紫杉醇诱导人子宫内膜癌细胞增殖凋亡的实验研究

1、紫杉醇诱导人子宫内膜癌细胞增殖凋亡的实验研究 作者：甘泉，辛晓燕，刘玉，王德堂，郭会玲【关键词】 紫杉醇；子宫内膜肿瘤；,子宫内膜癌细胞珠；,增殖；,凋亡；,caspaseExperimental study on human endometrial adenocarcinoma cell apoptosis induced by taxol【Abstract】 AIM： To investigate the inhibition of proliferation and induction of apoptosis in vitro cultured human endometrial ad

2、enocarcinoma cell （HEC1B） by taxol. METHODS： Human endometrial adenocarcinoma HEC1B cells were cultured in vitro and treated with 2， 4， 8， 16， 20 nmolL taxol for 48 h. Cell apoptosis was observed by nuclear staining and fluorescence microscopy and intracellular calcium fluorescence pixel values of l

3、ive cells were detected by laser scanning confocal microscope. RESULTS: Through the blockage of caspase pathway with caspase3 inhibitor， taxol induced apoptosis was suppressed in endometrial carcinoma cells. CONCLUSION: Taxol inhibits the proliferation and induces the apoptosis of human endometrial

4、adenocarcinoma HEC1B cells.【Keywords】 taxol; endometrial neoplasms; HEC1B; proliferation; apoptosis; caspase3【摘要】 目的：探讨紫杉醇对体外培养的人子宫内膜癌细胞（HEC1B）凋亡的诱导作用. 方法：体外培养的HEC1B细胞，用终浓度2， 4， 8，16，20 nmol/L的紫杉醇作用48 h后，荧光染色检测细胞凋亡的发生情况、caspase3及其抑制剂紫杉醇在诱导细胞凋亡中的作用. 结果：共聚焦检测活细胞内钙离子的动态变化与Caspase3半胱氨酸蛋白酶中细胞凋亡，使HEC1B细胞在

5、活化过程中起了关键性的因素. 结论：HEC1B对紫杉醇具有药物敏感性，紫杉醇对HEC1B细胞的杀伤作用，是通过诱导细胞凋亡途径实现的.【关键词】 紫杉醇；子宫内膜肿瘤； 子宫内膜癌细胞珠； 增殖； 凋亡； caspase30引言子宫内膜癌（endometrial cancer，EC）是女性生殖器官三大恶性肿瘤之一，占女性生殖系统恶性肿瘤的20%30%1. 在治疗方面一直沿用传统的手术、手术加放疗或激素治疗. 因此，疗效及治愈率无提高. 化疗在恶性肿瘤的治疗中具有重要作用，在晚期肿瘤的治疗中尤为重要. 近年来，EC的发病率有明显上升趋势2，为了进一步提高子宫内膜的疗效，探索紫杉醇对子宫内膜癌在临

6、床上的应用提供理论及实验依据.紫杉醇(taxol，paclitaxe1)是一种新的抗微管药物. 紫杉醇作为抗癌药，对前列腺癌、乳腺癌等治疗已有广泛的应用. 新辅助化疗对子宫内膜癌的疗效不断肯定1，肿瘤的发生及发展是细胞无限制过度增殖的过程，化疗对肿瘤的作用应包括杀伤肿瘤和抑制肿瘤细胞分裂，增殖及促进调亡两方面. 本文探讨了新辅助化疗对HEC1B细胞调亡及增殖的影响，现报道如下.1材料和方法1.1材料1.1.1细胞株从美国American Type Culture Collection (ATCC)引进的HEC1B细胞株购自中科院上海生命科学研究院细胞所. 培养基：EMEM培养基（美国Gibco

7、公司）；血清：胎牛血清（杭州四季清）. 细胞培养：按照ATCC提供的培养传代方法6培养于含100 mL/L胎牛血清、1.0 mmol/L丙酮酸钠，1.0 mmol/L非必需氨基酸和1.5 g/L碳酸氢钠的EMEM培养液中，在37，50 mL/L CO2培养箱中培养.1.1.2药物与试剂抗体Taxol：北京四环医药科技股份有限公司产品; caspase3多克隆抗体（Santa Cruz Biotec，CA USA）.1.1.3细胞培养用品EMEM培养基：美国Gibco公司产品. 用时按说明用三蒸水配制，并加入100 mL/L非必需氨基酸和1.5 g/L碳酸氢钠的EMEM培养液用0.22 m滤器除

8、菌，4冰箱保存. 胎牛血清：杭州四季青生物工程材料研究所生产. 胰蛋白酶：美国Gibco公司产品. 用无血清培养液配成2.5 g/L浓度，0.22 m滤器除菌，4冰箱保存. 40 cm培养皿：中间有9 mm小孔. Costar公司产品. (以上试剂均购于博微生物科技有限公司).1.2方法1.2.1子宫内膜癌细胞株HEC1BGIBCO EMEM培养液中(含100 mL/L胎牛血清、100 m/mL青霉素，100 m/mL链霉素，丙酮酸钠1.0 mmol/L,非必需1.0 mmol/L氨基酸和1.2 g/L碳酸氢钠, pH 7.07.2值)，于37, 50 mL/L CO2培养箱中培养，每48 h

9、换液一次，细胞呈单层贴壁生长，2.5 g/L胰蛋白酶消化传代. 选用对数生长期细胞进行实验5-6.1.2.2细胞增殖活力检测将贴壁细胞消化传代后计数，调整细胞浓度为1104/mL，接种于24孔培养板中，37，50 mL/L CO2及饱和湿度条件下培养. 实验时分为2，4，8，16，20 nmol/L 5个药物浓度组及对照组，每组5个孔，细胞接种后24 h加药，分别于加药后12，24，48，72 h测定各孔的吸光度值（A值）. 测定前弃去培养孔上清后，每孔加500 L新配制的5 g/L MTT，37继续孵育4 h，弃上清加150 L DMSO溶解，混匀后用DG3022型酶标仪，在490 nm波长

10、处测定细胞的光吸收值，并按肿瘤细胞抑制率(%)=(1-实验孔A值/对照孔A值)1005,7.1.2.3采用细胞计数法取细胞生长期的细胞用2.5 g/L的胰酶消化制成单细胞悬液，调整细胞密度悬浮于新鲜含100 mL/L胎牛血清EMEM培养液接种细胞1103个细胞，40 cm点孔直径为9 mm的6个培养皿里. 观察细胞贴壁后，每个培养皿紫杉醇的浓度分别为2, 4, 8, 16, 20 nmol/L，作用48 h后加入caspase3抗体(按照Santa Cruz说明书11001500)，观察细胞Hoechet染色，在激光共聚焦扫描(仪器的型号 MPC1024,美国BTORAD公司)，分析软件（Ti

11、meCouRSE Lasersharp）检测子宫内膜癌细胞凋亡和钙离子的浓度变化5,8-9.百事通 2结果2.1紫杉醇对HEC1B细胞，在接种1 d，HEC1B细胞生长稳定，2 d细胞开始生长，并进入对数生长期，根据每日所测的OD值绘制生长曲线在对数生长期内正常子宫内膜癌OD值低于1.5（P0.05）. 细胞群体倍增时间为细胞生长曲线(图1).2.2紫杉醇对HEC1B细胞群体倍增时间为32.7 h，从图2可见对照组在培养时间内生长呈上升趋势. 处理组在13 d内HEC1B细胞仍以增殖为主，在此期间HEC1B细胞的群体倍增时间延长为48 h，但因药物对其生长的抑制作用，与对照组相比起增殖趋势明显

12、减弱；在药物作用34 d，HEC1B细胞的增殖与药物抑制作用达到平衡，从生长曲线表现为平直的线段，HEC1B细胞生长曲线表现为下降趋势，表明该药物对癌细胞的增殖抑制作用具有明显的持续效应（数据处理使用SPSS 11.0软件对数据进行处理，采用Wilcoxon秩和检验分析数椐，P0.05为有统计学意义.表1子宫内膜癌细胞在不同浓度作用下的细胞存活率（略）2.3紫杉醇诱导HEC1B细胞凋亡，观察活性细胞内钙离子的动态变化紫杉醇与Caspase3诱导细胞凋亡，使HEC1B细胞在活化过程中起了关键性的因素(图3). HEC1B细胞(对照A)，应用不同浓度的Taxol 2， 4， 8， 16及20 nm

13、o/L在共聚焦下观察，作用48 h后HEC1B细胞见较多凋亡细胞小体(图3B，C). AO/EB荧光双染亦见到典型的呈绿色，固缩的早期凋亡细胞以及圆粒固缩的晚期凋亡细胞(图3D，E)，细胞凋亡且呈时间依赖性(图3F). 8 nmol/L结果证明Taxel在体外培养的HEC1B细胞诱导凋亡的能力及耐药性等奠定基础7. 图像经数字化输入计算机分析三维图函f（x，y）进行分析，以获得所需要的数椐.3讨论紫杉醇是一种新的抗微管药物1-2， Taxol作为抗癌药，对前列腺癌、卵巢癌、乳腺癌等治疗已有广泛的应用. 目前临床上已应用于子宫内膜癌. Taxol抗肿瘤药是HEC1B细胞凋亡的诱导剂，其细胞毒效应

14、可能主要由于启动肿瘤细胞程序化死亡的通路. 共聚焦显微镜下扫描HEC1B细胞在48 h形态变化：胞核变圆，胞浆透亮，细胞成团，不同浓度紫杉醇作用48 h形态变化：HEC1B细胞明显的变弱，大量细胞产生了凋亡. 由于它的高灵敏度和能观察空间结构的独特优点，从而对被检物体样品从停留到表面单层、静态平面的观察进展到立体、断层扫描、动态全面的观察，在生命科学研究中得到迅速应用. 其同时具备了普通显微镜和荧光显微镜的功能，并配有现代电子摄像笔微机数字图像分析系统，可将细胞变成“微小试管”，结晶和特异的荧光抗体进行一系列亚细胞水平的结构和功能的研究，是目前先进的细胞形态、功能研究的手段5，9-10. 还能

15、做到侧定细胞内骨架蛋白，细胞内的浓度，膜电位，过氧化物，细胞间通讯等，还可进行细胞手术，细胞筛选及定量共聚焦三维图像分析，为活细胞功能的研究开辟了新的途径6.Caspase3是最受重视的调控细胞凋亡的基因家族；caspase3的下调是紫杉醇诱导人子宫内膜癌细胞发生凋亡的重要条件. Taxol目前主要用于治疗对常规化疗无效的卵巢癌和乳腺癌，其作用是与微管结合使微管稳定性增强，抑制微管解聚，使细胞阻滞于分裂期，并促进细胞凋亡11. 在白血病及卵巢癌细胞的体外实验中， 紫杉醇的细胞毒作用与其诱发细胞凋亡有关12. 紫杉醇用于人子宫内膜癌治疗，对各种进展期的人子宫内膜癌有缓解作用，在人子宫内膜癌的有效

16、率最高可达80%1. 本文结果发现紫杉醇能抑制HEC1B细胞生长，诱导细胞凋亡，且这些作用具有明显的剂量效应与时间效应. 根据体外细胞毒性实验，该药在一定剂量范围内（预实验21000 nmol/L，实验210 nmol/L）呈明显的浓度/时间生长抑制依赖性. 在本实验中，220 nmol/L的Taxol作用于HEC1B细胞12 h，未显示出明显的增殖作用，随作用时间延长，在2,8,20 nmol/L各浓度点的增殖抑制作用明显增强，且随浓度增加，抑制率明显增强，表明该药物对HEC1B细胞的生长抑制作用呈浓度及时间依赖性. 上述结果对临床用药提供了借鉴：即在维持一定的血药浓度的情况下，应延长药物作

17、用时间以加强其作用. 我们在预实验中观察到药物对细胞的增殖抑制作用仅在一定的范围内呈线性关系（120 nmol/L)，当药物浓度超过10 nmol/L后，其抑制作用的增强远不及浓度上的增加，再考虑其临床应用的毒副作用，故在临床应用上探索其最佳浓度至关重要.紫杉醇作为新一代化疗药物，其开发和应用已大大提高了卵巢癌的临床疗效. 紫杉醇在EC治疗中的应用尚属探索阶段，紫杉醇对体外培养的人子宫内膜癌细胞诱导凋亡的能力及对耐药细胞系的抗肿瘤潜力，表明它有可能成为一种抗子宫内膜癌标准方案的常规用药. 本实验旨在探讨紫杉醇诱导人子宫内膜癌细胞凋亡作用，为该药的临床使用提供了理论及实验依据，同时亦为进一步研究

18、HEC1B凋亡提供了极好的模型.【参考文献】1Lane DP. A death in life of P53J. Nature, 1993,362;786-788.2Pisano C,Greggi S,Tambaro R,et al. Activity of chemotherapy in mucinous epithelial ovarian cancer: A retrospective studyJ. Anticancer Res, 2005,25(5):3501-3505.3Kuramoto H. Studies of the growth and cytogenetic proper

19、ties of human endometrial adenocarcinoma in culture and its development into an established lineJ. Acta Obstet Gynaecol Jpn，1972,19(1):47-58.4Fogh J,Wright WC,Loveless JD. Absence of HeLa cell contamination in 169 cell lines derived from human tumorsJ. J Natl Cancer Inst, 1977,58(2):209-214.5司徒镇强，吴军正. 细胞培养M. 西安：图书出版公司，1996: 134-135.6李玉松，张远强. 组织病理学技术M. 3版. 北京：人民卫生出版社，2000:870.7李昱，米粲. Genistein抑制人卵巢癌细胞系SKOV3增殖和诱导凋亡发生的研究J. 癌症，2003，22(6)：586-591.8Tsujimoto Y, Cossman J, Jaffe Eetal. Involvent of the Bcl2 gene in human follicu