药理学实验方法

1、药理学实验方法1药理学实验方法药理学实验方法第讲第讲实验动物的选择实验动物的选择在药理学实验中，要根据实验目的，选择不同动物，常用动物有：在药理学实验中，要根据实验目的，选择不同动物，常用动物有：、青蛙和蟾蜍、青蛙和蟾蜍心脏（离体、在体）实验心脏（离体、在体）实验, 制备坐骨腓肠标本等。制备坐骨腓肠标本等。、小白鼠：、小白鼠：药物初筛：镇痛、耐缺氧、抗肿瘤药物、药物初筛：镇痛、耐缺氧、抗肿瘤药物、LD测定、避孕药实验等。测定、避孕药实验等。、大白鼠：、大白鼠：抗炎作用，大白鼠踝关节肿胀实验，抗炎作用，大白鼠踝关节肿胀实验，血压测量，胆管插管等。血压测量，胆管插管等。长期性毒性试验。长期性毒性试

2、验。、豚鼠：、豚鼠：对组胺敏感，并易于致敏，常用抗过敏药（平喘药、抗组胺药）实验。离体对组胺敏感，并易于致敏，常用抗过敏药（平喘药、抗组胺药）实验。离体心房、心脏、肠管实验等。心房、心脏、肠管实验等。豚鼠对结核菌也敏感，也用于抗结核病药物实验。豚鼠对结核菌也敏感，也用于抗结核病药物实验。5、兔：兔：家兔易得家兔易得， 驯服驯服， 便于静脉注射和灌胃便于静脉注射和灌胃， 常用于观察药物对心脏的作用和对常用于观察药物对心脏的作用和对 CNS的作用。的作用。又由于其体温变化较敏感，也常用于体温实验及热原检查。又由于其体温变化较敏感，也常用于体温实验及热原检查。家兔也常用于避孕药实验。家兔也常用于避孕

3、药实验。6、猫：猫：猫的血压比较稳定，具有咳咳嗽反射和呕吐动作。因而常用于心血管药物实猫的血压比较稳定，具有咳咳嗽反射和呕吐动作。因而常用于心血管药物实验和镇咳药、镇吐药实验。验和镇咳药、镇吐药实验。7、狗：狗：狗的血压比较稳定，常用于降压药、升压药和抗休克药实验。狗的血压比较稳定，常用于降压药、升压药和抗休克药实验。狗比较容易驯服，最适用于慢性实验。手术造瘘（胃、肠）以便观察药物对胃狗比较容易驯服，最适用于慢性实验。手术造瘘（胃、肠）以便观察药物对胃肠蠕动和分泌的影响。肠蠕动和分泌的影响。此外，长期毒性实验也常用狗来进行。此外，长期毒性实验也常用狗来进行。* 附附:给药途径及剂量限制给药途径

4、及剂量限制1.小白鼠小白鼠（1）灌畏法灌畏法:0.10.25ml10g 体重。体重。（2）皮下注射：皮下注射：0.10.3ml10g 体重。体重。（3）肌肉注射：肌肉注射：0.2ml每侧。每侧。（4）腔注射：腔注射：0.10.25ml10g 体重。体重。（5）静脉注射：静脉注射：0.050.1ml10g 体重。体重。1.大白鼠大白鼠（1）灌畏法灌畏法:2.0ml10og 体重。体重。3.0ml/只。只。（2）腔注射：腔注射：0.10.25ml10g 体重。体重。第二讲第二讲实验动物的麻醉和处死实验动物的麻醉和处死一、各种实验动物的麻醉药物和麻醉方法各种实验动物的麻醉药物和麻醉方法药理学实验方法

5、21、乙醚、乙醚乙醚为挥发性麻醉药。常用于小动物（小鼠）的麻醉。使用方法有：开放乙醚为挥发性麻醉药。常用于小动物（小鼠）的麻醉。使用方法有：开放发和封闭法。发和封闭法。2、戊巴比妥钠戊巴比妥钠戊巴比妥钠的作用稳定、麻醉持续时间中等戊巴比妥钠的作用稳定、麻醉持续时间中等(一次给药可维持作用一次给药可维持作用 24hr)，一般实验均可使用。，一般实验均可使用。常用其常用其 3% 溶液。溶液。各种动物所用剂量如下：各种动物所用剂量如下：狗：狗：30mg/kg，iv猫、兔：猫、兔：3040mg/kg，iv 或或 ip大鼠、小鼠：大鼠、小鼠：4050mg/kg，ip3、乌拉坦乌拉坦乌拉坦的作用较弱乌拉坦

6、的作用较弱，对呼吸的抑制作用小是其优点对呼吸的抑制作用小是其优点。是动物实验常用的是动物实验常用的麻醉药。麻醉药。各种动物所用剂量如下：各种动物所用剂量如下：家兔、大鼠：家兔、大鼠：1.01.5 g/kg，iv 或或 ip4、氯醛糖氯醛糖氯醛糖对血压和神经反射影响较小，适用于心血管实验。氯醛糖对血压和神经反射影响较小，适用于心血管实验。但其溶解度小，常用浓度为但其溶解度小，常用浓度为 1% 。动物所用剂量如下：动物所用剂量如下：狗狗、猫猫：80100mg./kg，iv 或或 ip。常与戊巴比妥钠或乌拉坦合用常与戊巴比妥钠或乌拉坦合用，合用时应减合用时应减少剂量。少剂量。二、动物的处死动物的处死

7、（一）乙醚吸入法乙醚吸入法小鼠、大鼠：吸入乙醚后小鼠、大鼠：吸入乙醚后 2030 秒钟进入麻醉壮态，秒钟进入麻醉壮态，35 分钟死亡。分钟死亡。鸽、猫等较大动物也可用次法处死。鸽、猫等较大动物也可用次法处死。但需注意以下两点：但需注意以下两点：1当用次法处死豚鼠时，脑和肺部可出现小出血点，在进行病理解当用次法处死豚鼠时，脑和肺部可出现小出血点，在进行病理解剖时要特别注意。剖时要特别注意。2焚烧动物尸体时要注意防止火灾发生。焚烧动物尸体时要注意防止火灾发生。(二)二氧化碳吸入法二氧化碳吸入法可将动物装入减压干燥器或塑料袋内可将动物装入减压干燥器或塑料袋内，通以通以 CO2，可在本可在本 30 秒

8、秒3 分钟分钟内杀死动物。内杀死动物。豚鼠、猫、鸽等均可用此法处死。豚鼠、猫、鸽等均可用此法处死。（三）注射麻醉法注射麻醉法常用药物为巴比妥钠，各种动物所需剂量如下：常用药物为巴比妥钠，各种动物所需剂量如下：鸽：鸽：100mg/kg，ip。猫：猫：60120mg/kg，iv 或或 ip。药理学实验方法3狗：狗：100mg/kg，iv。兔：兔：75100mg/kg，iv。（四）颈椎脱臼法颈椎脱臼法此法常用于小白鼠的处死。此法常用于小白鼠的处死。（五）空气栓塞法空气栓塞法将空气注入静脉或心腔内造成栓塞。各种动物所需剂量如下：将空气注入静脉或心腔内造成栓塞。各种动物所需剂量如下：兔、猫：兔、猫：10

9、20ml/只。只。狗：狗：70150ml/只。只。（六）心脏取血法心脏取血法豚鼠、猴可用此法。豚鼠、猴可用此法。（七）大量放血法大量放血法兔、猫、猴、狗等可用此法。兔、猫、猴、狗等可用此法。（八）电击法电击法220 V 交流电，接上粗针头，一头插入颈部皮下，一头插入腰部皮下，交流电，接上粗针头，一头插入颈部皮下，一头插入腰部皮下，通以电流。通以电流。第三讲第三讲药理学实验设计药理学实验设计第一节第一节 药理学实验设计的基本要求药理学实验设计的基本要求实验设计的三大原则实验设计的三大原则重复，随机，对照。重复，随机，对照。（一）重复重复影响因素设法控制：影响因素设法控制：1、动物：品种、体重、年

10、令、性别、饲养条件。动物：品种、体重、年令、性别、饲养条件。2、药物：批号、纯度、剂量、注射容量、速度。药物：批号、纯度、剂量、注射容量、速度。3、仪器：灵敏度、精确度、电压稳定性。仪器：灵敏度、精确度、电压稳定性。4、其它：室温、气压、季节、上、下午。其它：室温、气压、季节、上、下午。条件控制越严格条件控制越严格，重复性越高重复性越高，但样品的代表性越差但样品的代表性越差，这是一个不可避免的这是一个不可避免的矛盾。一般先严后松，逐渐扩大实验范围。矛盾。一般先严后松，逐渐扩大实验范围。（二）随机随机随机分组的目的随机分组的目的，使各组间不受主观因素的影响使各组间不受主观因素的影响，方法方法：编

11、号抽签或随机数字表编号抽签或随机数字表法法。 目前主张目前主张“均衡下的随机均衡下的随机”，即先将主要因素即先将主要因素（体重体重， 性别等性别等）均衡归类均衡归类分档，再将难控制的因素（活泼程度分档，再将难控制的因素（活泼程度 饥饱程度饥饱程度 疲劳程度疲劳程度 性周期性周期）随机安）随机安排。排。（三）对照对照1、阴性对照（空白对照）阴性对照（空白对照）N.S.药理学实验方法42、阳性对照（标准品组），目的是查明：、阳性对照（标准品组），目的是查明：（1）实验条件是不是发生了改变。实验条件是不是发生了改变。（2）判断和对比试药的作用。判断和对比试药的作用。注意：注意：（1） 同时，同地，同

12、条件下进行对照。同时，同地，同条件下进行对照。（2）统计学指出：实验组与对照组例数相等时最节省动物。因此，对照组使用）统计学指出：实验组与对照组例数相等时最节省动物。因此，对照组使用较少动物是不妥当的。较少动物是不妥当的。第二节第二节 预试与筛选预试与筛选（一）预试预试目的：了解各种因素对实验的影响，找出最适当的用药计量，最适实验条件（温目的：了解各种因素对实验的影响，找出最适当的用药计量，最适实验条件（温度，刺激强度，营养液配方度，刺激强度，营养液配方）。为正式实验提供必要的准备。）。为正式实验提供必要的准备。应注意的问题：应注意的问题：1.实验的稳定性：用变异系数衡量。实验的稳定性：用变异

13、系数衡量。S变异系数变异系数CV=X变异系数越小，可重复性越强。变异系数越小，可重复性越强。列如：列如：某降压药降压结果为某降压药降压结果为:30 5 mm Hg (猫猫)25 9 mm Hg (兔兔)变异系数变异系数CV(猫猫)= 5/30 =16.7%CV(兔兔)= 9/25 = 36%因此因此,做降压药实验用猫较兔为好。做降压药实验用猫较兔为好。2 .实验灵敏性：用因变系数衡量。实验灵敏性：用因变系数衡量。E2E1因变系数因变系数 CI = ，log D2log D1可反映出实验的灵敏度。可反映出实验的灵敏度。D1D2为两个不同剂量。为两个不同剂量。E1E2为两个不同反应强度。为两个不同

14、反应强度。例如，某利尿药水负荷实验结果如下表：例如，某利尿药水负荷实验结果如下表：负荷水种类负荷水种类利尿药剂量利尿药剂量尿量尿量生理盐水生理盐水2.0 mg/kg12.4 ml(A)4.0mg/kg19.6 ml自来水自来水2.0mg/kg15.6 ml(B)4.0mg/kg20.9 ml药理学实验方法519.6 12.4CIA= 23.9log 4 log 220.9 15.6CIB= 17.6log 4 log 2从以上实验结果应可以看出，本实验应该使用生理盐水作负荷剂。从以上实验结果应可以看出，本实验应该使用生理盐水作负荷剂。（二）（二） 筛选筛选是在预试或以往经验的基础上是在预试或以

15、往经验的基础上，用少量动物对多种药物进行实验用少量动物对多种药物进行实验。筛选筛选常在已知反应率的基础上进行，一般以常在已知反应率的基础上进行，一般以 P0.1 作为筛选合格的标准。作为筛选合格的标准。1、保护实验：保护实验：筛选解毒药时筛选解毒药时， 将解毒药将解毒药+毒物量毒物量 （LD50） ， 如连用如连用 4 只动物均不死亡只动物均不死亡，表明该药有一定解毒作用（表明该药有一定解毒作用（P 0.1）,如一只死亡，再加三只，如三只均无如一只死亡，再加三只，如三只均无死亡死亡，也认为筛选合格也认为筛选合格。总之总之，死亡率为死亡率为 0/4、1/7、2/9、3/12、4/14 时都可时都

16、可认为合格（认为合格（P 0.1）。）。药理学实验方法62.阳性率判别实验：阳性率判别实验：筛选实验结果筛选实验结果阳性率判别（阳性率判别（%）筛选实验结果筛选实验结果阳性率判别（阳性率判别（%）0/21/42/6702/23/44/6300/31/52/7603/34/55/7400/41/72/9504/46/77/9500/51/92/12405/58/910/12600/61/11 2/15326/610/1113/15680/71/12 2/16307/71/1214/1670例如：例如： 欲筛选疗效在先欲筛选疗效在先 60%以上药物，如以上药物，如连续连续 3 只均无效，该药即可筛

17、弃，如连续只均无效，该药即可筛弃，如连续 5 只均有效，筛选合格。错误筛选率只均有效，筛选合格。错误筛选率10%。第第 3 节节实验设计中样本数问题实验设计中样本数问题(一一) 一般情况下选取的样本数：一般情况下选取的样本数：（1）小动物（小鼠、大鼠、鱼、蛙）：每组小动物（小鼠、大鼠、鱼、蛙）：每组 1030 例，计量资料每组不少于例，计量资料每组不少于 10 例，计数例，计数资料每组不少于资料每组不少于 30 例。例。（2）中等动物（兔、豚鼠）：每组中等动物（兔、豚鼠）：每组 812 例。计量资料每组不少于例。计量资料每组不少于 6 例，计数资料每组不例，计数资料每组不少于少于 20 例。例

18、。（3）大动物（犬、猫、猴、羊）：每组大动物（犬、猫、猴、羊）：每组 515 例。例。（二）按统计学原则测算样本数量（达到按统计学原则测算样本数量（达到 P 0.05）(1)两组均数对比（计量资料）两组均数对比（计量资料）s95% 把握时，把握时，N = 26 (- )2+ 1.4x1- x2S90% 把握时，把握时，N = 21 (- )2+ 1.5x1- x2S80% 把握时把握时, N = 15.6 ( - )2+ 1.6X1-X2N 为每组估计例数为每组估计例数, 总例数为总例数为 2 N。X1- X2为原均数之差为原均数之差(预试所得结果预试所得结果)。S 为原来两组总标准差。为原来

19、两组总标准差。（N1- 1）S12+ （N2- 1）S22药理学实验方法7S =N1+N2- 1S1+S2或近似为：或近似为：S -2例如某次预试，每组用例如某次预试，每组用 10 只动物，所得结果为只动物，所得结果为 :甲组甲组X S= 23.8 8.8,乙组乙组X S= 18.8 6.4。 按按 80%把握把握,要要 p0.05 效果效果,问各组应该用多问各组应该用多少例少例?解解:X1- X2= 23.8 - 18.8 = 58.8 + 6.4S = - = 7.627.6N = 15.6 ( - )2+ 1.6 = 37.65即即,每组每组 38 例例,共共 76 例。例。（2）计数资

20、料（百分率为指标）对比计数资料（百分率为指标）对比1 （p1+ p2 1）2N = R ( p1 p2)2R 值可查表：值可查表：质反应两组对比质反应两组对比 R 值值把握度把握度80%90%95%p = 0.053.925.256.52P = 0.015.867.458.95如要求把握度为如要求把握度为 80%，达到，达到 P0.05 水平水平 , R = 3.92例如例如: 已知已知 A 药平喘率为药平喘率为 90%, B 药平喘率为药平喘率为 60% , 欲求欲求 80% 把握把握， 取取 P 20%，或或 Pm 80%则不能使用此法。则不能使用此法。药理学实验方法13（五）测定（五）测

21、定 LD50应注意的问题应注意的问题1分组的随机性：各组动物在性别、体重、等要保证均匀一致性。分组的随机性：各组动物在性别、体重、等要保证均匀一致性。2动物及数量：常用小鼠，体重动物及数量：常用小鼠，体重 202g，雌雄均可。正式实验每组，雌雄均可。正式实验每组 1020 只。只。3剂量应按几何级数排列：临近两组剂量比一般为剂量应按几何级数排列：临近两组剂量比一般为 1：0.70.85。测定新药时先将剂距加大（。测定新药时先将剂距加大（1：0.30.5）,初步找出死亡率为初步找出死亡率为 0%和和 100%的剂量。的剂量。4给药途经：以给药途经：以 IV.IP.PO.为主。其中必须包括临床推荐

22、给药途径。为主。其中必须包括临床推荐给药途径。5 容量限制容量限制： 不管哪种途径给药不管哪种途径给药， 小白鼠的给药容量不能超过小白鼠的给药容量不能超过 0.2ml/10g。 灌胃以不超过灌胃以不超过 0.3 ml/10g为限。为限。6观察时间：动物一般在两日内死亡，但应观察观察时间：动物一般在两日内死亡，但应观察 7 天。同时记录其他反应。天。同时记录其他反应。（六）等比溶液的配制（六）等比溶液的配制1。相邻两组剂量比为。相邻两组剂量比为 1：r ，如，如 r = 0.852设每组所用药液总量为设每组所用药液总量为 d, 如每组如每组 10 只小鼠只小鼠,每鼠注射药液每鼠注射药液 0.5

23、ml , 共需共需 5ml，为留有余地，为留有余地，并使并使 d 能被能被 1- r 正除，可取正除，可取 d = 6 ml。3设上限组（设上限组（1 号液）浓度为号液）浓度为 C，整个实验所需浓度为，整个实验所需浓度为 C 的药液总量为的药液总量为 D，则：，则：mlXrD40114取出取出 d 量量(6ml)为为 1 号液号液, 余量加水余量加水 d 至至 D, 再取再取 d 量为量为 2 号液。号液。5余量加水余量加水 d 至至 D, 再取再取 d 量为量为 3 号液。号液。6余量加水余量加水 d 至至 D, 再取再取 d 量为量为 4 号液。号液。7余量加水余量加水 d 至至 D, 再

24、取再取 d 量为量为 5 号液。号液。8.，.计算计算 LD50公式的来源（公式的来源（Karber 氏法）氏法）)5 . 0()(21150iKiiKPdXpPdXLogLD此证明详见公式演变部分。可据对数剂量与死亡率的关系曲线通过面积法求出此公式。此证明详见公式演变部分。可据对数剂量与死亡率的关系曲线通过面积法求出此公式。XiFXKBXG0 A50 H100 DEC（log LD50）P药理学实验方法14d上图横坐标为对数剂量上图横坐标为对数剂量x, 纵坐标为死亡率纵坐标为死亡率（P） ， G 为正为正 S 形曲线中点形曲线中点，它对应的纵坐标它对应的纵坐标 H 点点 P = 50%(0.

25、5)，横坐标的横坐标的 F 点点 X = LgLD50；A 点点 P = 0， D 点点 P = 1，B 点点 Xk 为为 P = 100%时的对数剂量，由图可知：时的对数剂量，由图可知：矩形矩形 AFED = AF . AD = LgLD50 1 = LgLD50曲边曲边XiFG = GCE （三边对应相等）（三边对应相等）矩形矩形 AFED =曲边形曲边形 AXiCD = LgLD50则则 LgLD50= 矩形矩形 AXKCD 曲边形曲边形 XiXKC1曲边形曲边形 X1XKC =d （pi pi +1）-相当于多个梯形面积的总和。相当于多个梯形面积的总和。2又矩形又矩形 AXKCD =

26、AXK. AD = XK 1 = XK1LgLD50= XKd （ pi+ pi + 1）2上述推导过程可用直观图形表示上述推导过程可用直观图形表示:LgLD50=公式的演变公式的演变1LgLD50= XKd (PiPi1)21= XKd （P1P2） （P2P3） （PK - 2+ Pk 1）+（Pk - 1+ Pk）21= XKd P1P2P2P3PK2+ Pk1+Pk1+ Pk21= XKd2Pi（P1Pk）2= XKd （pi 0.5）P1 =0%；Pk= 100%（1.0）LD50简化测定方法简化测定方法计算公式计算公式:)5(150dDLogaAaLogdLogLD药理学实验方法1

27、5D高剂量组剂量高剂量组剂量 (mg, g/kg).d.低剂量组剂量低剂量组剂量 (mg, g/kg).A.高剂量组死亡率的机率单位高剂量组死亡率的机率单位.a.低剂量组死亡率的机率单位低剂量组死亡率的机率单位.例如例如, 用灌胃法测定某药的用灌胃法测定某药的 LD50, 结果如下：结果如下：高剂量（高剂量（D=120mg/kg）组，）组， 死死 17 只，只， 活活 3 只，死亡率只，死亡率 = 85%，查表，查表, 机率单位机率单位 A = 6.03;低剂量（低剂量（d=100mg/kg）组，）组， 死死 8 只，只， 活活 12 只，死亡率只，死亡率 = 40%，查表，查表, 机率单位机

28、率单位 a = 4.75;kgmgLogLogLogLD/12.103)10012075. 403. 675. 45100(150附：中草药毒性实验附：中草药毒性实验由于中草药毒性低，有部分中草药的由于中草药毒性低，有部分中草药的 LD50不能测出，常测其最大耐受量。不能测出，常测其最大耐受量。本法取体重本法取体重 1822g 的健康小鼠，雌雄各半，随机分几组，每组动物灌服不同浓度的健康小鼠，雌雄各半，随机分几组，每组动物灌服不同浓度的受试药物一次的受试药物一次，每只每只 0.5ml，观察观察 7 天内动物的中毒反应或有无死亡天内动物的中毒反应或有无死亡。以死亡为主要观以死亡为主要观察指标察指标。如有死亡如有死亡，则以刚不出现死亡组为准则以刚不出现死亡组为准，此时的用药量即为小鼠的最大耐受量此时的用药量即为小鼠的最大耐受量。然然后按公式计算出耐受量倍数。以耐受人用量口服后按公式计算出耐受量倍数。以耐受人用量口服 100 倍以上为安全。倍以上为安全。计算公式如下：计算公式如下：成人每日用量）（成人平均体重）小鼠平均体重（毎只