第四章蛋白质与酶的化学修饰.

1、第四章蛋白质与酶的化学修饰4.1 概述4.2、化学修饰的设计4.3、化学修饰的种类4.4、修饰酶的性质及特点45、化学修饰的应用4.6、化学修饰的局限性4.1、概述目前为止尽管人类已经发现了数千种酶, 但是真正具有商业价值即每年销售额可超过 1000万美元的酶不过数十种，为什么？一、限制酶的应用的原因1、稳定性不够，不能适应大量生产的需 要。2、作用的最适条件不符。3、酶的专一性4、米式常数过大5、临床应用的特殊要求6、酶活性不够高二、改变酶特性有两种主要的方法1）通过化学修饰的方法来改变已分离出来 的天然酶的活性。2）通过基因工程方法改变编码酶分子的 基因而达到改造酶的目的。三、酶化学修饰的

2、概念酶的化学修饰（chemical modification）:通过化学基团的引入或除去，使蛋白质共价 结构发生改变。-酶选择性化学修饰：描述肽链侧链基团被化学试剂专一性地修饰。四、酶化学修饰的目的1. 研究酶的结构与功能的关系。（50年代末）2. 人为改变天然酶的某些性质，扩大酶的应用 范围。（70年代末之后）1）提高酶的生物活性（酶活力）2）增强酶的稳定性（热稳定性、体内半衰期）3）消除抗原性（针对特异性反应降低生物识别能 力）4）产生新的催化能力.五、酶化学修饰的原理1、如何増强師天然构象的稳左性与耐热性修饰剂分子存在多个反应基团，町与 嗨形成多点交联。使酶的天然构彖产生 “刚性”结构。

3、2、如何保护酶活性部位与抗抑制剂大分子修饰剂与酶结合后，产生的 空间障碍或静电斥力阻扌肖抑制剂，“遮 盖” 了酶的活性部位。3、如何维持酚功能结构的完整性与抗蛋门水解酶化学修饰后通过两种途径抗蛋白水解 酶：A大分子修饰剂产牛空间障碍阻挡蛋白 水解腮接近酶分了。“遮盖”幽分了-上敏感键 免遭破坏。B酶分f上许多敏感基团交联上修饰剂后, 减少了受蛋口水解酶破坏的町能性。4、如何消除酶的抗原性酚蛋白氨基酸组成的抗原决定簇， 与修饰剂形成了共价键。破坏了抗原决定簇抗原性降低乃至 消除；“遮盖” 了抗原决定簇阻碍抗原、 抗体结合。5、酶微环境稳定的维持 pH值改变时： 破坏了酶分了上静电形成的化学键，蛍

4、 键等维持天然构彖的平衡力 改变了卿分了上氨基酸残基的离解状态 和它们之间的相互结合及作用方式许多大分子修饰剂木身就是多聚电解 质，能在酶分子表而或微环境区域形成 一层“缓冲外壳”。4.2s化学修饰的设计一、酶性质的了解（1）酶的稳定性热稳定性、酸碱稳定性、作用温度、pH、 抑制剂等（2）酶活性中心的状况活性中心基团、辅因子等。其他如分子大 小 栋缺 筋梵数鎊（3）酶侧去基团的性质及其反应性既基、氨基、竣基、咪哇基.疑基、酚基. 弧基.眄I喙基、二硫键、硫瞇基等二、修饰剂的要求1、修饰剂的分子駅、修饰剂链的长度对蛋门质 的吸附性2、修饰剂上反应基团的数目及位置3、修饰剂上反应基团的活化方法与条

5、件般要求较大分子量、良好的生物相容性 和水溶性、分fulfil有较多反应活性基团； 试剂的选择一要根据修饰冃的选择例如对氨基修饰可有几种情况修饰所有氨基而不修饰其它皋团；仅修饰a 氨基：修饰集薜的或反应性iUj的氨基：修饰具有催化活性的氨基；例：如果修饰目的是希望改变蛋白质的4廿电 状态或溶解性，则必须选择能引入最人电 荷量的试剂。用J：修饰酶的妊堆酸残基的试剂应具备呃选择性地与一个氨基酸残基反应；0反应在酚蛋口不变性条件下进行；呃所标记的残基在肽链屮稳定以易于分离 鉴定；咆修饰反应的程度能简单测定；三、反应条件的选择修饰反应尽可能在酶稳定条件下进行，并尽量 不破坏酶活性功能的必需基团，使修饰

6、率高，同时 酶的活力回收高。（1）pH与离子强度pH决定了酶蛋白分子中反应基团的解离状态。 由于它们的解离状态不同，反应性能也不同。（2）修饰反应的温度与时间严格控制温度和时间可以减少以至消除一些 非专一性的修饰反应。（3）反应体系中酶与修饰剂的比例四、化学修饰的影响因素有的情况下化学结构的改变并不影响蛋白质的 生物学活性（称非必需部分的修饰）;但大多情 况下将导致生物活性的改变（如下降以至完全丧 失）.形响蛋白质化学修饰反应进程的因素：丄蛋白质功能基的反应性；2 修饰剂的反应性.一）、蛋白质功能基反应性的影响因素蛋白质的修饰反应都是亲核反应被修饰蛋 白质侧链基团的亲核性与其pK值相关.影响蛋

7、白质侧链基团pK值的因素有：1、微环境：徵区极性、基团间的氢键、静电相互作 用I 2.基团之间的障碍（位阻效应）3、其它因素：电荷转移.共价镀形成、金属姿合、 旋转自由度竽超反应性:指蛋白质的某个侧链基团与个别试剂 能发生非常迅速的反应.酶的催化活性基团通常对修饰剂是有反应的，但 酶的超反应基团不一定是酶活性部位上的基团， 可能与酶的功能或构象没有明显联系.彩响因素：1. 改变蛋白质功能基的pKa值；2. 蛋白质功能基具有较大的亲核性；3通过静电相互作用吸引试剂，并使其有适当的 取向；4 试剂与靠近修饰部位的蛋白质区域之间的立体化学适应性；5 试剂的结合。三）、修饰剂反应性的决定因素丄选择性吸

8、附:化学修饰前，修饰剂根据各自的 弈点，忑蔣性地吸附于低或高极性区的，有时 可以根据对速度的饱和效应，检测出蛋白质 修饰剂复合物的形成，类似酶底物复合物.2静电相互作用:带电的修饰剂能选择性地吸引 到蛋白质表面带相反电荷的部位.该作用可使 修饰剂向多功能部位中的一个残基定位，或向 双功能基一侧定位.此外，静电排斥力能抑制 修饰作用.3位阻因索:蛋白质表面的位阻因素，或底物、 辅因子、抑制剂所产生的位阻因素都能阻止修 饰剂与功能基的正常反应.但修饰的结果却能 提供蛋白质表面的有用信息.厶催化因素:修饰部位附近的其它功能基，若起 一般的酸碱催化作用，也能影响修饰反应5局部环境的极性:许多有机反应的

9、速度与溶剂 的极性有关，而有些反应则与极性无关；疏水 环境能阻止产物中电荷分离的反应.4.3、化学修饰的种类一. 表面修饰二. 内部修饰三. 与辅因子相关的修饰四. 物理修饰五. 亲和修饰、表面修饰1. 化学固定化2. 小分子修饰3-大分子修饰4肽链的交联1、化学固定化通过酶衣曲的酸性或碱性氨基酸残基将酶共价 齬瓣鏑鮭必野变酶所处的环境pH发生偏移。糖化酚固窖到阴离（载体上，报适pHg升到65 与D木糖界构酶的放适pH75靠近，緒化高鑿糖载体与底物带相同电荷,固定化后反应系统 Km增加，皮Z, Km降低。增加酶分子构象稳定性。2小分子修饰（酶蛋白侧链基团修饰）定义：通过选择性的试剂或亲和标记试

10、剂与酶分子 侧链上特定的功能基团发生化学反应。侧链基团：组成蛋白质氨基酸残基上的功能团。主 要有：氨基、瘦基、服基、疏基、酚基、咪哇基。侧链基团修饰剂：采用各种小分子化合物。20种不同氨基酸的侧链基团中只有极性氨基酸的 侧链易被修饰，它们一般具有亲核性。几种重要的修饰反应:广烷基化反应酰化反应氧化还原反应芳香环取代反应1）烷基化反应试剂特点：烷基上带活泼卤素，导致酶分子的亲核基团（如-刈2，-SH等）发生烷基化.可作用基团：氨基（Lys, Arg ）,疏基（Cys ）,菽基（Asp、 Glu）,甲咬基（Met）,咪哇基（His）.修饰剂：2, 4 -二硝基氣苯、碘乙酸、碘乙 酰胺等.忧足化更疝

11、rNH-RSHCOOH + R-X-CH一SCH3NHCOOR * HX G /R 魁、 NR2）酰基化反应试剂特点: 含有构,作用于侧链基团上的 亲核基团，及化.可作用基团：氨基，疏基，醇密基（Ser、Thr）,酚 轻基（Tyr）酰疫化更应SH + R-C-Xolc OOC3）氧化和还原反应试剂特点：具有氧化性或还原性.氧化剂：H2O2, N涣代琥珀酰亚胺可被氧化的侧链基团：疏塞，甲巩基，引喙基（Trp）.咪唆 基，酚基寻.还原齐1： 2-疏基乙醇、DTT等.可械还原的侧链基团：二疏键.连四硫酸盐氧化铳基，DTT还原逆回，用于保护毓基。4）芳香环取代反应试剂：卤（碘）化，硝化试剂。碘代：L+

12、硝化:（NO2）4C +（四硝基甲烷）特定氨基酸残基侧链基团的化学修饰令氨基修饰（Lys）竣基修饰（Asp、Glu）许疏基修饰（Cys）弧基修饰（Arg）轻基修饰（Ser、Thr、Tyr） 白咪哇基修饰（His） 盘眄I喙基修饰（Trp） 介甲硫基修饰（Met）二硫键修饰I亲和修饰1) 氨基(一NH/修饰-氨基在酶蛋白中主要是Lys的aNH?和肽链末 端氨基非质子化的oNH?亲核反应活性很高，易被选 择性修饰-一般情况下oNH?的pKa = io,其解离程度取 决于微环境氨基的修饰反应主要有N 烷基化等(dH2 NH； + ICH/?0OFNZ -NHCHXW +1 +IP；(OF：NZ-NH

13、, + RCTl, ENZ-N-CRR(0 KNZ-KH；+乙酰化电荷消失芳基化电荷消失芳基化电荷消失烷基化引入负电荷还原 烷基化引入正电荷芳基化电荷消失CHRR*2）、竣基（一COOH）修饰-竣基在酶蛋白中主要是Asp和Glu的侧链一COOH,以及肽链的末端聂基在水溶液中，一COOH通常解离成负离子，亲核 性降低，对其修饰的方法有限，主要反应为成酯、 成酰胺反应-修饰反应竣基。碳二亚胺反应（竣基修饰的标准方法）3）、蔬基（一SH）修饰疏基在酶蛋白中的来源是tys的#SH-疏基的亲核性强，往往是酶分子中反应活性 最高的基团蔬基容易被氧化成一S-S-,在维持蛋白亚基 之间的相互作用和酶催化过程中

14、起重要作用疏基用烷基化试剂修饰后一般能得到稳定的 修饰产物修饰反应茨基 二硫键置换反应a) DTNB reactionJs ItiB SH12 nmft 有强吸收尹4 nm处 有吸收m；常用于定芒洸定蛋白质分子sh M典目、孙究网的改瓷程度如.SH所处的环境.7g厶Q二硫二毗陀（厶PDS）COOH 5二Md廂祥甲 ft(DTNB) 又称 EllmaniAJMt*oocb) PDS reactionI-修饰反应戏基c) Reacting with /chloromercuribenzoic acid.-*HgSH +PHS /ICOOHI对氯汞苯甲酸(PMB) .d) Reacting with

15、 2-chloromercuri-4-nitrophenorh/ no2HO 人2氯汞心硝基苯酚（MNP）.-SH S”HO可容许低浓度蛋白质的光巧0 nm处有 最大光吸收1与含汞有机物的反应（一SH对Hg的亲和力很强）修饰反应鎌基 。S烷基化反应同时会使氨基乙酰化4）肌基（-N=C（NH2）2）修饰-肌基存在于酶蛋白的Arg残基侧链上-在结合带有阴离子底物的酶的活性部位中起 重要作用肌基碱性强，难以和大多数试剂反应，一般 采用具有两个邻位按基的化合物，在中性或 弱碱性条件下反应，一般是可逆反应讣 a修饰反应弧基（与邻F需在黑暗中进行因其可作为光 臣敏剂破坏TrpHi5Tyr4f残基a) Re

16、acting wrth butanedione丁二割bOHpH 90H|NH2NH?N Cnh211b) Reacting with 1.2yclohexanelioneNH / N=Ct方弋环己二IWpH7T苯乙二醛8c4.3几押彙用化学交联炳NN WXlMftff* 1U25 * 吗豪 *AK% F?AM*分子内交联增加酶分子表面交联键的数目。分子间交联用双功能或多功能试剂使不同的酶交联 起来产生杂合酶。二、内部修饰1. 酶蛋白主链修饰2. 催化基团的修饰3肽链伸展后的修饰1酶蛋白主链修饰酶法：酶原f酶酶蛋白主链修饰（肽链有限水解修饰）利用酶分子主链的切断和连接，使酶分子 的化学结构及其空

17、间结构发生某些改变，从而 改变酶的特性和功能的方法。蛋白主链修饰采用酶法（用专一性较强的蛋白 酶或肽酶为修饰剂）酶蛋白的肽链被水解后，可能出现以下 三种情况中的一种：1. 引起酶活性中心的破坏，酶失去催化功能。2. 仍维持活性中心的完整构象，保持酶活力。3. 有利于活性中心与底物结合并形成准确的催 化部位，酶活力提高。后两种情况，肽链的水解在限定的肽键 上进行，称肽链有限水解。2、催化基团的修饰定点突变：转变氨基酸侧链-氨基酸的置换修饰可以采用化学修饰方法。 例如，Bender等成功地利用化学修饰法将枯草 杆菌蛋白酶活性中心的Ser转换为Cys,修饰后 该酶失去对蛋白质和多肽的水解能力，却出现

18、 了催化硝基苯酯等底物水解的活性，因此可用 于肽的合成。缺点：化学修饰法难度大，成本高，专一 性差，而且要对酶分子逐个进行修饰，操 作复杂，难以工业化生产。3. 肽链伸展后的修饰先用变性剂对酶进行变性处理，再进行修饰， 然后重新折叠成某种活性的构象。Saraswothi等，先让酶变性，然后加入竞争性 抑制剂，待获得所希望酶的构象后，用戊二醛固定， 然后透析除去抑制剂。他们以丙酸作竞争性抑制剂, 把核糖核酸酶制成一种“酸性脂酶”，从而改变了 酶的底物专一性.创造了新的酶活力。三、与辅因子相关的修饰对依赖辅因子的酶的修饰1）、如果辅因子与酶是非共价结合，则可将辅因子 共价结合到酶分子上。2）、引入

19、新的具有强反应的辅因子。迄今最成功的 例子是Kaiser将黄素共价结合在木瓜蛋白酶上， 利用黄素的漠酰衍生物与木瓜蛋白酶的共价结合 成为黄素木瓜蛋白酶，从而将蛋白酶转变成氧化 还原酶。2、金属酶的金属取代可改变酶的专一性、稳定性、抑制作用等。把酶分子中的金属离子换成另一种金属离子，使酶的特 性和功能发生改变的修饰方法称为金属离子置换修饰.通过修饰了解各种金属离子在酶催化过程中的作用，阐 明催化机制适用对象：金UNI (metalloenzyme)一种结合金属的酶，以一个或几个金属离子作为首国子 金属离子或是直接参与催化作用，或杲对保持酶的活性和构 象起稳定作用金屈酶纯化时仍保留着定直的功能金屈

20、离子常见的金属酶及其离子种类a淀粉酶一Ca叭 Mg叭Znl* 谷氨酸脱氢酶一ZV过氧化氢酶Fe2+酰基氨基酸酶一Zn-超氧化物歧化酶一CuJ Zna* 细胞色素P45。单加氧酶一V 固氮酶一Fe(ll)、Mo(IV) 谷胱甘肽过氧化物酶 一Se(IV)主要的金属离子Cvt P45001AOKCa、Mg、Cu、Zn、Co、Fe、Mn 等金属离子置换修饰的方法酶的提纯除去原有金属离子加入金属盛合剂,如EDTA尊，让酶分子中的金 属离子与EDTA形成螯合物透析、超滤或层析除去整合物，加入置换的离子加入含另一种金属离子的溶液，酶蛋白与其结合用透析或层析等方法除去未结合的离子金属离子置换修饰的作用。阐明

21、金属离子对酶催化作用的影响一般在活性中心的金属离子能与底物或辅酶/辅基可 逆结合，从而起到催花作用。提高酶的催化效率将Zn型o淀粉酶置换成Ca型，活力可提高20% 30%。增强酶的稳定性Fe-SOD置换成Mn-SOD后稳定性增强对Na叫敏感 性降低。改变醉的动力学特性Zn H都四.物理修饰酶分子的物理修饰通过各种物理方法，使酶分子的空间构象发生 某些改变，从而改变酶的某些特性和功能的方 法研究极端条件下酶结构和活性的变化物理修饰的特点不改变酶的组成单位及其基团酶分子中的共价键不发生改变一酶的一级结构 不变副键发生某些改变和重幷一酶的高级结构发生 变化-物理修饰的效果。改变底物特异性例：竣肽酶卩

22、经高压处理，其水解能力降低，而 有利于催化肽的合成反应（逆反应）改变酶催化的最适温度例：纤维素酶经高压处理，最适温度下降，但在3。4。C条件下，活力提高了丄。提高酶的稳定性例：用盐酸肌破坏胰蛋白酶的空间构欽，伸展肽 链，再透析除去盐酸肌，在不同温度下重新构建/ 恢复酶的构彖，5。C下更新构建的酶稳定性比天 然酶提高5倍4.4、修饰酶性质的变化及原因散适pH*I 1r喪稳定竹半衰期修饰酵的酶学性质变化对组织的 分布能力变化PEG修1、增强酶天然构象的稳定性与耐热性 酶形成多織曲擁勰于PE爲瞬讓|上没有明显提高可能由酶分子内基团间相互隹用在受热憤况下发生 了变化，向热力学上嫡增加的方咼变化，即 从紧密克序趋于随机松散。通过修饰后，使 心需r爲增强酶减鹤針开2、保护酶活性部位与抗抑制剂大分子修饰剂与酶结合后，产生的 空间障碍或静电斥力阻挡抑制剂.“遮 盖” 了酶的活性部位。3如何维持酶功能结构的完整性与抗蛋 白水解酶酶化学修饰后通过两种途径抗蛋白水解 酶：A大分子修饰剂产生空间障碍阻挡蛋白 水解酶接近酶分子。“遮盖”酶分子上敏感键 免遭破坏。B酶分子上许多敏