脑缺血再灌注损伤中医动物实验研究进展(一)

1、脑缺血再灌注损伤中医动物实验研究进展(一)    【关键词】 中医药脑缺血再灌注损伤动物实验综述脑缺血再灌注损伤是指脑缺血一定时间恢复血液灌注后,脑组织细胞损伤反而进行性加重,也是引起多种脑血管病的重要病理生理机制。近年来,国内学者在中医药防治脑缺血再灌注损伤的动物实验研究方面做了大量工作,取得了一定成效。笔者现从以下几个方面就有关动物实验研究作一综述。1 中药1.1 复方刘氏等1采用非开颅可逆性大鼠大脑中动脉栓塞法造成大鼠脑缺血再灌注损伤,应用补阳还五汤小剂量(10 g/kg)或大剂量(20 g/kg)实验前连续灌胃给药7 d。结果表明,补阳还五汤可显

2、著减轻神经功能障碍及脑组织病理损伤,明显降低脑组织含水量和脑梗死面积。何氏等2用脑缺血再灌注损伤大鼠模型,以地黄饮子10 g/kg和20 g/kg实验前连续灌胃给药,发现地黄饮子可明显减轻大鼠脑缺血再灌注损伤后神经功能障碍、减轻脑水肿、减少缺血再灌注脑梗死范围和病理损害。表明地黄饮子对局灶性脑缺血再灌注损伤具有保护作用。张氏等3研究了涤痰汤对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤的神经保护作用及对肿瘤坏死因子(TNF-)表达的影响。对各组大鼠行神经功能缺损程度评分、脑组织含水量检测、病理学检查和免疫组化检测,发现涤痰汤可改善脑缺血再灌注损伤大鼠的神经功能缺损程度,减少脑组织含水量,减轻脑组织受损程度。其机

3、理可能是通过降低脑组织TNF-表达发挥神经保护作用。研究人员在对传统古方研究的同时,对一些经验方、时效方也进行了深入研究。杜氏等4通过对自制参芪脑保颗粒剂对脑缺血再灌注损伤的治疗作用观察,发现该制剂对脑缺血再灌注损伤有保护作用。常氏等5采用大脑双侧颈总动脉闭塞不完全性脑缺血再灌注模型,选用黄角汤及尼莫地平对模型进行实验,并设正常组及模型组,观察各组大鼠血浆超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)含量的变化。结果表明,模型组大鼠血浆MDA值显著高于正常组,SOD值显著低于正常组。黄角汤组SOD、MDA值有不同程度的恢复(P0.05,P0.01)。揭示黄角汤对大鼠脑缺血再灌注损伤的机制与纠正血浆

4、SOD/MDA平衡失调以及抗自由基损伤等有关。任氏等6观察脑脉通颗粒及尼莫地平对老龄大鼠脑缺血3 h及再灌注12、24、72 h各组细胞凋亡的影响。结果显示,脑脉通可以抑制脑缺血再灌注后神经细胞的凋亡,对神经元起保护作用。龚氏等7研究益肾降浊汤对大鼠缺血再灌注致脑损伤模型中脑组织内SOD活性、MDA含量以及Ca2+含量动态变化的影响,提示本汤剂能提高脑组织内SOD活性、降低缺血再灌注后脑组织MDA及Ca2+含量、保护神经元。1.2 单味药及提取物随着中药现代化技术的发展,对单味药及提取物的研究进一步深入、细化。杨氏等8应用大鼠局灶性脑缺血模型观察当归对脑缺血损伤的治疗作用及其机制。结果显示,当

5、归能抑制Bax蛋白的表达,减少脑缺血区细胞凋亡的发生,这是当归治疗大鼠局灶性脑缺血损伤的可能机制之一。张氏等9发现,再灌注应用丹参后较对照组白细胞介素1(IL-1)转化酶(ICE)免疫阳性细胞明显减少、神经细胞形态改善,说明丹参对ICE的表达有抑制作用,从而减少IL-1的脑缺血损伤作用。刘氏等10研究了三七总皂苷在大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤中的保护作用及其可能机制。三七总皂苷能降低再灌注期一氧化氮(NO)含量及白细胞介素1(IL-1)及TNF活性,可能是发挥保护神经元作用的一种途径。三七总皂苷含人参皂苷Rb1、人参皂苷Rg1和三七皂苷R1,三七总皂苷可以防止再灌流期间局部脑血流量的降低、抑制再

6、灌注蛋白激酶C的激活及钙超载、减少自由基和兴奋性氨基酸的释放,从而达到脑保护作用。曹氏等11观察了水蛭水煎醇提取液对大鼠缺血再灌注后脑细胞凋亡的保护作用,用流式细胞仪检测两组的脑细胞凋亡率。结果显示,缺血再灌注水蛭治疗组脑细胞凋亡率明显低于单纯缺血再灌注组(P0.05),且脑细胞凋亡的发生推迟；水蛭水煎醇提取液可降低缺血再灌注后脑细胞凋亡率,对缺血脑细胞起保护作用。尹氏等12研究了黄芪提取物(EA)对局灶性脑缺血再灌注损伤的保护作用机制。与模型组比较,EA能减少TNF-的表达、降低IL-1水平和减少细胞凋亡数。EA对大鼠局灶性脑缺血再灌注后脑组织中TNF-及IL-1的升高和神经元的凋亡有明显的

7、抑制作用。1.3 注射剂中药注射剂成分稳定、取效迅速,是中药的一个重要发展方向。陈氏等13通过线栓法建立大鼠脑缺血再灌注损伤模型,观察了参芎注射液对大脑中动脉闭塞大鼠梗死体积、行为学和组织病理学的影响。结果显示,参芎组再灌注24 h时的Longa评分较再灌注6 h时显著改善(P0.05)；川芎嗪组和参芎组的梗死体积较对照组显著缩小(P0.05)；川芎嗪组、参芎组细胞的损伤程度较对照组显著减轻(P0.05)；在电镜下,参芎组缺血边缘区的神经细胞超微结构改变轻于对照组,优于川芎嗪组。说明参芎注射液对脑缺血再灌注损伤有一定的保护作用,且优于单用川芎嗪。张氏等14采用沙土鼠双侧颈总动脉夹闭制作沙土鼠急

8、性全脑缺血模型,观察了干预性腹腔注射西药尼莫地平和中药醒脑静注射液对缺血再灌注急性期沙土鼠脑组织中MDA含量和SOD活力的影响。结果显示,尼莫地平和醒脑静注射液均能显著提高脑缺血再灌注后SOD活力和降低MDA含量,醒脑静注射液疗效和西药尼莫地平无显著差异,而醒脑静大、中、小剂量组之间有较显著的差异,且疗效随剂量的增加而提高。这说明,醒脑静注射液作为抗自由基损伤的中药和尼莫地平有相当的疗效。彭氏等15选用Wistar大鼠制作四血管阻断(4VO)脑缺血再灌注模型,以川芎嗪为对照,观察了灯盏花素注射液对大鼠脑缺血再灌注后脑含水量和脑组织钙含量的影响。结果显示,灯盏花素注射液能显著降低脑缺血再灌注后脑

9、含水量(P0.01)和脑组织钙含量(P0.01)。提示灯盏花素注射液对大鼠急性脑缺血再灌注损伤具有保护作用,主要是通过抑制钙内流实现的。有人采用断颅、静脉注射饱和氯化镁溶液的方法造成小鼠脑缺血模型,观察红花黄色素对小鼠脑缺血后存活时间的影响。采用结扎小鼠双侧颈总动脉的方法造成小鼠脑缺血再灌注模型,观察红花黄色素对脑组织SOD活性及MDA含量的影响。结果显示,小鼠静脉注射红花黄色素,能明显增加断颅后的张口次数及心脏骤停后的张口呼吸时间、显著延长常压耐缺氧时间和提高小鼠脑缺血再灌注后脑内SOD活性、明显降低脑内MDA含量。提示红花黄色素对小鼠脑缺血缺氧具有一定的保护作用16。2 针灸针灸治疗脑缺血

10、再灌注损伤临床疗效可靠,在动物实验方面也得到印证。郭氏等17利用大鼠大脑中动脉阻塞再灌注模型,采用透析技术及高效液相-荧光检测法测定纹状体细胞外兴奋性氨基酸含量。结果表明,缺血时谷氨酸和门冬氨酸含量明显升高,再灌注后逐渐下降；电针组上述两种氨基酸含量明显低于单纯缺血组,再灌注后亦如此。提示电针可抑制细胞外兴奋性氨基酸的过量堆积。霍氏等18研究发现,随着全脑缺血再灌注时间的延长,大鼠血清TNF-、白细胞介素-6(IL-6)呈动态增高的过程。结果显示,针刺可降低再灌注后升高的WBC数量和TNF-、IL-6水平。提示针刺可抑制大鼠脑缺血再灌注的炎症反应。罗氏等19采用线栓法制备局灶性脑缺血再灌注模型

11、,观察到电针可下调大脑皮质促凋亡基因Bax蛋白的表达,提示电针抗局灶性脑缺血及再灌注可能与此有关。张氏等20观察了头针对急性局灶性脑缺血再灌注损伤大鼠脑血流量和血液流变的影响。结果显示,模型大鼠患侧大脑皮层和海马区血流量显著减少,全血粘度增加；给予头针和体针治疗后,大脑皮层血流量均明显增加,全血粘度显著降低；且头针与体针比较,差异有显著性意义。说明头针治疗能增加大鼠脑缺血局部血流量,改善血液流变性,对急性局灶性脑缺血再灌注损伤大鼠有明显的治疗和预防作用。3 动物模型用动物的脑缺血及缺血再灌注模型来模拟人类脑血管疾病并对之进行研究,是当前神经科学的热门课题之一。局灶性脑缺血再灌注模型是目前较为常

12、用的动物模型。有关大鼠局灶性脑缺血再灌注模型已建立多种方法,其中线栓法具有操作方便、损伤小、成本低、重复性及稳定性较好等优点。因此,目前局灶性脑缺血再灌注模型选用线栓法为多。孙氏等21用栓线法制备大鼠局灶性脑缺血再灌注模型；用大脑中动脉电凝方法制备大鼠局灶性脑缺血模型,观察通络注射液对局灶性脑缺血再灌注及局灶性脑缺血大鼠的保护作用。赵氏等22采用大鼠大脑中动脉线栓法建立局灶性脑缺血再灌注模型,观察中风解毒方对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤的保护作用。另外,梁氏等23用改良的四血管结扎法造成大鼠脑缺血再灌注模型,观察脑组织Ca及Mg元素、脑组织含水量的变化及温通针法的干预效应。孙氏等24采用沙土鼠双

13、侧颈总动脉夹闭脑缺血再灌注模型,于再灌注后48 h取前脑皮质测定Na+-K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶、Mg2+-ATP酶、乳酸(LA)、NO和一氧化氮合酶(NOS)水平。崔氏等25应用颈动脉负压分流法制备的全脑缺血再灌注大鼠模型来证实丹参能上调bcl-2的表达。张氏等26利用脑缺血再灌注兔模型,观察到葛根素可显著减少缺血区脑组织的MDA、NO含量,提高SOD活性,降低NOS活性。结果提示,葛根素可减轻自由基反应对脑组织的损害,对缺血的脑组织具有保护与复苏效应。4 观察指标的选择近来研究发现,脑缺血再灌注后存在兴奋性氨基酸毒性、梗死周围去极化、炎症和细胞凋亡共4种主要的病理生理机制相互作用

14、、相互影响27。中医药治疗脑缺血再灌注损伤的动物实验研究观察指标的选择也多从兴奋性或抑制性氨基酸、半暗带、炎症细胞因子、细胞凋亡等客观指标着手。李氏28观察了大鼠大脑皮层及海马中兴奋性氨基酸和抑制性氨基酸的变化,以此阐明软脉胶囊对脑缺血再灌注大鼠的影响。王氏等29以TNF-、IL-1为指标,阐明脑络通在脑缺血各个时期都能有效降低外周血和脑组织中病理性升高的TNF-,亦可通过预防性给药,以有效降低脑缺血急性期外周血和脑组织中病理性升高的IL-1,抑制炎症反应。李氏等30用TUNEL法和免疫组化法分别检测脑缺血半暗带凋亡细胞和P53蛋白表达,以说明脑络欣通抗脑缺血再灌注的机制。熊氏等31以脑缺血损

15、伤后脑源性神经营养因子(BDNF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)为指标,认为二者的表达升高可抑制神经元凋亡。说明脑脉康可能通过促进BDNF和bFGF表达激活内源性神经保护机制,发挥其抗凋亡作用。另外,在选择以上指标的同时,血液组织生化、血液流变学、脑血流图、脑电生理等也应用较多。金氏等32以大鼠脑组织钙含量及血肌酸磷酸激酶脑型同功酶(CK-BB)的变化,探讨了参芪通络注射液对缺血再灌注损伤的影响。赵氏等33观测了脑组织中LA、乳酸脱氢酶(LDH)、过氧化脂质(LPO)、谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)、Na+-K+-ATP酶的变化,以探讨复方葛根素对脑缺血再灌注损伤的保护作用。李氏等34认为

16、,脑电图反映神经细胞依赖于ATP供能的生物电活动,用夹闭双侧颈总动脉复合控制性降压法造成全脑缺血再灌注损伤的研究结果表明,预先腹腔注射三七皂苷100 mg/kg能明显减轻60 min时脑组织形态学的损伤,降低水钠含量,减轻脑水肿,减少LDH和GPX的释放,促进脑电图恢复。因而提示,三七皂苷可改善再灌注后脑的能量代谢。5 展望目前,中医治疗脑缺血再灌注损伤的动物实验研究呈现一种良好的发展趋势,研究内容基本包括了中医科研的各个方面。从被试因素方面看,涵盖了中医治疗的多个领域,包括传统古方、经验方、单味药、有效成分提取物、针剂及各种针刺疗法等；从实验动物的选择看,大鼠、小鼠、沙土鼠、兔等被广泛采用；

17、脑缺血再灌注损伤的动物模型有全脑、局灶性模型,有4VO法、沙土鼠双侧颈总动脉夹闭法、线栓法等；实验的观测指标范围较广,从血液组织生化、血液流变学、免疫学、病理学等,到与脑缺血再灌注后的病理生理机制相关的兴奋性或抑制性氨基酸、半暗带、炎症细胞因子、细胞凋亡等。总之,中医治疗脑缺血再灌注损伤的动物实验研究达到了一个全面发展的水平,这对促进中医临床与现代实验技术相结合起到了很好的作用。但仍有许多问题有待解决。首先,在研究单味药、有效成分提取物的作用机理基础上,进一步分析复方的作用机制,可应用正交设计,多因素多水平考虑,阐明复方的主要成分和主要作用,这更符合传统中药“君、臣、佐、使”的理论；其次,统一

18、动物模型标准,建立病证结合的动物模型,对中医实验研究的发展具有重要作用；另外,实验的观测指标选择不宜低水平重复验证,应着眼先进的指标以及应用影像学动态观察等,以更进一步探讨中医治疗脑缺血再灌注损伤的机理。【参考文献】1 刘 超,吴基良.补阳还五汤对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤行为和病理改变的保护J.湖北中医杂志,2004,26(4)：1012.2 何 华,王桂香,钟士江,等.地黄饮子对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤的保护作用J.山东医药,2006,46(4)：2829.3 张 勇,刘 玲,王海燕,等.涤痰汤对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤的神经保护作用J.湖北中医杂志,2005,27(3)：68.4 杜

19、 卫,尹 岭,金香兰,等.“参芪脑保”治疗大鼠局灶性脑缺血及再灌注损伤实验研究J.卒中与神经疾病,2003,10(3)：147150.5 常学辉,张良芝.黄角汤对大鼠脑缺血再灌注损伤模型自由基影响的实验研究J.中医药学报,2003,31(1)：4849.6 任小巧,李建生,刘 轲,等.脑脉通对老龄大鼠脑缺血/再灌注细胞凋亡的影响J.中国老年学杂志,2005,25(9)：10671068.7 龚秀云,吴晓光,刘绍晨.益肾降浊汤对大鼠缺血再灌后脑组织SOD活性、MDA和Ca2+含量的影响J.陕西中医,2005,26(11)：12501251.8 杨静薇,田 峻,邹 凡,等.当归对大鼠局灶性缺血脑组

20、织细胞凋亡的作用J.武汉大学学报(医学版),2004,25(1)：46.9 张金涛,刘洁晓.丹参对鼠脑缺血再灌注后白细胞介素1转化酶表达的影响J.中华老年心脑血管病杂志,2000,2(2)：124127.10 刘建辉,冀凤云,王 婷,等.三七总皂苷对脑缺血再灌注损伤保护作用的实验研究J.中国临床神经科学,2002,10(1)：90.11 曹翠丽,马常升,马文领,等.中药水蛭对缺血/再灌注后脑细胞的抗凋亡作用J.河北医科大学学报,2000,21(4)：193195.12 尹艳艳,李卫平,王绍斌,等.黄芪提取物对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤后炎症因子及细胞凋亡的作用J.中国药理学通报,2005,21(12)：14861489.13 陈孝东,曹勇军