第14章第39讲生物技术在其他方面的应用

1、12生物技术实践生物技术实践第第 讲讲3一、一、植物组织培养植物组织培养1.原理原理：植物细胞的全能性：植物细胞的全能性2.基本过程基本过程：4(1)脱分化和再分化的比较脱分化和再分化的比较起点起点关键因素关键因素条件条件脱分化脱分化外植体外植体植物激素植物激素一般暗培养一般暗培养再分化再分化 愈伤组织愈伤组织细胞分裂素和细胞分裂素和生长素比例生长素比例必须要光照必须要光照(2)愈伤组织的特点：细胞排列疏松而无规愈伤组织的特点：细胞排列疏松而无规则，是一种高度液泡化的呈无定形的薄壁则，是一种高度液泡化的呈无定形的薄壁细胞。细胞。53.影响因素影响因素(1)外植体的选择：材料本身的种类、外植体的

2、选择：材料本身的种类、年龄、保存时间长短等。年龄、保存时间长短等。无机营养无机营养大量元素：如大量元素：如N、P、K、Ca、Mg、S微量元素：如微量元素：如Cu、Mn、B、Fe、Zn(2)营养营养有机营养：维生素、甘氨酸、烟酸、肌醇以有机营养：维生素、甘氨酸、烟酸、肌醇以及蔗糖等及蔗糖等6(3)植物激素植物激素常用激素：生长素和细胞分裂素。常用激素：生长素和细胞分裂素。使用激素顺序不同对试验结果的影使用激素顺序不同对试验结果的影响：响：使用顺序使用顺序实验结果实验结果先使用生长素，后使先使用生长素，后使用细胞分裂素用细胞分裂素有利于细胞分裂，但细有利于细胞分裂，但细胞不分化胞不分化先使用细胞分

3、裂素，先使用细胞分裂素，后使用生长素后使用生长素细胞既分裂又分化细胞既分裂又分化同时使用同时使用分化频率提高分化频率提高7生长素用量比细胞分裂素用量，其比生长素用量比细胞分裂素用量，其比值不同，对细胞发育的方向影响不同：值不同，对细胞发育的方向影响不同：比值高时：有利于根的分化，抑制芽的比值高时：有利于根的分化，抑制芽的形成形成比值低时：有利于芽的分化，抑制根的比值低时：有利于芽的分化，抑制根的形成形成比值适中：促进愈伤组织的形成比值适中：促进愈伤组织的形成(4)温度：一般将温度控制在温度：一般将温度控制在1822 (5)pH：一般将：一般将pH控制在控制在5.8左右左右(6)光照：每日用日光

4、灯照射光照：每日用日光灯照射12 h84.实验操作步骤实验操作步骤(1)制备制备MS固体培养基：配制各种母液固体培养基：配制各种母液配制培养基配制培养基灭菌灭菌(2)外植体消毒：酒精溶液消毒外植体消毒：酒精溶液消毒无菌水无菌水清洗清洗次氯酸钠次氯酸钠(或氯化汞或氯化汞)溶液溶液无菌水清洗无菌水清洗(3)接种接种(4)培养培养(5)移栽移栽(6)栽培栽培95.月季的花药培养月季的花药培养(1)被子植物的花粉发育被子植物的花粉发育小孢子母细胞小孢子母细胞4个小孢子个小孢子1个小孢子个小孢子(单核居中期单核居中期)1个小孢子个小孢子(单核靠边期单核靠边期)花花粉粒粉粒(含一个花粉管细胞核和一个生殖细

5、胞核含一个花粉管细胞核和一个生殖细胞核)(2)产生花粉植株的两种途径产生花粉植株的两种途径10(3)影响花药培养的因素影响花药培养的因素不同植物的诱导成功率很不相同；不同植物的诱导成功率很不相同；同种植物的生理状况；同种植物的生理状况；花粉发育时期；花粉发育时期；亲本植株的生长条件、材料和低温预亲本植株的生长条件、材料和低温预处理以及接种密度等。处理以及接种密度等。116.花粉植株的产生和植物茎的组织培养的比较花粉植株的产生和植物茎的组织培养的比较菊花茎的组织培养菊花茎的组织培养月季的花药培养月季的花药培养理论理论依据植物细胞的全能性依据植物细胞的全能性基本过程基本过程脱分化、再分化脱分化、再

6、分化影响因素影响因素 选材、营养、激素、选材、营养、激素、pH、温度、光照等、温度、光照等操作流程操作流程制备固体培养基制备固体培养基外植体消毒外植体消毒接种接种培养培养移栽移栽栽栽培培选材选材材料消毒材料消毒接种和培养接种和培养筛选筛选和诱导和诱导移栽移栽栽栽培选育二、蛋白质培选育二、蛋白质的提取和分离的提取和分离12二、二、蛋白质的提取和分离蛋白质的提取和分离1.蛋白质的理化性质蛋白质的理化性质(1)具有两性具有两性(2)可以发生水解反应可以发生水解反应(3)可溶性、具有胶体的性质可溶性、具有胶体的性质(4)盐析盐析(5)蛋白质的变性蛋白质的变性(6)颜色反应颜色反应132.操作步骤操作步

7、骤蛋白质的提取和分离一般为四步：蛋白质的提取和分离一般为四步：样品处理样品处理粗分离粗分离纯化纯化纯度鉴定纯度鉴定(1)样品处理样品处理14(1)红细胞的洗涤红细胞的洗涤采集血样采集血样低速短时间离心低速短时间离心吸吸取血浆取血浆盐水洗涤盐水洗涤低速离心低速离心重复重复步骤三次步骤三次(2)血红蛋白的释放血红蛋白的释放将洗涤好的红细胞倒入烧杯中，加蒸馏将洗涤好的红细胞倒入烧杯中，加蒸馏水到原血液的体积，再加水到原血液的体积，再加40%体积的甲苯，体积的甲苯，置于磁力搅拌器上充分搅拌置于磁力搅拌器上充分搅拌10 min。15(3)分离血红蛋白溶液分离血红蛋白溶液将搅拌好的混合液转移到离心管中，以

8、将搅拌好的混合液转移到离心管中，以2000r/min的速度离心的速度离心10min后，试管中的溶后，试管中的溶液分为液分为4层：层：第第1层层(最上层最上层)：甲苯层：甲苯层(无色透明无色透明)第第2层层(中上层中上层)：脂溶性物质沉淀层：脂溶性物质沉淀层(白白色薄层固体色薄层固体)第第3层层(中下层中下层)：血红蛋白的水溶液层：血红蛋白的水溶液层(红色透明液体红色透明液体)第第4层层(最下层最下层)：杂质沉淀层：杂质沉淀层(暗红色暗红色)16(4)透析透析取取1mL的血红蛋白溶液装入透析袋中，的血红蛋白溶液装入透析袋中，将透析袋放入盛有将透析袋放入盛有300mL的物质的量浓度为的物质的量浓度

9、为20mmol/L的磷酸缓冲液中，透析的磷酸缓冲液中，透析12 h，目的，目的是除去样品中相对分子质量较小的杂质。是除去样品中相对分子质量较小的杂质。(2)凝胶色谱分离凝胶色谱分离制作凝胶色谱柱制作凝胶色谱柱装填凝胶色谱柱装填凝胶色谱柱样品加入和洗脱样品加入和洗脱17(3)结果分析与评价结果分析与评价对于血液样品的处理，需要经过洗涤、对于血液样品的处理，需要经过洗涤、释放、分离、透析几个步骤。由于血红蛋白释放、分离、透析几个步骤。由于血红蛋白与氧气结合变成鲜红色，与二氧化碳结合变与氧气结合变成鲜红色，与二氧化碳结合变成暗红色，所以刚分离后的血红蛋白溶液呈成暗红色，所以刚分离后的血红蛋白溶液呈红

10、色。红色。红色区带的移动是实验成功与否的标红色区带的移动是实验成功与否的标志。红色区带在洗脱过程中均匀一致移动，志。红色区带在洗脱过程中均匀一致移动，说明实验分离成功。说明实验分离成功。18三、三、PCR技术的基本操作和应用技术的基本操作和应用1.细胞内细胞内DNA复制条件分析复制条件分析：条件条件组分组分作用作用模板模板DNA的两条链的两条链提供复制的模板提供复制的模板原料原料四种脱氧核苷酸四种脱氧核苷酸合成合成DNA子链的原料子链的原料酶酶解旋酶、解旋酶、DNA聚聚合酶合酶打开打开DNA双螺旋催化合成双螺旋催化合成DNA子链子链能量能量ATP为解螺旋和合成子链供能为解螺旋和合成子链供能引物

11、引物RNA为为DNA聚合酶提供合成的聚合酶提供合成的3端起点端起点192.DNA分子复分子复制的人工控制制的人工控制解开螺旋：在解开螺旋：在80100 时，时，DNA双螺双螺旋打开，形成两条旋打开，形成两条DNA单链，称为变性。单链，称为变性。恢复螺旋：在恢复螺旋：在50 左右时，两条左右时，两条DNA单链重新形成双螺旋结构，称为复性。单链重新形成双螺旋结构，称为复性。203.PCR的反应过程的反应过程变性：在变性：在95 时时DNA解旋解旋复性：在复性：在50 时引物与时引物与DNA单链结合单链结合延伸：在延伸：在72 时合成时合成DNA子链子链(两个引两个引物间的序列物间的序列)214.实

12、验操作实验操作(1)PCR反映体系：缓冲液、反映体系：缓冲液、DNA模板、四种模板、四种脱氧核苷酸原料、热稳定脱氧核苷酸原料、热稳定DNA聚合酶、两种聚合酶、两种RNA引物、水引物、水(2)实验操作步骤：实验操作步骤：按照按照PCR反应体系配方配制反应液反应体系配方配制反应液将将PCR反应体系反应体系50L用微量移液器转移到用微量移液器转移到微量离心管中微量离心管中将微量离心管放到将微量离心管放到PCR仪仪设置设置PCR仪的工作参数仪的工作参数DNA在在PCR仪器中大量扩增仪器中大量扩增22水浴法：将微型离心管依次在水浴法：将微型离心管依次在95 、55 、72 的恒温水浴锅中循环处理相应时间

13、的恒温水浴锅中循环处理相应时间5.实验注意事项：实验注意事项：(1)避免外源避免外源DNA污染：所用仪器、缓冲液、污染：所用仪器、缓冲液、蒸馏水等必须进行高压灭菌蒸馏水等必须进行高压灭菌(2)缓冲液和酶分装成小份，缓冲液和酶分装成小份，-20 保存保存(3)每添加一种反应成分，更换一个移液器的每添加一种反应成分，更换一个移液器的枪头枪头(4)混匀后离心处理，使反应液集中在离心管混匀后离心处理，使反应液集中在离心管底部底部231.植物细胞表现出全能性的条件和步骤植物细胞表现出全能性的条件和步骤植物细胞要表现出全能性，需要经过以下植物细胞要表现出全能性，需要经过以下几个步骤：几个步骤：成熟细胞成熟

14、细胞分生细胞分生细胞胚状体胚状体完整植株完整植株成熟细胞成熟细胞愈伤组织愈伤组织生根出芽生根出芽完整植完整植株株诱导细胞的脱分化，需要的条件：离体；诱导细胞的脱分化，需要的条件：离体；给予适宜营养和外界条件给予适宜营养和外界条件(包括光照、植物激包括光照、植物激素等素等)242.植物组织培养培养基、无土栽培培养液、植物组织培养培养基、无土栽培培养液、微生物培养基的比较微生物培养基的比较无土栽培：液体培养液；不含有有机物及植无土栽培：液体培养液；不含有有机物及植物激素；培养过程中不需要更换培养液；不需要灭物激素；培养过程中不需要更换培养液；不需要灭菌；菌；植物组织培养基：固体培养基；含有矿质元植

15、物组织培养基：固体培养基；含有矿质元素、蔗糖、维生素、植物激素、有机添加剂等；培素、蔗糖、维生素、植物激素、有机添加剂等；培养过程中需要更换培养基；需要灭菌；养过程中需要更换培养基；需要灭菌；微生物培养基：一般是固体培养基；含有碳微生物培养基：一般是固体培养基；含有碳源、氮源、生长因子、无机盐、水，不含植物激素；源、氮源、生长因子、无机盐、水，不含植物激素；培养过程中不需要更换培养基；需要灭菌。培养过程中不需要更换培养基；需要灭菌。25植物细胞表现出全能性的必要条件是植物细胞表现出全能性的必要条件是()A.给予适宜的营养和外界条件给予适宜的营养和外界条件B.导入其他植物细胞的基因导入其他植物细

16、胞的基因C.脱离母体后，给予适宜的营养和外界条件脱离母体后，给予适宜的营养和外界条件D.将成熟的筛管细胞核移植到去核卵细胞中将成熟的筛管细胞核移植到去核卵细胞中C26 在植物体内，细胞没有表现出全能在植物体内，细胞没有表现出全能性，而是分化成为不同的组织，这是基因选性，而是分化成为不同的组织，这是基因选择性表达的结果。只有当植物组织或细胞脱择性表达的结果。只有当植物组织或细胞脱离母体后，在一定的营养物质、激素和其他离母体后，在一定的营养物质、激素和其他外界条件的作用下，植物组织或细胞才能表外界条件的作用下，植物组织或细胞才能表现出全能性。现出全能性。27下列不可能在离体条件下实现全下列不可能在

17、离体条件下实现全能性的是（双选）能性的是（双选）()A.胡萝卜的韧皮部细胞胡萝卜的韧皮部细胞B.杂交瘤细胞杂交瘤细胞C.花粉粒花粉粒D.保存完好的细胞核保存完好的细胞核BD28细胞全能性是指已经分化的细胞细胞全能性是指已经分化的细胞仍然具有发育的潜能。高度分化的植物细仍然具有发育的潜能。高度分化的植物细胞具有全能性，特化的动物细胞的细胞核胞具有全能性，特化的动物细胞的细胞核具有全能性，但不同细胞全能性大小有差具有全能性，但不同细胞全能性大小有差异：受精卵异：受精卵生殖细胞生殖细胞体细胞。另外，细体细胞。另外，细胞完成各项生命活动的必要条件是细胞结胞完成各项生命活动的必要条件是细胞结构保持完整性

18、。构保持完整性。29可以成为植物组织培养条件的是可以成为植物组织培养条件的是()CO2有机物生长素细胞分裂素有机物生长素细胞分裂素水矿质元素水矿质元素A.B.C.D.C进行植物组织培养需要有机物、植进行植物组织培养需要有机物、植物激素、水和矿质元素，但不需要物激素、水和矿质元素，但不需要CO2，因，因不能进行光合作用。不能进行光合作用。30植物组织培养和无土栽培所用的植物组织培养和无土栽培所用的培养基的共同点是培养基的共同点是()A.都需要灭菌都需要灭菌B.都含有植物激素都含有植物激素C.都含有蔗糖等有机物都含有蔗糖等有机物D.都含有矿质元素都含有矿质元素D31无土栽培把植物生长发育过程中无土

19、栽培把植物生长发育过程中所需要的各种矿质元素，按照一定的比例所需要的各种矿质元素，按照一定的比例配成营养液，营养液中不含有有机物和植配成营养液，营养液中不含有有机物和植物激素。植物组织培养的培养基需要矿质物激素。植物组织培养的培养基需要矿质元素、蔗糖、维生素、植物激素和有机添元素、蔗糖、维生素、植物激素和有机添加物。培养过程中需要更换培养基，调节加物。培养过程中需要更换培养基，调节植物生长调节剂的种类及比例。植物生长调节剂的种类及比例。32【真题真题1】(10江苏江苏)明党参是我国珍稀药用明党参是我国珍稀药用植物，对其进行保护性开发利用的方法有植物，对其进行保护性开发利用的方法有(多多选选)( ) A设计细胞培养反应器，实现药用成分的设计细胞培养反应器，实现药用成分的工厂化生产工厂化生产 B大量培养愈伤组织，直接提取药用成分大量培养愈伤组织，直接提取药用成分 C大规模栽培组织培养苗，获取药用成分大规模栽培组织培养苗，获取药用成分 D. 利用组织培养获得胚状体，制成人工种利用组织培养获得胚状体，制成人工种子子33 【解析解析】本题考查了植物组织培养技术本题考查了植物组织培养技术的应用。对明党参进行保护性开发可采用设