较低的氧供应，则采用较慢的振荡速度和相对大的培养体积。3发酵罐培养一般实验室中较大量的通气扩大培养，可采用小型发酵罐，罐容在 530 L，它可以供给所培养微生物的营养物质和氧气，使微生物均匀生长，大量生产微生物细胞或代谢产物，并可在实验过程中得到必要的数几个基本概念几个基本概念 防腐防腐antisepsisantisepsis 它是一种抑菌作用。利用某些理化因子，使物它是

56、一种抑菌作用。利用某些理化因子，使物体内外的微生物暂时处于不生长繁殖但又未死亡的状体内外的微生物暂时处于不生长繁殖但又未死亡的状态。这是一种防止食品腐败和其他物质霉变的技术措态。这是一种防止食品腐败和其他物质霉变的技术措施。如低温、干燥、盐腌、糖渍等等。施。如低温、干燥、盐腌、糖渍等等。 消毒消毒disinfectiondisinfection 是指杀死或消除所有病原微生物的措施，可达是指杀死或消除所有病原微生物的措施，可达到防止传染病传播的目的。例如将物体煮沸到防止传染病传播的目的。例如将物体煮沸10 min10 min，就可杀死病原菌的营养体，但不能杀死细菌的芽孢，就可杀死病原菌的营养体，

57、但不能杀死细菌的芽孢，常用于牛奶、食品以及某些物体表面的消毒。常用于牛奶、食品以及某些物体表面的消毒。第五节 微生物的控制 灭菌灭菌sterilization 是指用物理或化学因子，杀灭物体中的所有是指用物理或化学因子，杀灭物体中的所有生活微生物，包括最耐热的细菌芽孢。这是一种彻生活微生物，包括最耐热的细菌芽孢。这是一种彻底的杀菌措施。通过灭菌的物品不再存在任何有生底的杀菌措施。通过灭菌的物品不再存在任何有生命的有机体。命的有机体。 化学治疗化学治疗chemotherapy 是指利用某些具有选择毒性的化学药物是指利用某些具有选择毒性的化学药物(如如磺胺磺胺)或抗生素，对生物体的深部感染进行治疗

58、，可或抗生素，对生物体的深部感染进行治疗，可以有效地消除宿主体内的病原体，但对宿主却没有以有效地消除宿主体内的病原体，但对宿主却没有或基本上没有损害。或基本上没有损害。 不同微生物的致死温度不同：不同微生物的致死温度不同： 多数细菌、酵母菌、霉菌的营养细胞和病毒，在多数细菌、酵母菌、霉菌的营养细胞和病毒，在5065条件下条件下12 min可致死；可致死； 放线菌和霉菌孢子比营养细胞的抗热性强，放线菌和霉菌孢子比营养细胞的抗热性强，7680条件下条件下10 min才被杀死；才被杀死； 细菌芽孢抗热性最强，细菌芽孢抗热性最强，100以下处理相当长时间以下处理相当长时间才能致死。例如肉毒梭菌的芽孢沸

59、水中才能致死。例如肉毒梭菌的芽孢沸水中5.0-9.5小时才小时才被杀死。被杀死。 同一菌种不同菌株或不同菌龄，其抗热性也可能不同同一菌种不同菌株或不同菌龄，其抗热性也可能不同 一般幼龄的比老龄的对热敏感。例如菌龄为一般幼龄的比老龄的对热敏感。例如菌龄为1.75 h和和2.75 h的大肠杆菌在的大肠杆菌在53加热加热15 min，其菌数分别下其菌数分别下降降10，000倍和倍和2， 000倍，而菌龄为倍，而菌龄为62 h，在同样条件在同样条件下菌数只下降下菌数只下降12倍。倍。 同一种微生物在生长发育的不同阶段，对温度的要同一种微生物在生长发育的不同阶段，对温度的要求不一样求不一样: 例如：灰色

60、链霉菌的菌体最适生长温度为例如：灰色链霉菌的菌体最适生长温度为37，而，而产生链霉素的最适生长温度为产生链霉素的最适生长温度为2828。 又如：青霉素产生菌菌体的最适生长温度为又如：青霉素产生菌菌体的最适生长温度为30，而产生青霉素的最适温度为而产生青霉素的最适温度为2323。 又如：黑曲霉菌体生长的最适生长温度为又如：黑曲霉菌体生长的最适生长温度为3737，而，而产酶的温度为产酶的温度为2828。 又如：人工栽培的食用菌菌丝生长的最适温度为又如：人工栽培的食用菌菌丝生长的最适温度为2525左右，而子实体分化的温度通常大都在左右，而子实体分化的温度通常大都在1818左左右。右。 培养基的成分对