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文档简介
1、实验4氯化三苯基四氮唾(TTC)法测定才艮系活力重要指标,可以衡量根系吸收水分或矿质元素的能力大小,甚至可以反映地上部分的营养状况以及产量水平。学会利用TTC法测定根系活力。一、原理氯化三苯基四氮喳(TTC)溶于水中成为无色溶液,但还原后即生成红色而不溶于水的三苯基甲替(TTF),如下式:CJL-C/N N CJL I 、N=而一C6H5TTC (天色)HI/NNC6H$C,HaC+HC1、N=NC6HsTTF(红色)生成的TTF比较稳定,不会被空气中的氧自动氧化,所以TTC被广泛地用作酶试验的氢受体,植物根所引起的TTC还原,可因加入琥珀酸、延胡索酸、苹果酸得到增强,而被丙二酸、碘乙酸所抑制
2、。所以TTC还原量能表示脱氢酶活性,并作为根系活力的指标。二、材料、设备仪器及试剂(一)材料:玉米等植物根系。(二)仪器设备:分光光度计;天平;恒温箱1台;研钵1套;漏斗;量筒;移液管;试管;刻度试管10ml;试管架;药勺;石英砂适量;烧杯;小培养皿;洗瓶。二、材料、设备仪器及试剂(三)试剂:1.乙酸乙酯2.次硫酸钠(Na2s2O4,强还原剂,俗称保险粉)3.lmg/ml的TTC溶液:4.磷酸缓冲液(66mmol/L,pH7).5.lmol/L硫酸:6.0.4moi/L琥珀酸:三、实验步骤1 .定性测定(教师做演示实验)(1)配置反应液把1%TTC溶液,0.4moL/L琥珀酸钠和磷酸缓冲液按1
3、:5:4比例混合。(2)把根仔细洗净,把地上部分从茎基切除,将根放入三角瓶中,倒入反应液,以浸没根为度,置37C左右暗处放lh,以观察着色情况,新根尖端几毫米以及细侧根都明显地变成红色,表明该处有脱氢酶存在.三、实验步骤2 .定量测定(1)TTC标准曲线的制作tA. 111111 HU vx fci - j i wi 11 2P TIMa T 9 /JUZ、 .(黄豆大小)保险粉摇匀,加入乙酸乙酯40mL左右 剧烈震荡摩保脸球充分溶解,用乙酸乙酯定容至刻居 即成TTF麟菠(20阳/mL )。取1mg/mL的TTC2mL于100mL容量瓶中,加入2勺按下表制作TTF标准曲线。以空白作参比,在48
4、5nm波长下测定光密度,绘制标准曲线。试怪编号123456空白样品TTF含量(ug)02040608010011卜(ml)012345Jc乙酸乙酯(ml)498765I0r0OD(485nm)三、实验步骤(2).样品的提取及测定样品提取:称取根样品0.5g,放入小培养皿,加入0.4%TTC溶液和磷酸缓冲液的等量混合液10ml,把根充分浸没在溶液内,在37*C下暗处保温lh,此后加入Imo1/L硫酸2ml,以停止反应。(与此同时做一空白实验,先加硫酸,再加根样品,其他操作同上)。根系活力测定:把根取出,吸干水分后与乙酸乙酉旨341nl和少量石英砂一起磨碎,以提出TTF。把红色提出液过滤后移入10nli刻度试管,用少量乙酸乙酯把残渣洗涤二至三次,皆移入试管,最后加乙酸乙酯使总量为10ml,用分光光度计在485nm下比色,以空白作参比读出光密度,查标准曲线,求出四氮哇还原量。人结果计算四氮喳还原强度:mg/g(根鲜重)小=四氮嗖还原量(mg)/根重(g)X时间(h)五注意事项
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