DNA指纹的遗传分析实验报告

1、DN传旨纹的遗传分析【实验原理】“DNA 指纹”是指可以利用 DNA 差异来进行与传统指纹分析相似的身份识别。 DNA 指纹是以 DNA 的多态性为基础， 而卫星 DNA 的发现则是其最重要的奠基石。卫星 DNA 是由一短序列(即重复单位或核心序列)多次重复而成，因此也有人称其为可变数目串联重复序列(variablenumbersoftandemreprat,VNTR)，在人类基因组中存在多种由不同重复单位组成的卫星 DNA,重复单位的碱基序列在不同个体中具有高度的保守性，而卫星 DNA 的多态性则来源于重复单位的重复次数不同，并形成了众多的等位基因。列如，人类 1 号染色体上的 VNTRD1

2、S80,核心序列由16 个核甘酸组成，拷贝数在 1441 个之间，已知 29 种不同的等位基因。1984 年 Jefferys 等人首次将分离的人源小卫星 DNA 用作基因探针，同人类核DNA 的酶切片段杂交，产生了由 10 多条带组成的杂交图谱，不同个体杂交图谱上带的位置就像指纹一样因人而异，因而 Jefferys 等人称之为 DNA 指纹图谱。产生DNA 指纹图谱的过程叫做 DNA 指纹分析，目前包括 PCR、RFLP(限制性内切酶酶切片段长度多态性)和 RAPD(随机扩增多态性 DNA)等方法。DNA 指纹图谱的基本特点：(1)多位点性：基因组中某些位点的小卫星重复单位含有相同或相似的核

3、心序列。在一定的杂交条件下，一个小卫星探针可以同时与十几个甚至几十个小卫星位点上的等位基因杂交。(2)高变异性：DNA 指纹图谱反应的是多个位点上的等位基因的特征，具有很高的变异性。发现两个无血缘关系个体具有相同 DNA 指纹图谱的概率仅为 5X10-19,因此，除了同卵双胞胎，几乎不可能有两个人的 DNA 指纹图谱完全相同。(3)稳定的遗传性：DNA 指纹图谱中的谱带能够稳定遗传，杂合带遵守孟德尔遗传规律。子代 DNA 指纹图谱中产生与双亲都不同的新带的概率(基因突变)仅在0.0010.004 之间。DNA 指纹图谱还具有体细胞稳定性，即用同一个体的不同组织如血液、肌肉、毛发、精液等的 DN

4、A 作出的 DNA 指纹图谱是一致的。由于 DNA 指纹图谱具有这些显著的特征， 他已经成为最具吸引力的遗传标记。Jeffreys 是第一个意识到 DNA 指纹可以建立个人身份识别系统的人， 并且首先将其用于亲子鉴定，移民审查和凶杀侦破。1989 年该技术获美国国会批准作为正式法庭物证手段。止匕外，它还被用于医生诊断及寻找与疾病连锁的遗传标记，探明动物种群的起源及进化过程，在作物的基因定位及育种上也有非常广泛的应用。【实验材料、仪器及试剂】1 .人类口腔细胞。2 .仪器：微量移液器，小型离心机，恒温水浴锅，漩涡振荡器，PCR仪，电泳仪，电泳槽，透射式紫外分析仪(或凝胶成像仪)。枪头，1.5mL

5、,0.2mL 离心管，棉签，使用前均需 121c 高温灭菌3 .试剂：NaCl,琼脂糖，澳化乙锭，Na2-EDTA,SDS,Tris,ProteinaseK,冰醋酸，澳酚蓝，二甲苯月青蓝，蔗糖，甘油，DNA 相对分子质量标记，Chelex100 树脂(Bio-Rad),PCRpre-mix(TaKaRa4 .溶液配制：(1)5%Chelex 树脂：Chelex100(Bio-Rad)0.5g、50mmol/LTris-HCl10mL、用4mol/LNaOH 调 pH 至 11,室温可保存 3 个月，使用前充分混匀。(2)2.0%琼脂糖凝胶：称 2.0g 琼脂糖放入 250ml 三角烧瓶，加入

6、1XTAE 溶液 100mL 微波炉加热溶解，冷却至 60c 左右加入 1g/mL 澳化乙锭(EB),缓慢混匀后倒胶板。(3)澳化乙锭(EB):用无菌水配制 5mg/mL 储藏液，工作浓度 1 仙 g/mL。注意；澳化乙锭为诱变剂，有致癌作用。配制、稀释和染色时必须戴手套。(4)0.5mol/LEDTA(pH8.0):Na2-EDTA18.61g、NaOH2g,蒸储水定容至100mL,室温保存。(5)10 xTAE 电泳缓冲液：Tris48.4g、冰醋酸 11.42mL、0.5mol/LEDTA(pH8.0)20mL,蒸储水定容至 1000mL,室温保存。(6)10 x 上样缓冲液(Loadi

7、ngdye):澳酚蓝 0.25g、二甲苯月青蓝 0.25g蔗糖50.00g(或甘油 50mL),用 60mL 无菌水(用甘油 50mL 时，49mL)溶解上述试剂，再定至 100mL，室温保存即可。(7)10%SDS:SDS10g 用无菌水溶解后(可加热)，定容至 100mL,室温保存。(8)蛋白酶 K 溶液：20mg/mL 蛋白酶 K 水溶液 5mL、10%SDS1mL、无菌水94mL,冰箱冷藏。(8)无菌水：蒸储水或去离子水，高温灭菌。(10) 1mol/LTris-HCl(pH8.0):将 12.1gTris 溶解在 80mL 蒸储水中， 加盐酸调节pH 至 8.0,加蒸储水定容至 10

8、0mL。5.引物Primer1:5-GAAACTGGCCTCCAAACACTGCCCGCCG-3Primer2:5-GTCTTGTTGGAGATGCACGTGCCCCTTGC-3【实验操作】1. 收集 DNA 样本(1)先漱口，然后用灭菌的牙签充分擦刮口腔内壁，将该牙签放入 1.5mL 装有1mL 无菌水的小离心管中，使粘附在牙签表面的口腔细胞悬浮其中(以能看到悬浮物为好)。震荡 10s,10000r/min 离心 1min。(2)从离心管中吸出 970 仙 L 无菌水，注意不要吸到沉淀。(3)向离心管中加入 200 仙 L5%Chelex100,震荡 10s 混匀。(4)加入 2L 蛋白酶

9、K,混匀，56c 保温 5min。(5)剧烈震荡 10s 沸水浴 8min。(6)10000r/min 离心 3min,离心管中溶液分成上下两层：下层为 Chelex100和细胞碎片的沉淀，上层溶液含 DNA 分子，可以直接用作 PCR 模板。此 DNA 样本可在 4c 或-20C 保存，必要时可在使用前再次加热并离心，使管内物质分层。2. PCR 扩增 D1S80 等位基因(1)每个人用记号笔在 0.2mLPCR 管上做好标记。(2)准备冰盒，开始反应前尽量使 PCR 管保持在冰上。(3)依次加入下列成分，配制 25NL 体系的 PCR 反应溶液：PCRpre-mix12.5LL引物 11L

10、L引物 21LL口腔细胞 DNA 样本 10NL加无菌水至总体积 25uL。(4)轻弹管壁，混匀溶液。(5)离心 10s,使管壁上的液滴落下。(6)按下列程序开始 PCR 反应：94C,1min94C,15s68C,15s72C,15s30 个循环72C,10min4c 暂时放置，直至开始电泳3. PCR 扩增产物鉴定与 D1S80 等位基因分析(1)准备冰盒。(2)取出完成反应的 PCR 管，放冰上待用。(3)取出 10pLD1S80PCR 扩增产物放入 0.5mL 离心管。(4)加入 2 山上样缓冲液。(5)轻弹管壁混匀，再瞬时离心，使管壁上的液滴下落。(6)用 1kAE 电泳缓冲液配制

11、2.0%琼脂糖电泳凝胶。(7)60V 预电泳 12min。(8)在凝胶上选一孔加 6pLDNA 相对分子质量标记(DNA100bpLadder)(9)每人将刚刚准备好的 10pLD1S80PCR 扩增产物+2uL 的上样缓冲液各自加入凝胶样孔，注意不要有气泡进入。(10)60V 电泳 3040min。(11)取出凝胶用清水漂洗 510min。(12)凝胶用紫外分析仪观察，记录每个个体的 DNA 条带数目及其位置。4.观察和分析 D1S80 多态性。四、结果与分析本次实验所选择的方法是 D1S80 指纹图谱分析的常用方法。 人群中 D1S80 座位的杂合率约为 86%。从理论上讲，可能存在 43

12、5 种不同的等位基因组合。利用D1S80 座位两侧序列设计的引物(Kasaietal,1990),通过 PCR 反应，很容易确定特定个体的 D1S80 等位基因构成，纯合体只有一条 DNA 带，而杂合体有两条不同的DNA 带。1 .将小组的电泳结果拍照，附于下：2 .根据电泳结果，填写 D1S80 等位基因分析结果DlS80DNA 指纹特征小组成员大小/bp长度（重复数）杂合/纯和小组成员 A60029纯和小组成员 B150022纯和小组成员 C55025纯和注：因为重复数为 l 的 DIS80PCR 产物长 161bp,所以，重复数每增加一个,序列增加长度 16bp。据此可以催算：重复数=1

13、+（PCR 产物大小161）/16【讨论】1.本人的条带是第二条，不是很清楚，原因可能是样品浓度过稀，也就是一开始刮取的口腔内壁细胞太少了，水浴时又洒了少许，以至于后来 PCR 也没扩增出。还有一个可能的原因就是 DNA 的纯度不够，带有太多的杂质，从而跑电泳时 DNA 被杂质阻滞，因此效果不太好。2.跑出的条带上的 DNA 是人源小卫星 DNADIS80 的 PCRT 物。它是一种具有多位点、高变异、稳定遗传的 DNA 分子，而且每个人的 DIS80DNA 中重复序列的数目是不同的，所以它比传统的指纹分析更方便、快捷、准确。3.实验过程中，有两次水浴的步骤，一定要注意将离心管的盖子盖紧，由于

14、离心管是灭菌的，所以如果盖子盖的不紧，就会从沸水浴中炸开，自己就是这种情况，导致条带不清楚。思考题：1,用 PCR、RFLP、RAPD 方法产生 DNA 指纹图谱各有哪些利弊？答：PCR 作为现代生物学研究的一种常用方法，具有特异性高、灵敏度高、简便节约、经济的优点；但是它最大的缺点是对不同的片段条件不同，所以很难掌握，而且必须要得到目的基因片段。RFLP 这种方法比较稳定，但 RFLP 实验操作繁琐，检测时间长，成本较贵，不太适合大规模的分子育种。PAPD 相对 RFLP 来说，更加省时省力，不需要进行 DNA 多种酶切、转膜以及探针的制备等多个步骤，但是它不能用来测定多态性是由父本还是母本产生的，而