中国药典微生物限度检查方法验证方案

1、人工牛黄甲硝噪胶囊微生物限度检查方法验证方案起草部门：QC&签名：日期：审核部门：QC&签名：日期：部门：质量部签名：日期：批准质量负责人签名：日期：质量部 颁发本文件根据需要应分发于以下部门：01质量部卜表用于记录修订/变更主要内容及历史文件编号修订原因修订日期TS-VP-4201-00按GMP2021年修订版要求新制定1 .概述2 .验证目的和范围3 .组织及责任4 .验证进度方案表5 .验证所需要的仪器设备及相关文件确实认6 .验证所需要的菌种、培养基、检验样品确实认7 .验证工程和验证方法7.1 试验菌株7.2 需氧菌总数检查、霉菌和酵母菌总数检查方法验证的菌液制备7.3 需氧菌总数检

2、查、霉菌和酵母菌总数检查方法验证-常规倾注平皿法7.4 需氧菌总数检查方法验证一离心沉淀-薄膜过滤法7.5 限制菌检查方法验证一离心沉淀-薄膜过滤法8 .偏差与漏项限制9 .验证报告会审1 .概述我公司生产品种人工牛黄甲硝唾胶囊,产品微生物限度检查工程为需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数、以及大肠埃希菌检查和沙门菌检查.参照?中国药典?2021版四部附录1105:微生物计数法,以及 1106:限制菌检查法的规定,本公司对该产品的微生物限度 检查方法予以验证.通过验证以确认所采用的微生物限度检查方法适用.人工牛黄甲硝唾胶囊处方中含有甲硝唾、人工牛黄以及常用辅料成分,文献资料介绍甲硝唾对细菌有抑菌特性,

3、对霉菌和酵母菌无抑菌活性.甲硝唾在水中微溶,可以通过离 心沉淀-薄膜过滤法去除其对微生物生长的影响. 本验证方案通过试验菌株的回收率测试, 首先确认常规倾注平皿法是否适用于本品的微生物限度检查；如常规倾注平皿法不适用, 那么进一步验证可去除供试品抑菌物质的离心沉淀-薄膜过滤法是否适用于本品的微生物限 度检查.本验证方案根据样品特性制定微生物限度检查方法和检验条件,按制定的方法进行试验,根据验证结果判断是否符合验证标准.2 .验证目的和范围验证该产品的微生物限度检查方法的适用性, 对其有效性进行评价,保证检验结果的 可靠性.本验证方案采用3批按GM嘤求组织生产的人工牛黄甲硝唾胶囊, 进行微生物限

4、 度检查方法的验证.3 .组织及责任3.1 验证方案和验证报告的起草、审核、批准验证方案由质量部 QC组负责起草,由质量部审核,最终由质量负责人批准. 验证方案实施完成后, 由QC组负责汇总微生物限度检查法验证的结果、撰写报告,由质量部审核,最终由质量负责人批准报 告.3.2 验证方案的培训验证方案在经质量负责人批准后,由QC组组长对本次验证实施的相关人员组织培训工作,并将 该次的培训记录归档.3.3 验证方案实施过程中的变更和偏差验证方案实施过程中如有变更和偏差,质量负责人应当组织进行评估并采取相应的控 制举措.3.4 验证工作小组成员表姓名部门及职务职 责黄汉新质量负责人/质量受权 人负责

5、验证方案及报告的批准胡建新质生部QAS长审核验证方案、审核验证报告并协调工作曾凤敏质生邪Qd长负责验证方案审核、实施、汇总报告及培 训工作刘红华质量部QC负责验证方案起草、具体实施、报告工作4 .验证进度方案表本次微生物限度检查方法验证的方案安排时间是2021年12月至2021年1月5 .验证所需要的仪器设备及相关文件确实认5.1 主要检验仪器设备确认表序 号仪器设备名称型号编号校准单位校准日期肩效期至1电子天平2生化培养箱3生化培养箱4生化培养箱5立式压力蒸汽 火菌锅6生物洁净平安 柜检查人/日期：复核人/日期:5.2.验证所需文件确实认表文件名称文件编码是否有效版本文件保存处?人工牛黄甲硝

6、唾胶囊内控质量 标准?口是 口否质量部?人工牛黄甲硝唾胶囊检验操作 规程?口是 口否质量部?取样操作规程?口是 口否质量部?微生物限度检查操作规程?口是 口否质量部?微生物实验室清洁消毒操作规 程?口是 口否质量部?培养基的治理制度?口是 口否r质?检定菌的保存、传代、使用、销 毁规程?口是 口否质量部?LDZX-30FBS压力压蒸菌器操作规程?口是 口否质量部?SPX-150B&化培养箱操作规程?口是 口否质?BHC-1300IIA/B3生物洁净平安 柜操作规程?口是 口否质量部?JJ200电子天平操作规程?口是 口否质检查人/日期：复核人/日期:6 .验证所需要的菌种、培养基、检验样品确实

7、认6.1 试验菌种检查表1 丁 P菌种名称代码涂干菌种 批号来源1金更色葡萄球菌CMCCB) 26003中国食品药品检定研究院2铜绿假单胞菌CMCCB) 10104中国食品药品检定研究院3枯草芽抱杆菌CMCCB) 63501中国食品药品检定研究院4白色念珠菌CMCCF) 98001中国食品药品检定研究院5黑曲霉CMCCF) 98003中国食品药品检定研究院6大肠埃希菌CMCCB) 44102中国食品约品检定研究院7乙型副伤寒沙门菌CMCCB) 50094中国食品药品检定研究院检查人/日期：复核人/日期:6.2试验所需的培养基检查1 丁 P名称生产厂家是否通过培养 基适用性试验批号01胰酪大豆月

8、东液体培养基北京二药科技开发公司口是 口否02胰酪大豆月东琼脂培养基北京二药科技开发公司口是 口否03沙氏葡萄糖液体培养基北京二药科技开发公司口是 口否04沙氏葡萄糖琼脂培养基北京二药科技开发公司口是 口否05麦康凯液体培养基北京二药科技开发公司口是 口否06麦康凯琼脂培养基北京二药科技开发公司口是 口否07RV沙1菌增菌液体培养基北京二药科技开发公司口是 口否08木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼月日A口笠小士北京二药科技开发公司口是 口否09三糖铁琼脂培养基北京二药科技开发公司口是 口否检查人/日期：复核人/日期:6.3.检验样品确认表1 丁 P品名生产厂家批号规格是否按GMP要求生产1人工牛黄甲硝陛

9、胶囊佛山市华普生药业甲硝陛0.2g人工牛更5mg口是 口否2人工牛黄甲硝陛胶囊佛山市华普生药业甲硝陛0.2g人工牛更5mg口是 口否3人工牛黄甲硝陛胶囊佛山市华普生药业甲硝陛0.2g人工牛更5mg口是 口否检查人/日期：复核人/日期:7.验证工程和验证方法7.1试验菌株人工牛黄甲硝唾胶囊需氧菌总数检查、霉菌和酵母菌总数检查方法验证所用的菌株为 金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽抱杆菌、白色念珠菌、黑曲霉；限制菌检查方法 验证所用的菌株为大肠埃希菌、乙型副伤寒沙门菌.试验菌株的传代次数不得超过5代,并采用适宜的菌种保藏技术进行保存,以保证试验菌株的生物学特性.7.2. 氧菌总数检查、霉菌和酵母

10、菌总数检查方法验证的菌液制备分别接种金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽抱杆菌的新鲜培养物至10ml胰酪大豆豚液体培养基中,3035c培养1824小时,取此培养液1ml加0.9 %无菌氯化钠 溶液9ml,采用10倍递增稀释法,稀释至10-510-7,制成50100cfu/ml的菌悬液备用.接种白色念珠菌的新鲜培养物至 10ml沙氏葡萄糖液体培养基 中,2025c培养23 大,取此培养液1ml力口 0.9 %无菌氯化钠溶液9ml,采用10倍递增稀释法,稀释至10-5 10-7,制成50100cfu/ml的菌悬液备用.接种黑曲霉的新鲜培养物至 沙氏葡萄糖琼脂斜面上,2025c培养57天,直到获得

11、丰富的抱子.参加35ml含有0.05%聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液,将抱子洗脱,吸至无 菌试管中,取1ml加含有0.05%聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液9ml,采用10倍递增稀释法, 稀释至10-510-7,制成50100cfu/m的抱子悬液备用.菌液制备后假设在室温下放置,应在 2小时内使用；假设保存在28C,可在24小时内 使用.黑曲霉抱子悬液可保存在 28C ,在验证过的贮存期内使用.验证时,对各试验菌的回收率逐一进行验证.7.3. 需氧菌总数检查、霉菌和酵母菌总数检查方法验证-常规倾注平皿法7.3.1. 供试液的制备取供试品10g,加0.9%无菌氯化钠溶液至100ml,振

12、摇,制成1： 10的供试液.7.3.2. 试验组取1: 10的供试液1ml和7.2项下制备的50100cfu的试验菌,分别注入平皿中, 立即倾注不超过45c的胰酪大豆陈琼脂培养基20ml混匀,每株试验菌株平行制备 2个平 皿.置3035c培养箱中培养3天金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽抱杆菌, 或培养5天白色念珠菌、黑曲霉,点计菌落数.另取1: 10的供试液1ml和7.2项下制备的50100cfu的白色念珠菌、黑曲霉,分 别注入平皿中,立即倾注不超过 45c的沙氏葡萄糖琼脂培养基20ml混匀,每株试验菌株 平行制备2个平皿.置2025c培养箱中培养5天,点计菌落数.取1: 10的供试液1m

13、l注入平皿中,立即倾注不超过 45c的胰酪大豆陈琼脂培养基 20ml混匀,平行制备2个平皿.置3035c培养箱中培养5天,点计菌落数.另取1: 10的供试液1ml注入平皿中,立即倾注不超过 45c的沙氏葡萄糖琼脂培养 基培养基20ml混匀,平行制备2个平皿.置2025c培养箱中培养5天,点计菌落数.取0.9%无菌氯化钠溶液1ml和7.2项下制备的50100cfu的试验菌,分别注入平皿 中,立即倾注不超过45c的胰酪大豆陈琼脂培养基20ml混匀,每株试验菌株平行制备 2 个平皿.置3035c培养箱中培养3天金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽抱杆菌, 或培养5天白色念珠菌、黑曲霉,点计菌落数.另

14、取0.9%无菌氯化钠溶液1ml和7.2项下制备的50100cfu的白色念珠菌、黑曲霉, 分别注入平皿中,立即倾注不超过 45 C的沙氏葡萄糖琼脂培养基培养基 20ml混匀,每株 试验菌株平行制备2个平皿.置2025c培养箱中培养5天,点计菌落数.常规倾注平皿法方法验证的接受标准试验组菌落数减去供试品对照组菌落数的值与菌液对照组菌落数的比值即试验菌的回收率应在0 .5 ?2范围内.常规倾注平皿法方法验证的结果常规倾注平皿法测定需氧菌总数方法验证结果试验次数1:人工牛黄甲硝唾胶囊批号：;胰酪大豆陈琼脂培养基配制批号： 培养箱 型号 编号;培养温度： ;培养时长：金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽

15、抱杆菌 3天,白色念珠菌、黑曲霉 5天试验菌株代数试验组供试品对照组菌液对照组试验菌的 回收率12均值12均值12均值金黄色葡萄球菌铜绿假单胞菌枯草芽抱杆菌白色念珠菌黑曲霉试验人/日期：复核人/日期：试验次数2:人工牛黄甲硝唾胶囊批号：;胰酪大豆陈琼脂培养基配制批号： 培养箱 型号 编号;培养温度： ;培养时长：金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽抱杆菌 3天,白色念珠菌、黑曲霉 5天试验菌株代数试验组供试品对照组菌液对照组试验菌的 回收率12均值12均值12均值金黄色葡萄球菌铜绿假单胞菌枯草芽抱杆菌白色念珠菌黑曲霉试验人/日期：复核人/日期：试验次数3:人工牛黄甲硝唾胶囊批号：;胰酪大豆陈琼

16、脂培养基配制批号： 培养箱 型号 编号；培养温度： ；培养时长：金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽抱杆菌 3天,白色念珠菌、黑曲霉 5天试验菌株代数试验组供试品对照组菌液对照组试验菌的 回收率12均值12均值12均值金黄色葡萄球菌铜绿假单胞菌枯草芽抱杆菌白色念珠菌黑曲霉试验人/日期：复核人/日期：常规倾注平皿法测定霉菌与酵母菌总数方法验证结果试验次数1:人工牛黄甲硝唾胶囊批号：；沙氏葡萄糖琼脂培养基配制批号： 培养箱 型号 编号；培养温度： ；培养时长：5天试验菌株代数试验组供试品对照组菌液对照组试验菌的 回收率12均值12均值12均值白色念珠菌黑曲霉试验人/日期：复核人/日期：试验次数2:

17、人工牛黄甲硝唾胶囊批号：;沙氏葡萄糖琼脂培养基配制批号： 培养箱 型号 编号;培养温度： ;培养时长：5天试验菌株代数试验组供试品对照组菌液对照组试验菌的 回收率12均值12均值12均值白色念珠菌黑曲霉试验人/日期：复核人/日期：试验次数3:人工牛黄甲硝唾胶囊批号：;沙氏葡萄糖琼脂培养基配制批号： 培养箱 型号 编号;培养温度： ;培养时长：5天试验菌株代数试验组供试品对照组菌液对照组试验菌的 回收率12均值12均值12均值白色念珠菌黑曲霉试验人/日期：复核人/日期:常规倾注平皿法测定需氧菌总数、霉菌与酵母菌总数方法验证小结根据验证方案的要求进行试验,假设各试验菌株的回收率在 0.52范围内,

18、那么可确认 常规倾注平皿法适用于本品的需氧菌总数、霉菌与酵母菌总数检查.如常规倾注平皿法适 用于霉菌与酵母菌总数检查,但不适用于需氧菌总数检查,那么下面进一步验证可去除供试 品抑菌物质的离心沉淀-薄膜过滤法是否适用于本品的需氧菌总数检查.7.4. 需氧菌总数检查一离心沉淀-薄膜过滤法7.4.1. 供试液的制备取供试品10g,加0.9%无菌氯化钠溶液至100ml,振摇,制成1： 10的供试液贮备 液.取1:10的供试液贮备液50ml,经500转/分钟离心3分钟,取上精液得供试液.7.4.2. 试验组取供试液1 ml ,加至100 ml 0.9%无菌氯化钠溶液中,混匀,全量通过薄膜孔径 0.45

19、pm混合纤维素膜后,以0.9%无菌氯化钠溶液冲洗滤膜 2次100ml/次,然后在 第3次冲洗液100ml0.9%无菌氯化钠溶液中参加7.2项下制备的50100cfu的试验菌, 过滤.每株试验菌株平行制备2张滤膜.取出滤膜菌面朝上贴于胰酪大豆陈琼脂培养基平 皿上,3035c倒置培养3天金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽抱杆菌,或培 养5天白色念珠菌、黑曲霉,点计菌落数.7.4.3. 供试品对照组取供试液1 ml ,加至100 ml 0.9%无菌氯化钠溶液中,混匀,全量通过薄膜孔径 0.45 pm混合纤维素膜后,以0.9%无菌氯化钠溶液冲洗滤膜 3次100ml/次,平行制 备2张滤膜.取出滤膜菌

20、面朝上贴于胰酪大豆陈琼脂培养基平皿上,3035c倒置培养5天,点计菌落数.7.4.4. 菌液对照组取0.9%无菌氯化钠溶液300 ml, 200ml通过薄膜孔径0.45仙m混合纤维素膜后, 在余下的100m10.9%无菌氯化钠?液中参加7.2项下制备的50100cfu的试验菌,过滤. 每株试验菌株平行制备2张滤膜.取出滤膜菌面朝上贴于胰酪大豆陈琼脂培养基平皿上, 3035c倒置培养3天金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽抱杆菌,或培养 5天 白色念珠菌、黑曲霉,点计菌落数.稀释剂对照组依照7.2项下菌液制备方法,以0.9%无菌氯化钠为稀释液,将各菌液稀释至含菌50 100cfu/m1 ,然后以

21、500转/分钟离心3分钟,取上层菌液作下面的试验.取上层菌液1 ml,加至100 ml 0.9%无菌氯化钠溶液中,混匀,全量通过薄膜孔径 0.45 pm混合纤维素膜后,以0.9%无菌氯化钠溶液冲洗滤膜 3次100ml/次,每株试 验菌株平行制备2张滤膜.取出滤膜菌面朝上贴于胰酪大豆陈琼脂培养基平皿上,3035c 倒置培养3天金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽抱杆菌,或培养 5天白色念 珠菌、黑曲霉,点计菌落数.7.4.6. 离心沉淀-薄膜过滤法测定需氧菌总数方法验证的接受标准试验组菌落数减去供试品对照组菌落数的值与菌液对照组菌落数的比值 即试验菌的 回收率应在0 .5 ?2范围内,同时稀释剂

22、对照组与菌液对照组菌落数的比值应也在 0 .5 ?2 范围内.7.4.7. 离心沉淀-薄膜过滤法测定需氧菌总数方法验证的结果试验次数1:人工牛黄甲硝唾胶囊批号：;胰酪大豆陈琼脂培养基配制批号： 培养箱 型号 编号;培养温度： ;培养时长：金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽抱杆菌 3天,白色念珠菌、黑曲霉 5天试验菌 株菌 种 代 数供试品对照组寸照组稀释剂对照 组各菌株 回率稀释剂 对照组 各菌株 回收率12均 值112均 值12均 值金黄色 葡萄球菌铜绿假单胞菌枯草芽抱杆菌白色念珠菌黑曲霉试验人/日期：复核人/日期：试验次数2:人工牛黄甲硝唾胶囊批号：;胰酪大豆陈琼脂培养基配制批号： 培养

23、箱 型号 编号;培养温度： ;培养时长：金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽抱杆菌 3天,白色念珠菌、黑曲霉 5天试验菌 株菌 种 代 数供试品对照组寸照组稀释剂对照 组各菌株 回率稀释剂 对照组 各菌株 回收率12均 值112均 值12均 值金黄色 葡萄球菌铜绿假单胞菌枯草芽抱杆菌白色念珠菌黑曲霉试验人/日期：复核人/日期：试验次数3:人工牛黄甲硝唾胶囊批号：;胰酪大豆陈琼脂培养基配制批号： 培养箱 型号 编号；培养温度： ；培养时长：金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽抱杆菌 3天,白色念珠菌、黑曲霉 5天试验菌菌 种供试品对照组寸照组稀释剂对照 组各菌株稀释剂 对照组株代 数12均 值1

24、12均 值12均 值回率各菌株 回收率金黄色葡萄球菌铜绿假单胞菌枯草芽抱杆菌白色念珠菌黑曲霉试验人/日期：复核人/日期:7.4.8.离心沉淀-薄膜过滤测定需氧菌总数方法验证小结根据验证方案的要求进行试验,假设试验组各试验菌株的回收率在0.52范围内,稀释剂对照组各试验菌株的的回收率也在 0.52范围内,那么可确认离心沉淀-薄膜过滤法适 用于本品的需氧菌总数检查.人工牛黄甲硝唾胶囊照此验证过的供试液制备方法及计数方 法进行需氧菌总数计数.7.5. 限制菌检查方法验证一离心沉淀-薄膜过滤法假设在7.3需氧菌总数检查、霉菌和酵母菌总数检查方法验证-常规倾注平皿法的试验 中,证实了人工牛黄甲硝唾胶囊有

25、抑菌性,不能使用常规倾注平皿法进行需氧菌总数检查, 那么为了保证限制菌检查的可靠性,采用可去除供试品抑菌物质的离心沉淀-薄膜过滤法进行限制菌检查,根据以下方案进行方法学验证.7.5.1. 试验菌株人工牛黄甲硝唾胶囊质量标准中规定检查的限制菌为大肠埃希菌、乙型副伤寒沙门菌,所以选择这两种菌株进行限制菌检查的方法学验证.试验菌株的传代次数不得超过5代,并采用适宜的菌种保藏技术进行保存,以保证试验菌株的生物学特性.7.5.2. 限制菌检查方法验证的菌液制备分别接种大肠埃希菌、乙型副伤寒沙门菌的新鲜培养物至 10ml胰酪大豆豚液体培养 基中,3035c培养1824小时,取此培养液1ml力口 0.9 %

26、无菌氯化钠溶液9ml,采用 10倍递增稀释法,稀释至10-510-7,制成50100cfu/ml的菌悬液备用.菌液制备后假设在室温下放置,应在 2小时内使用；假设保存在28C,可在24小时内 使用.验证时,对各试验菌的回收率逐一进行验证.7.5.3. 大肠埃希菌检查方法验证供试液的制备取供试品10g,加0.9%无菌氯化钠溶液至100ml,振摇,制成1: 10的供试液贮备液. 取1:10的供试液贮备液50ml,经500转/分钟离心4分钟,取上精液得供试液.取供试液10ml,加至100 ml0.9%无菌氯化钠溶液中,混匀,全量通过薄膜后,以0.9% 无菌氯化钠溶液冲洗滤膜2次100ml/次,然后在

27、第3次冲洗液100ml0.9%无菌氯化钠 溶液中参加100cfu的大肠埃希菌,过滤.取膜接种至 100ml胰酪大豆陈液体培养基 中,混匀,3035c培养1824小时.取上述增菌培养物1ml接种至100ml麦康凯液体培养基中,4244c培养2448小 时.取麦康凯液体培养物划线接种于麦康凯琼脂培养基平板上,3035c培养1872小时.麦康凯琼脂培养基平板上应有大肠埃希菌典型菌落生长.组100cfu/ml ,然后以500转/分钟离心3分钟,取上层菌液作下面的试验.取上层菌液1 ml,加至100 ml 0.9%无菌氯化钠溶液中,混匀,全量通过薄膜孔径 0.45仙m混合纤维素膜后,以0.9%无菌氯化钠

28、溶液冲洗滤膜3次100ml/次.取膜接 种至100ml胰酪大豆陈液体培养基中,混匀,3035c培养1824小时.取上述增菌培养物1ml接种至100ml麦康凯液体培养基中,4244c培养2448小 时.取麦康凯液体培养物划线接种于麦康凯琼脂培养基平板上,3035c培养1872小时.麦康凯琼脂培养基平板上应有大肠埃希菌典型菌落生长.取0.9%无菌氯化钠溶液300 ml ,全量通过薄膜孔径0.45 m混合纤维素膜后, 取膜接种至100ml胰酪大豆陈液体培养基中,混匀,3035c培养1824小时.阴性对 照应无菌生长.试验次数1:人工牛黄甲硝唾胶囊批号：大肠埃希菌对照菌来源 批号菌种编号过程增苗培养选

29、择培养别离培乔结果判断胰酪大豆陈液体培养基配制批号麦康凯液体培养基 配制批号麦康凯琼胎培乔基平板配制批号培养箱型号编号温度c型号编号温度c型号编号温度c培疗时 问开始月日 时结束月日时开始月日 时结束月日 时开始月日 时结束月日时试验组阳性 对照组阴性 对照组试验人/日期：复核人/日期：试验次数2:人工牛黄甲硝唾胶囊批号：大肠埃希菌对照菌来源 批号菌种编号过程增苗培养选择培养别离培乔胰酪大豆陈液体培养 基麦康凯液体培养基 配制批号麦康凯琼胎培乔基 平板配制批号配制批号培养箱型号编号温度c型号编号温度c型号编号温度c结果判断培疗时 问开始月日 时结束一月日时开始月日 时结束一月一日 时开始月日

30、时结束一月一日时试验组阳性 对照组阴性 对照组试验人/日期:复核人/日期:试验次数3:人工牛黄甲硝唾胶囊批号：大肠埃希菌对照菌来源 批号菌种编号过程增苗培养选择培养别离培乔结果判断A口加工胰酪大豆陈液体培养基配制批号麦康凯液体培养基 配制批号麦康凯琼胎培乔基平板配制批号培养箱型号编号温度c型号编号温度c型号编号温度c培疗时 问开始月日 时结束月日时开始月日 时结束月日 时开始月日 时结束月日时试验组阳性 对照组阴性 对照组试验人/日期：复核人/日期:大肠埃希菌检查方法验证结果小结根据验证方案的要求进行试验,假设试验组与阳性对照组均检出典型大肠埃希菌,阴 性对照组无菌生长,那么可确认离心沉淀-薄

31、膜过滤法适用于本品的大肠埃希菌检查.人工 牛黄甲硝唾胶囊照此验证过的供试液制备方法及大肠埃希菌检查方法进行检查.菌检查方法验证7.5.4.1 供试液的制备取样品10g力口 0.9%无菌氯化钠溶液至100 ml制成1:10的供试液.取全部供试液经 500转/分钟离心4分钟,取全部上清液为供试液.7.5.4.2 .试验组取全部供试液,加至100 ml 0.9%无菌氯化钠溶液中,混匀,全量通过薄膜后,以0.9% 无菌氯化钠溶液冲洗滤膜2次100ml/次.然后在第3次冲洗液100m10.9%无菌氯化钠 溶液中参加100cfu的乙型副伤寒沙门菌,过滤.取膜接种至 200ml胰酪大豆陈液体 培养基中,混匀

32、,3035c培养1824小时.取上述增菌培养物0.1ml接种至10mlRV沙门增菌液体培养基,3035c培养1824 小时.取少量RV沙门菌增菌液体培养物划线接种于木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培养基平板上,3035c培养1848小时.沙门菌在木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培养基平板上应生长良好,菌落为淡红色或无 色、透明或半透明、中央有或无黑色.用接种针挑选出木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培养基平板上的典型菌落,于三糖铁琼脂培养基Ml层斜面上进行斜面和高层穿刺接种,培养1824小时.7.5.4.3 阳性对照组100cfu/ml ,然后以500转/分钟离心3分钟,取上层菌液作下面的试验.取上层菌液1 ml,加至

33、100 ml 0.9%无菌氯化钠溶液中,混匀,全量通过薄膜孔径 0.45仙m混合纤维素膜后,以0.9%无菌氯化钠溶液冲洗滤膜3次100ml/次.取膜接 种至200ml胰酪大豆陈液体培养基中,混匀,3035c培养1824小时.取上述增菌培养物0.1ml接种至10mlRV沙门增菌液体培养基,3035c培养1824 小时.取少量RV沙门菌增菌液体培养物划线接种于木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培养基平板上,3035c培养1848小时.沙门菌在木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培养基平板上应生长良好,菌落为淡红色或无 色、透明或半透明、中央有或无黑色.用接种针挑选出木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培养基平板上的典型菌落,于三糖铁琼脂培养基局层斜面上进行斜面和高层穿刺接种,培养1824小时.7.5.4.4 阴性对照组取0.9%无菌氯化钠溶液300 ml ,全量通过薄膜孔径0.45 m混合纤维素膜后, 取膜接种至200ml胰酪大豆陈液体培养基中,混匀,3035c培养1824小时.阴性对 照应无菌生长.7.5.4.5 离心沉淀-薄膜过滤法测定乙型副伤寒沙门菌方法验证结果试验次数1:人工牛黄甲硝唾胶囊批号：乙型副伤寒沙门菌对照菌来源 批号菌种编号过 程增苗培养选择培养别离