胎肾细胞悬液对骨质疏松大鼠下丘脑ERα表达影响的实验研究

1、胎肾细胞悬液对骨质疏松大鼠下丘脑ER表达影响的实验研究    摘要：目的 研究胎肾细胞悬液对骨质疏松大鼠下丘脑ER表达的影响。方法 取未交配健康SD雌性大鼠56只，随机分为4组,即A、B、C、D组。A组行假手术,B、C、D组行OVX手术。术后8周,A、B组给予生理盐水,C组给予苯甲酸雌二醇,D组给予胎肾细胞悬液。药物治疗4周后,通过观察骨组织形态学判断骨代谢发生的变化；用放免法检测血清E2，GH水平；用免疫组化和RT-PCR法观测ER在下丘脑的表达。结果 与A组比较，B组大鼠骨小梁稀疏，排列紊乱，骨小梁间隙明显增大,ER表达及血清E2、GH水平明显下降；

2、与B组相比, C、D组E2水平增高，ER表达及血清GH水平随之上升；C组与D组比较，ER表达及血清激素水平无明显差异。结论 肾虚骨质疏松症的病理机制为肾精不足，骨髓，脑髓失养，表现在下丘脑垂体生长激素轴的调控失常，胎肾细胞悬液具有类激素样作用，可能通过神经内分泌代谢系统调节骨代谢。关键词 胎肾细胞悬液 下丘脑 雌激素受体 骨质疏松 Effects of fetal renal cell suspension(FRCS) on expression of estrogen receptor(ER)in hypothalamus DA Chenxing, xi,an 710021 , Z

3、HENG Qinglian, xi,an 710061, Wang Yuqiang, tian jing 300162 , ChinaAbtract: Objective To investigate the effects of fetal renal cell suspension(FRCS) on expression of estrogen receptor(ER)in hypothalamus. Methods Fifty six female SD rats were divided randomly into four groups: SHAM group(group A),OV

4、X group（group B）,OVX+E group(group C),and OVX+ FRCS group(group D).Eight weeks after operation, the rats in group A and group B were treaded with sodium chloride, the group C was treated with estrogen, the group D was treated with FNCS. All of the rats were sacrificed after four weeks.The changes in

5、 bone metabolism were judged by the bone tectology. Immunohistochemistry and RT-PCR methods were used to observer the changes in the expression of ER-.Radioimmunoassay was performed to detect the serum levels of growth hormone and estrogen. Results: Compared with group A, the form of bone trabecula

6、is sparser and mussier and trabecula separation is wider in group B ,meanwhile the expression of ER,and serum levels of incretion was decreased. Compared with group B, estrogen was increased in group C、D, meanwhile the expression of ERand the level of growth hormone were increased. No difference was

7、 shown between group C and group D. Conclusion: Deficiency of kidney-essence resulting in the non-nourishing of marrow and brain as the pathologic mechanism of kidney deficiency type osteoporosis could be revealed, showed as the abnormal regulation of hypothalamus-pituitary-GH core, FRCS can regulat

8、e bone metabolism from neural internal secretion system.Key word FRCS hypothalamus ER Osteoporosis0 引言胎肾属动物类补肾中药，前期从骨转化生化方面，骨形态计量学，骨密度，骨矿含量和骨生物力学等角度研究了胎肾细胞悬液防治绝经后骨质疏松（OP）的机理机制1,2。本实验根据“肾藏精，精生髓，髓充于骨，汇聚为脑”即肾-髓海(脑髓)-骨(骨髓)密切相关的理论，采用去势大鼠骨质疏松的经典模型，以胎肾细胞悬液为试剂，研究补肾药对骨代谢的影响与下丘脑雌激素受体、生长激素水平之间的关系，是探讨“肾主骨”理论的神经

9、内分泌代谢网络可行而有效的途径。1、  材料和方法1.1实验动物与分组3月龄未交配健康SD雌性大鼠60只,体重(310±20)g,孕19-21天SD大鼠,普通级，均由西安交通大学医学院动物中心提供。所有实验动物饲养条件一致。1.2 药物 胎肾细胞悬液制备:按照文献3:将孕19-21天同种SD母鼠,脱臼处死,无菌取出胎肾,去除肾包膜、肾蒂,并将其剪碎,移入200目尼龙网,用5mL注射器针芯研磨,边研磨,边用生理盐水冲洗,收集细胞悬液。苯甲酸雌二醇:西安化学试剂厂生产,生理盐水稀释配成0.25mg/mL溶液。1.3主要仪器设备及试剂雌激素(E2)、生长素（GH）放免试剂盒均购自

10、天津九鼎医学生物工程有限公司。 ER一抗，二抗，免疫组化染色试剂盒、DAB显色试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司。引物由陕西先锋生物有限公司设计并合成,ER其上下游引物序列分别为5-CGCCGCCTACGAGTTCAAC-3, 5-TCGCTGCTGCTGGAGAGTC-3,扩增的基因片段长度为354bp,-actin为内对照。其上下游引物序列分别为5-ACTATCGGCAATGAGCGGTTCC-3, 5-CTGTGTTGGCATAGAGGTCTTTACG-3,扩增的基因片段长度为148bp。Taq酶为北京鼎国生物有限公司, TaKaRa Reverse Transcriptanse M-

11、MLV，Trizol均为上海Sagaon生物工程公司产品提供。1.4模型的建立 将56只大鼠随机分为2组, 其中一组14只为假手术组（A）,另一组46只为造模组。参照文献4建立去卵巢骨质疏松模型。1.5 动物分组及给药术后1周,将造模组存活的健康大鼠42只称重后,随机分为模型组14只(B)、雌激素组16只(C)、胎肾组16只（D），术后8周开始给药，A、B组予理盐水按2 mL/kg尾静脉注射,C组按0.1mL/kg苯甲酸雌二醇剂量肌注 ,D组按2 mL/kg剂量，尾静脉注射胎肾细胞悬液。各组每周2次，连续干预处理4周。1.6 指标测定及主要实验方法激素水平测定：动物麻醉后，由右心室抽取血液 8

12、-10mL，离心分离血清，放免法测定E2 ，GH水平。骨组织形态学观察：取大鼠左侧股骨远端1/3，HE染色观察骨形态学变化。 大鼠下丘脑ER表达检测：各组大鼠中随机选取8只做免疫组织化学。采用左心室灌注固定法取材，完整剥离出大鼠脑组织，截取由视角叉至乳头体一段脑组织，经固定，脱水，浸蜡，包埋后，冠状面连续切片，每只动物挑选1张切片，S-P法做免疫组化，在10×40高倍视野下观察ER的阳性表达，每张切片随机选取5个视野应用倒置显微镜观察并拍照，并利用Motic Med 6.0数码医学图像分析系统进行阳性目标积分光密度分析。 大鼠下丘脑ER-mRNA表达检测：RT-PCR法取下丘脑组织，

13、按照TRIZOL方法说明书提取RNA。紫外分光光度计下测定，A280/A260RNA的比值鉴定总RNA纯度，均在1.72.0之间，并行琼脂糖凝胶电泳鉴定总RNA完整性；取1g总RNA逆转录为cDNA，然后进行PCR反应；在反应体系中加入反转录产物，dNTP，Taq酶，上游引物和下游引物，对ER-、-actin进行同管扩增，扩增条件：94预变性,2min, 94变性,30S，退火57,30S，延伸72,1min,共扩增30个循环，然后72延伸10min停止反应。扩增产物于1.5琼脂糖凝胶电泳，紫外线下拍照。并用Hema凝胶成像分析系统行条带OD值检测，计算目标带与内参的OD比值并记录。1.7 统

14、计学分析处理 所有数据均以均数±标准差( )表示,采用SPSS 13.0统计软件进行多组间单因素方差分析，两两间比较用LSD法。2 结果2.1 胎肾细胞悬液对骨组织形态学结构的影响 光镜下HE染色切片可见假手术组骨小梁联结成网，排列整齐，骨小梁间隙较小。与假手术组比较，模型组空白组骨小梁稀疏，排列紊乱，间隙增大。胎肾组和雌激素组骨小梁连接成网，排列整齐，与假手术组比较骨小梁间隙较大，与模型空白组比较骨小梁间隙明显缩小，与雌激素阳性对照组比较，无显著性差异。 2.2 各组大鼠血清激素水平( ) 与假手术组比较，模型组血清E2 ，GH明显降低（P<0.01），雌激素组可以提高去卵巢

15、大鼠E2 ，GH水平（P<0.01），胎肾组亦能提高去卵巢大鼠E2 ，GH水平（P<0.01），与雌激素组比较，胎肾组与其无显著差异（P>0.05）。见表1表1 各组大鼠血清激素水平 n=14                项目            假手术组(A)   

16、         去势组(B)            雌激素组(C)            胎肾组(D)              

17、;      E2（pmol/l）            390.552 119.65            86.143 14.094            183.216 34

18、.955            154.302 13.437                    GH(ug/l)            3.249 0.71

19、9            2.148 0.229            3.102 0.271            3.012 0.587        &#

20、160;    2.3胎肾细胞悬液对下丘脑ER表达的影响( ) 见附图一ER阳性细胞呈棕黄色，模型组下丘脑ER显著低于假手术组（P<0.01），给予雌激素和胎肾细胞悬液后ER水平增高（P<0.05），与雌激素组比较，胎肾组与其无显著差异（P>0.05）。见表2 表2 各组大鼠下丘脑ER免疫反应阳性目标击分光密度分析 n =8                项目  

21、60;         假手术组（A）            去势组(B)            雌激素组(C)            胎肾组(D)&

22、#160;                   ER                              

23、;                               2.4 胎肾细胞悬液对下丘脑ERmRNA表达的影响 见附图二PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后ERmRNA分别于354bp（ER），148bp（-actin）见到条带，与设计引物相符。半定量RTPCR分析，模型组下丘脑ERmRNA显著低于假手

24、术组（P<0.01），给予雌激素和胎肾细胞悬液后ERmRNA水平增高（P<0.01），与雌激素组比较，胎肾组与其无显著差异（P>0.05）。 见表3 表3 各组大鼠下丘脑ERm RNA表达水平分析 n=6                项目            假手术组（A）  

25、          去势组(B)            雌激素组(C)            胎肾组(D)             

26、;       ERm RNA            1.529 0.48102            0.761 0.237            1.497 0.52

27、68            1.45633 0.528             3 讨论本实验证明，胎肾细胞悬液能够明显提高血清E2 、GH水平，以及 ER在下丘脑的表达，从而增强神经内分泌调节系统功能，改善OP的病理状态，其作用机理，根据目前国内成果分析可能与以下因素有密切关系。下丘脑是重要的神经内分泌中枢，能够合成分泌多种神经递质和肽类物质，对骨的生长，

28、代谢亦具有重要作用。免疫组化方法显示大鼠下丘脑广泛分布有雌激素受体免疫反应物(ER immunoreactivity, ER-IR)5，存在ER、ER两种类型，雌激素主要通过与ER结合发挥作用。本实验发现，去势大鼠E2水平明显下降，下丘脑ER表达随之减少。可能由于卵巢切除造成E2缺乏，无法调节ER的生物合成,导致受体下调或退用性萎缩,最终引起功能异常6。给予雌激素和胎肾细胞悬液后，ER含量明显增加，与雌激素组比较，胎肾组与之无显著差异，说明胎肾细胞悬液具有“类激素”样作用。此外，实验结果显示，大鼠去卵巢后与假手术组比较，血清中GH水平明显下降，给予雌激素和胎肾细胞悬液后，GH水平升高。其原因可

29、能是下丘脑ER能够诱导GH的分泌。大量动物实验提示，雌激素能够改变成年动物神经元结构7。生长素释放激素神经元主要集中于下丘脑，其神经纤维伸入正中隆起，对垂体前叶GH的合成及分泌进行精细的调节。而大部分生长素释放激素神经元内含雌激素受体，是雌激素在下丘脑的靶细胞之一8。去卵巢后大鼠GH水平明显下降，推测由于去卵巢后E2水平降低，造成生长素释放激素神经元中的ER减少，使生长素释放激素的靶细胞水平下降，从而导致腺垂体细胞分泌GH减少9。而GH对骨的生长、代谢及骨量维持具有重要作用。其不仅能够直接刺激成骨细胞的增殖、分化，同时也能促进破骨细胞的活性，亦可通过诱导肾(或肝)脏自分泌或旁分泌胰岛素生长因子I的合成，作用于成骨细胞和骨细胞,促进胶原和硫酸软骨素的合成及沉积。综上所述，本实验中胎肾细胞悬液能够明显改善去势大鼠骨质疏松模型的病理状态，与苯甲酸雌二醇效果相似，推论其机制，可能为胎肾细胞悬液具有类激素样作用，通过提高下丘脑ER的表达水平，影响下丘脑-垂体-生长激素轴，刺激GH分泌，进而调节骨代谢。可见，胎肾细胞悬液既可以直接作用于骨组织,亦可以通过调节下丘脑神经内分泌系统间接作用于骨，构成相互制约，极其复杂的调节系统。同时也将中医理论中的肾，脑，骨，生殖有机的结合起来，使中医理论的现代科学内涵被不断地揭示和丰富。参 考 文 献1